朱治同 李澤平 董立明

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨一科，貴州 遵義 563000

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs)是目前多種慢性疾病及自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、慢阻肺等的首選藥，數(shù)據(jù)[1-2]顯示，全球約1%～2%患者長(zhǎng)期接受GCs治療，大劑量或長(zhǎng)期低劑量使用GCs易導(dǎo)致繼發(fā)性骨質(zhì)疏松等嚴(yán)重副作用。雖然骨質(zhì)疏松癥已得到臨床上的廣泛認(rèn)知，但對(duì)其干預(yù)性治療措施仍需做深入研究。研究[3]表明，GCs促使成骨活動(dòng)受抑制是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的原因之一。培哚普利屬于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)，可降低心臟負(fù)荷，延緩心血管重塑等，研究[4-5]證實(shí)，其可以增加骨量或骨密度，治療骨質(zhì)疏松及降低骨折風(fēng)險(xiǎn)。正常生理狀態(tài)下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)可分化為成骨細(xì)胞，使得成骨與骨吸收代謝處于穩(wěn)態(tài)[6]。但目前有關(guān)培哚普利治療骨質(zhì)疏松癥的具體作用機(jī)制研究鮮有報(bào)道，因此本研究擬探討培哚普利對(duì)GCs誘導(dǎo)的MSCs凋亡及成骨分化的影響，并分析相關(guān)機(jī)制，以期為GCs誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防及治療提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞株MSCs(貨號(hào)BNCC100385)購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；DMEM-F12培養(yǎng)基(貨號(hào)GNM-12500-S)、間充質(zhì)干細(xì)胞-成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(貨號(hào)7531)購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司；3-2(4,5-二甲基噻唑-2)-2-四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)(批號(hào)：1120-02-1)均購(gòu)自美國(guó)sigma公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(貨號(hào)556547)均購(gòu)自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RP1105-100 T)、AceQqPCR SYBR Green Mix(ALH185)、Trizol Reagent核酸分離試劑(YT526)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗人半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3(cysteiny aspartate specific protease3，cleaved Caspase-3，貨號(hào)AF488))、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2，貨號(hào)BYFG-70R-36053)、兔抗人Bcl-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X Protein，Bax，貨號(hào)FNab00811)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP，貨號(hào)ab83259)、Ⅰ型膠原(type Ⅰcollagen，CollagenⅠ，貨號(hào)BYFG-70R-1081)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN，貨號(hào)BYFG-70R-9882)、Notch通路受體(Jagged 1，JAG1，貨號(hào)BM4565)、(Jagged 2，JAG2，貨號(hào)BM4565)、跨膜受體蛋白1(Notch1，貨號(hào)BM4565)、跨膜受體蛋白2(Notch2，貨號(hào)BYFG-70R-30786)、下游靶基因(hairy and enhancer of split1，Hes1，貨號(hào)BM4565)、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(貨號(hào)GB23303)抗體均購(gòu)自東莞市潤(rùn)博生物科技有限公司；CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)NHD DYE1738)購(gòu)自日本sanyo公司；Elx800酶標(biāo)儀(型號(hào)HSG9832)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；熒光定量PCR儀(型號(hào)C1000)購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：復(fù)蘇MSCs細(xì)胞，培養(yǎng)于含10 %滅活FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中，于37 ℃、5 % CO2、95 % O2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞分組及處理：取1.2.1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MSCs細(xì)胞重懸并接種于24孔板(2.5×105個(gè)/孔)。將細(xì)胞分為5組(均設(shè)6個(gè)復(fù)孔)：(1)空白對(duì)照組：只含MSCs細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基處理48 h；(2)DEX組：加入含106mol/L DEX溶液[7]的無(wú)血清培養(yǎng)基處理48 h；(3)培哚普利低、中、高劑量組：加入含106mol/L DEX溶液的無(wú)血清培養(yǎng)基，分別與含0.01、0.1、1.0 μmol/L培哚普利[8]溶液共同孵育，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3MTT法檢測(cè)MSCs增殖能力：取1.2.2各組MSCs重懸并接種至24孔板(2.5×105個(gè)/孔)，各孔加20 μL MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；各孔加DMSO(150 μL)振蕩5 min，混勻。570 nm處測(cè)定各孔細(xì)胞光密度(optic density，OD)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，取平均值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：取1.2.2各組MSCs重懸并接種至24孔板(2.5×105個(gè)/孔)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗細(xì)胞，離心棄上清后用0.2 mL PBS將細(xì)胞沉淀混勻，70 %的冷乙醇4 ℃固定24 h以上。離心棄上清，PBS清洗，加5 μL PI+5 μL AnnexinV‐FITC混勻，4 ℃避光染色30 min、稀釋，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5成骨誘導(dǎo)分化：取1.2.2各組MSCs重懸并接種至24孔板(2.5×105個(gè)/孔)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)細(xì)胞約80 %左右融合時(shí)更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含50 μmol/L左旋抗壞血酸+10 mmol/L β甘油磷酸鹽+DMEM-F12培養(yǎng)基)，15 d后進(jìn)行茜素紅染色，顯微鏡下觀察成骨分化效果。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)凋亡、成骨分化及Notch通路相關(guān)基因水平：TRIzol法提取1.2.2各組培養(yǎng)48 h的MSCs總RNA并測(cè)定濃度。以RNA為模板、PrimeScript RT reagent試劑盒說(shuō)明書(shū)為操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。體系20 μL：ULtraSYBR mixture(10 μL)、模板cDNA(2.0 μL)、上下游引物(各2.0 μL)、去離子純化水(4.0 μL)；條件(40個(gè)循環(huán))：93 ℃ 30 s、93 ℃ 5 s、65 ℃ 30 s。引物序列詳見(jiàn)表1，由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各基因mRNA水平相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.7蛋白免疫印跡法檢測(cè)凋亡、成骨分化相關(guān)蛋白及Notch通路蛋白表達(dá)情況：收集1.2.2各組MSCs，加入RIPA裂解液提取總蛋白并檢測(cè)濃度及純度，取20 μg蛋白上樣于12 % SDS-PAGE進(jìn)行分離，將各蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，放入脫脂奶粉(5 %)溶液室溫封閉2 h，分別加入一抗凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3)、成骨分化相關(guān)蛋白(ALP、CollagenⅠ、OPN)、Notch通路蛋白(JAG1、JAG2、Notch1、Notch2、Hes1、Hey1)，內(nèi)參β-actin，稀釋比均為(1∶500)作為一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST清洗，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，顯影、定影、成像，半定量分析各蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 培哚普利對(duì)MSCs增殖的影響

