劉艷飛 李伯琦 陳朝旭 劉奕杉*

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(附屬口腔醫(yī)院)兒童口腔科-口腔預(yù)防科，新疆 烏魯木齊 830054 2.新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所，新疆 烏魯木齊 830054

近年來，人們越來越關(guān)注口腔疾病對全身健康的影響。牙齒脫落，冠、橋或假牙的垂直尺寸不足引起的咀嚼功能障礙會對身體、心理、生活質(zhì)量產(chǎn)生影響。大量研究表明[1-2]，咀嚼功能障礙作為慢性應(yīng)激源會激活下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary- adrenal，HPA)軸，導(dǎo)致循環(huán)糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)水平升高并引發(fā)各種疾病，如海馬依賴性認知缺陷。由于GC被認為是“應(yīng)激”的標志，因此咬合不協(xié)調(diào)會導(dǎo)致機體產(chǎn)生一定的壓力。眾所周知，過量接觸GC會導(dǎo)致骨質(zhì)減少。例如兒童使用類固醇藥物治療相關(guān)疾病，如哮喘和皮膚過敏，通常對骨骼有不良反應(yīng)，包括骨折和骨骼生長減慢[3]。鑒于應(yīng)激誘導(dǎo)的激素對骨代謝的顯著影響，有必要評估咬合支持改變引起的應(yīng)力對骨組織的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組

由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供的SPF級健康4～5周齡SD大鼠18只(雄性)，體重50～60 g，動物倫理審查批號(2016D01C316)，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，自由進食水，隨機分為3組。

1.2 主要試劑和儀器

注射水合氯醛、PBS鹽酸緩沖液(上海中杉金橋)，4%多聚甲醛緩沖液，CRH、ACTH、CORT、BGP、TRACP-5試劑盒(上海江萊)、5%EDTA脫鈣液、HE染色劑、移液器、小號止血鉗、光學(xué)顯微鏡(德國萊卡)、蠟切片機、顯微采片石、生物組織自動包埋機(德國萊卡)。

1.3 模型建立

所用實驗組動物均用水合氯醛(35 mg/100 g)腹腔注射麻醉，A組不拔牙，B組拔除單側(cè)磨牙，C組同時拔除雙側(cè)磨牙，實驗組用小號止血鉗拔除磨牙，術(shù)中動作輕柔，盡量拔除完整牙齒，若牙冠折斷、去除可見牙體組織，消除后牙咬合，壓迫止血后，常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，觀察大鼠一般情況及體重情況。

1.4 標本制備

造模后4周尾巴采血及8周后麻醉狀態(tài)下腹主動脈(采血時間20：00)，4 ℃靜置2 h、3 000 r/min離心 15 min，分離血漿，分裝于EP 管，-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆?；采血致死后迅速剝離股骨并用生理鹽水沖洗置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1 mol、pH=7.4)中固定48 h，左側(cè)股骨EDTA脫鈣后常規(guī)石蠟包埋，切4 μm厚骨組織切片標本，每只取5張連續(xù)切片置于載玻片進行HE染色；右側(cè)股骨置入PBS緩沖液中行Micro-CT掃描。

1.5 指標檢測和方法

按試劑盒說明，采用ELISA法檢測血漿CRH、ACTH、CORT、BGP和TRACP-5b的表達。通過HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀測大鼠股骨組織病理學(xué)改變。影像學(xué)檢測，以17.96 μm分辨率掃描大鼠右側(cè)遠端股骨，管電流為280 μA，管電壓為80 kV，曝光時間為280 ms，旋轉(zhuǎn)角度0.5 deg，掃描完成后，將Micro-CT數(shù)據(jù)傳到工作站，感興趣區(qū)域是距離股骨遠端的生長板0.5～2 mm處100片切片進行三維重建以及對骨小梁三維微結(jié)構(gòu)參數(shù)進行測量。測量參數(shù)包括骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(TB.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差做統(tǒng)計描述。多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用 LSD 檢驗(方差齊性)和 Tamhane’s T2 檢驗(方差不齊)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重情況

術(shù)后1 d大鼠正常顆粒飲食，毛發(fā)正常，拔牙前、術(shù)后4周和8周的大鼠各組間體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，進一步兩兩比較任意兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 三組大鼠不同時間體重比較

2.2 ELISA檢測HPA軸相關(guān)激素水平

隨著咬合支持改變加重，大鼠血漿中CRH、ACTH、CORT表達呈上升趨勢，三組大鼠表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，進一步兩兩比較大鼠血漿中CRH、ACTH、CORT的表達，任意兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，詳見表2。

2.3 ELISA檢測骨代謝相關(guān)激素水平

隨著咬合支持改變加重，大鼠血漿BGP呈顯著下降趨勢，TRACP-5b的表達呈下降趨勢；三組大鼠血漿中BGP的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，TRACP-5b的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；進一步兩兩比較，BGP任意兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TRACP-5b任意兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表3。

表2 三組大鼠血漿CRH、ACTH、CORT水平比較Table 2 Serum CRH, ACTH, CORT levels in three groups (ng/mL,

表3 三組大鼠血漿BGP、TRACP-5b水平

2.4 HE染色結(jié)果顯示

隨著咬合支持改變加重，大鼠股骨呈現(xiàn)不同的組織學(xué)改變，A組股骨骨小梁組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無明顯病理性改變；B、C兩組大鼠骨小梁變細、數(shù)量明顯減少，排列疏松；C組甚至斷裂，骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較多大的空白區(qū)域，詳見圖1。