與空白對(duì)照組[(12.33±1.85)%]比較，DEX組[(43.87±6.58)%]MSCs增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與DEX組比較，培哚普利低[(35.37±5.31)%]、中[(25.62±3.85)%]、高[(17.96±2.69)%]劑量組MSCs增殖抑制率顯著降低(P<0.05)，呈劑量依賴性。

2.2 培哚普利對(duì)MSCs凋亡的影響

與空白對(duì)照組[(15.27±2.33)%]比較，DEX組[(40.22±6.03)%]MSCs凋亡率顯著升高(P<0.05)；與DEX組比較，培哚普利低[(33.40±5.01)%]、中[(25.05±3.75)%]、高[(19.12±2.87)%]劑量組MSCs凋亡率顯著均顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。詳見(jiàn)圖1。

2.3 培哚普利對(duì)MSCs成骨分化的影響

茜素紅染色結(jié)果顯示，MSCs可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，部分細(xì)胞呈聚集態(tài)生長(zhǎng)，形成鈣結(jié)節(jié)。與空白對(duì)照組比較，DEX組深紅色鈣化結(jié)節(jié)顯著減少；與DEX組比較，培哚普利低、中、高劑量組深紅色鈣化結(jié)節(jié)顯著增多。詳見(jiàn)圖2。