圖1 三組大鼠股骨骨組織變化(HE 染色×100)Fig.1 Changes of the femoral bone tissue in rats (HE staining, ×100)

2.5 Micro-CT檢測大鼠股骨結(jié)果

隨著咬合支持改變加重，大鼠股骨骨小梁體積分數(shù)(BV/TV)、小梁數(shù)(Tb.N)和小梁厚度(Tb.Th)呈降低趨勢，骨小梁分離度(Tb.Sp)呈升高趨勢；三組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。進一步兩兩比較，任意兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖2、3。

圖2 大鼠各組股骨骨組織微結(jié)構(gòu)變化(Micro-CT)Fig.2 Microstructural changes of the femoral bone in each rat group (micro-CT)

圖3 三組大鼠股骨骨小梁BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp的比較Fig.3 Comparison of trabecular BV/TV, Tb.N, Tb.Th, and Tb.Sp of the femur among the three groups注：*P<0.05。

3 討論

HPA軸是一條直接作用與反饋互動的復(fù)雜集合的神經(jīng)內(nèi)分泌軸，參與控制應(yīng)激反應(yīng)，以維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[4]。HPA軸保持穩(wěn)態(tài)的機制廣泛依賴于幾個關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子的釋放和攝取，應(yīng)激信號沿神經(jīng)中樞傳入下丘腦室旁核，會引起促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)的釋放，CRH通過垂體門靜脈系統(tǒng)促進垂體前葉合成、分泌促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocoticotropic hormone，ACTH)，后者可誘導(dǎo)腎上腺皮質(zhì)束狀帶-網(wǎng)狀帶合成和釋放GC使機體發(fā)生防御反應(yīng)，GC人體中主要為皮質(zhì)醇(cortisol，COR)，嚙齒動物主要為皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)，這些循環(huán)皮質(zhì)類固醇調(diào)節(jié)大量生理過程，并且還負責(zé)激活腦內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid recepor，GR)來啟動HPA軸上的負反饋環(huán)路，抑制皮質(zhì)類固醇的過度產(chǎn)生。然而，重復(fù)或延長的HPA軸活動會持續(xù)增加循環(huán)GC水平循環(huán)，過多的GC會破壞HPA軸的負反饋系統(tǒng)，進一步增強了GC的分泌[5]。造模后實驗組大鼠血漿CRH、ACTH、CORT水平顯著增加，這與暴露于各種慢性壓力如束縛、強迫游泳、噪聲、擁擠、社會環(huán)境等導(dǎo)致嚙齒類動物中的應(yīng)激激素皮質(zhì)酮水平持續(xù)升高[6-7]相一致，因此大鼠長期咬合不調(diào)可作為慢性壓力使機體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，與此同時，本研究發(fā)現(xiàn)咬合支持完全喪失對大鼠HPA軸活動影響最大。

骨骼是GC的受體之一，在生理劑量下通過未成熟和成熟成骨細胞在早期骨骼中起作用；而超生理劑量的糖皮質(zhì)激素則會影響成骨細胞、骨細胞和破骨細胞，從而影響骨骼的發(fā)育[8]。目前認為BGP是反映機體的骨組織形成重要指標、TRACP-5b是骨吸收和破骨細胞活性的重要標志物[9-11]。SD大鼠在3～4月齡時骨形成和骨吸收活躍程度最高，骨量達到峰值[12]。與對照組相比，隨著咬合不調(diào)程度的加重，大鼠股骨血漿中BGP隨之降低，TRACP-5b隨之輕微升高，這說明大鼠咬合不調(diào)影響了骨代謝，循環(huán)中升高的CORT抑制了成骨細胞功能，而TRACP-5b輕微的增加可能與成骨細胞和骨細胞對破骨細胞募集和活化有關(guān)[13]。HE結(jié)果顯示實驗組骨小梁數(shù)量減少、變細，而雙側(cè)磨牙缺失(C)組病理學(xué)改變較嚴重出現(xiàn)了較多空白區(qū)域，Micro-CT結(jié)果顯示與對照組(A)相比，B和C組BV/TV分別降低了13.4%和23.8%，Tb.N分別降低了28.2%和58.9%，Tb.Th分別降低了9.9%和20.2%，Tb.Sp分別升高了12.4%和26.4%，這可能是由于循環(huán)中CORT的升高抑制成骨細胞的骨形成進而使骨轉(zhuǎn)換降低影響骨穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致骨量減少、骨形態(tài)改變。

大鼠一般情況正常，三組大鼠在每日食物攝入量和總體營養(yǎng)狀況方面無任何顯著差異。與對照組相比實驗組體重稍降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這與其他研究結(jié)果[2]一致。據(jù)報道，體重增加或減少10%以內(nèi)對骨量幾乎沒有影響[14]。因此，體重不是其主要影響因素。

綜上所述，幼年大鼠長期咬合不調(diào)作為慢性應(yīng)激源異?；罨疕PA軸，持續(xù)增加循環(huán)CORT水平。升高的CORT對成骨細胞的代謝及分子信號通路有負面影響，破壞成骨細胞和破骨細胞的動態(tài)穩(wěn)定，體現(xiàn)在骨小梁形態(tài)學(xué)改變及骨質(zhì)丟失。此外，通過對咬合支持改變對幼年大鼠股骨骨小梁的影響研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)咬合完全喪失對骨小梁影響更嚴重。臨床中加強對缺失牙的修復(fù)及咬合調(diào)整是否會緩解對骨質(zhì)的影響尚可未知，有待進一步研究。