2.4 培哚普利對(duì)MSCs成骨分化相關(guān)基因及其蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，DEX組MSCs中ALP、CollagenⅠ、OPN mRNA及其蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與DEX組比較，培哚普利低、中、高劑量組MSCs中ALP、CollagenⅠ、OPN mRNA及其蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，呈劑量依賴性。詳見(jiàn)圖3、表2、表3。

圖1 培哚普利對(duì)MSCs凋亡的影響Fig.1 Effect of Perindopril on MSCs apoptosis

圖2 培哚普利對(duì)MSCs成骨分化的影響(比例尺：100 μm)Fig.2 Effects of Perindopril on osteogenic differentiation of MSCs (scale: 100 μm)

圖3 培哚普利對(duì)MSCs成骨分化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 The effect of Perindopril on the expression of Osteogenic differentiation-related proteins in MSCs

2.5 培哚普利對(duì)MSCs凋亡相關(guān)基因及其蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，DEX組MSCs Bcl-2、cleaved-caspase-3 mRNA及其蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與DEX組比較，培哚普利低、中、高劑量組MSCs Bcl-2、cleaved-caspase-3 mRNA及其蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，呈劑量依賴性。詳見(jiàn)圖4及表4和表5。

表2 成骨分化相關(guān)基因表達(dá)情況比較

表3 成骨分化相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

圖4 培哚普利對(duì)MSCs Bcl-2、cleaved-caspase-3、Bax表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Puli on expression of Bcl-2, cleaved-caspase-3 and Bax in MSCs cells

表4 培哚普利對(duì)MSCs Bcl-2、cleaved-caspase-3、Bax mRNA表達(dá)的影響

表5 培哚普利對(duì)MSCs Bcl-2、cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達(dá)的影響

2.6培哚普利對(duì)MSCs JAG1/Notch通路相關(guān)基因及其蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，DEX組MSCs JAG1、JAG2、Notch1、Notch2、Hes1、Hey1 mRNA及其蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與DEX組比較，培哚普利低、中、高劑量組MSCs JAG1、JAG2、Notch1、Notch2、Hes1、Hey1 mRNA及其蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。詳見(jiàn)圖5、表6、表7。

圖5 培哚普利對(duì)MSCs JAG1/Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Puli on the expression of jag1notch pathway related proteins in MSCs

表6 培哚普利對(duì)MSCs JAG1/Notch通路相關(guān)基因表達(dá)的影響Table 6 Effects of Puli on the expression of JAG1/Notch related genes in

3 討論

正常狀態(tài)下，成骨與骨吸收處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)骨代謝失衡時(shí)則導(dǎo)致骨吸收大于骨形成，成骨受抑制[9]。MSCs是一種具有分化潛能的細(xì)胞，在不同誘導(dǎo)條件下能夠分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞等，研究[10]表明，其分化為成骨細(xì)胞的能力減弱是骨質(zhì)疏松的發(fā)病原因之一。因此通過(guò)促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化以防治骨質(zhì)疏松癥仍是臨床研究者研究熱點(diǎn)之一。培哚普利是ACEI類抗高血壓藥物，研究[11]證實(shí)，其能夠預(yù)防骨質(zhì)中骨鈣、骨磷及骨鎂等重要成分的丟失，預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。然而有關(guān)培哚普利預(yù)

表7 培哚普利對(duì)MSCs JAG1/Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Table 7 Effects of Perindopril on the expression of Jag1/notch pathway-related proteins in

防骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)機(jī)制尚未明確。研究[12]表明，GCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的骨骼系統(tǒng)疾病是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的原因之一，因此本研究探討了培哚普利對(duì)GCs類藥物DEX誘導(dǎo)的MSCs凋亡及成骨分化的影響，并分析相關(guān)機(jī)制。

DEX屬于GCs類，是臨床常用抗炎及免疫抑制類藥物，長(zhǎng)期大量使用會(huì)引發(fā)多種代謝副作用如胰島素抵抗、肌肉萎縮等[13]。潘吉銘等[14]的研究顯示，DEX可抑制成骨細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2、Bax是人體最主要細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，分別發(fā)揮抑凋亡、促凋亡作用[15]。cleaved-caspase-3可將細(xì)胞阻滯在G2/M期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。本研究以106mol/L DEX為造膜劑建立細(xì)胞模型，顯示與空白對(duì)照組比較，DEX組MSCs增殖抑制率、凋亡率顯著升高。與既往研究結(jié)果一致，說(shuō)明DEX可抑制MSCs增殖，誘導(dǎo)其凋亡。薛青等[17]的研究顯示，培哚普利可明顯上調(diào)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松伴高血壓患者的骨密度并下調(diào)硬骨蛋白，改善骨質(zhì)疏松癥。薛青等[17]的另一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)研究顯示，培哚普利對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1增殖及分化具有促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示，與DEX組比較，培哚普利低、中、高劑量組MSCs增殖抑制率、凋亡率均顯著降低，呈劑量依賴性。說(shuō)明培哚普利可能減弱DEX對(duì)MSCs增殖的抑制作用及對(duì)凋亡的促進(jìn)作用。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病原因之一是MSCs成骨分化能力減弱。ALP是衡量成骨細(xì)胞分化程度的重要指標(biāo)，CollagenⅠ、OPN是成骨分化成熟過(guò)程的特異性標(biāo)志物[18]。姜濤等[19]的研究顯示，牛膝甾酮能夠促進(jìn)骨質(zhì)疏松乳鼠成骨分化。本研究結(jié)果顯示，DEX環(huán)境下MSCs中ALP、CollagenⅠ、OPN mRNA及其蛋白表達(dá)均顯著降低，當(dāng)加入不同劑量培哚普利藥物處理后，MSCs中ALP、CollagenⅠ、OPN mRNA及其蛋白蛋白表達(dá)均顯著升高，且呈劑量依賴性。說(shuō)明培哚普利可能減弱GCs對(duì)MSCs成骨分化的抑制作用。

Notch信號(hào)通路包括Notch受體如Notch1/2及功能性Notch配體如JAG1/2，JAG1/2可識(shí)別Notch1/2并分別與二者結(jié)合，使得Notch1、Notch2經(jīng)兩次酶切過(guò)程形成活性形式，轉(zhuǎn)移至胞核，調(diào)控下游靶基因Hes1、Hey1的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)從而參與細(xì)胞一系列生物學(xué)過(guò)程[20]。研究[21]證實(shí)，Notch信號(hào)通路活化能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。馬玉等[22]的研究顯示，與空白對(duì)照組比較，腫瘤壞死因子(TNF-α)組牙周干細(xì)胞骨向分化能力明顯減弱，且JAG1、Notch2蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示TNF-α可能通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路活化抑制牙周干細(xì)胞骨向分化。本研究顯示，當(dāng)加入不同劑量培哚普利藥物處理后，MSCs中JAG1、JAG2、Notch1、Notch2、Hes1、Hey1 mRNA及其蛋白蛋白水平較DEX組顯著升高，呈劑量依賴性。說(shuō)明培哚普利可能拮抗DEX抑制Notch通路活化。

綜上所述，培哚普利可抑制DEX誘導(dǎo)的MSCs凋亡，促進(jìn)成骨分化，可能是通過(guò)促進(jìn)Notch信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，可為預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松癥提供一定的參考。但細(xì)胞凋亡機(jī)制較為復(fù)雜，具體調(diào)控機(jī)制仍需開(kāi)展進(jìn)一步的深入探討。