鮑哲明 單青 李晨 陳孟莉*

1.中國人民解放軍總醫(yī)院，北京 100089 2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第960醫(yī)院骨科，山東 濟南 250031

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種由年齡、創(chuàng)傷、炎癥等多種因素相互作用引起的關(guān)節(jié)軟骨退行性改變，軟骨損傷是OA的重要表現(xiàn)，OA的病理、生理改變不止是軟骨的損傷修復(fù)，同時也存在關(guān)節(jié)軟骨下骨的結(jié)構(gòu)改變，在OA的形成和發(fā)展病理過程中相互促進(jìn)、相互影響[1]。大量研究[2]證明軟骨下骨結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)改變與軟骨退變存在一定的相關(guān)性。

動物模型是研究骨關(guān)節(jié)炎病理機制和治療的常用方法之一，主要分為藥物誘導(dǎo)、關(guān)節(jié)制動、手術(shù)誘導(dǎo)和自發(fā)性O(shè)A、轉(zhuǎn)基因動物模型等[3]。碘乙酸鈉(monosodium Iodoacetate, MIA)作為一種甘油醛-3-磷酸脫氫酶抑制劑，能夠抑制軟骨細(xì)胞代謝，引起軟骨細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解。MIA誘導(dǎo)的大鼠OA模型會出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的破壞，軟骨下骨結(jié)構(gòu)損傷、炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)疼痛等改變[4]。

本研究采用大鼠膝關(guān)節(jié)腔中注射MIA的方法建立大鼠OA模型，并通過Micro-CT以及組織切片等途徑來觀察關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨微結(jié)構(gòu)的改變，探討MIA造模后不同時段OA模型的病理改變以及OA不同階段軟骨下骨微結(jié)構(gòu)的變化特點，進(jìn)一步明確軟骨改變對軟骨下骨微結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：選取SPF級8周齡雄性Wistar大鼠36只，體重為240～260 g，許可證號SCXK(京)2019-0010，飼養(yǎng)于中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心。所有大鼠基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，能夠自由活動、攝食和飲水。本研究經(jīng)中國人民解放軍總醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，編號為SQ2020127。

1.1.2實驗試劑及器材：碘乙酸鈉(阿拉丁，中國)，4 %多聚甲醛溶液(Servicebio，中國)，10 % EDTA溶液(Servicebio，中國)，甲苯胺藍(lán)染液(Servicebio，中國)，番紅固綠染液(Servicebio，中國)；微量進(jìn)樣器(50 μL，上海安亭，中國)，小動物Micro-CT(Quantum GX，PerkinElmer，美國)，光學(xué)顯微鏡(Eclipse E100，尼康，日本)，電子天平(XS105DU，Mettler Toledo，瑞士)。

1.2 方法

1.2.1分組及處理方法：將36只Wistar大鼠編號，使用隨機數(shù)字法分成3組，每組12只，分別為空白對照組(Sham組)、OA造模2周組(OA-2W組)、OA造模4周組(OA-4W組)。配置60 g/L 濃度MIA的0.9 %生理鹽水溶液。將大鼠腹腔注射45 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。OA造模組采用微量進(jìn)樣器抽取配好的碘乙酸鈉溶液50 μL，于右膝關(guān)節(jié)髕骨下中間偏外側(cè)關(guān)節(jié)間隙斜45 °穿刺后推入MIA溶液，同法Sham組右膝關(guān)節(jié)注射等量生理鹽水溶液。所有大鼠飼養(yǎng)在相同的鼠籠內(nèi)并自由活動4周，Sham組和OA-4W組自飼養(yǎng)的第1周開始注射，造模4周；OA-2W組自飼養(yǎng)的第3周時注射，造模2周。

1.2.2標(biāo)本取材處理：所有大鼠飼養(yǎng)4周后，采用過量麻醉后頸椎脫臼法處死。固定消毒后，縱行切開大鼠右膝關(guān)節(jié)皮膚、皮下組織，暴露膝關(guān)節(jié)腔。骨剪離斷右側(cè)包含脛骨上端約2 cm的膝關(guān)節(jié)骨頭，去除附著的軟組織、肌肉組織等，隨即放置于4 %多聚甲醛溶液固定48 h備用。

1.2.3Micro CT掃描與分析將取下固定的膝關(guān)節(jié)脛骨豎直平放入樣品槽內(nèi)，使標(biāo)本縱軸垂直于射線。掃描參數(shù)：電流114 mA，電壓70 kV，視野25 mm，體素尺寸50 μm，曝光時間14 min。將掃描結(jié)果導(dǎo)入Analyze 12.0軟件進(jìn)行骨微結(jié)構(gòu)的定量分析，選取脛骨平臺下50層厚度為感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)，測量結(jié)果包括松質(zhì)骨的骨礦物質(zhì)密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume/tissue volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)、骨小梁連接密度(connectivity density, Conn.D)，將掃描后的圖像導(dǎo)入Mimics Research 21.0進(jìn)行三維圖像重建，獲得脛骨平臺圖像。

1.2.4組織學(xué)評價：將脛骨近端標(biāo)本放入4 %多聚甲醛溶液中固定48 h后，放入10 % EDTA脫鈣液脫鈣約4周，梯度脫水，浸蠟包埋，所有樣本取冠狀位縱切，厚度4～5 μm。分別進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色、甲苯胺藍(lán)染色、番紅固綠染色。通過顯微鏡觀察切片并拍照，OA組織學(xué)評價采用OOCHAS(osteoarthritis cartilage histopathology assessment system)評分方法[5]，由雙盲的獨立第三者計數(shù)評分，每個標(biāo)本取三張連續(xù)切片觀察計分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Micro-CT掃描圖像結(jié)果

三維重建圖像可見(圖1)，Sham組關(guān)節(jié)面光滑平整;OA-2W組關(guān)節(jié)面粗糙，可見局部軟骨缺損，部分區(qū)域有潰瘍形成，關(guān)節(jié)周緣少許骨贅形成;OA-4W組可見關(guān)節(jié)表面軟骨大量缺損，關(guān)節(jié)面極度粗糙，軟骨下骨質(zhì)裸露，關(guān)節(jié)周緣大量骨贅形成。

冠狀剖面圖像可見(圖2)，Sham組軟骨下骨小梁結(jié)構(gòu)均勻，排列整齊有序;OA-2W組骨小梁稀疏，出現(xiàn)鏤空現(xiàn)象，且骨小梁變薄，骨小梁連接減少，部分骨小梁結(jié)構(gòu)排列紊亂;OA-4W組骨小梁稀疏程度更加嚴(yán)重，骨小梁間出現(xiàn)大量缺損，部分骨小梁連接中斷，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失。

圖1 大鼠膝關(guān)節(jié)脛骨端Micro-CT三維重建圖像Fig.1 Micro-CT 3D reconstruction image of knee tibia in rats

圖2 大鼠膝關(guān)節(jié)脛骨端Micro-CT冠狀剖面圖像Fig.2 Micro-CT coronal section image of knee tibia in rats

2.2 軟骨下骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)

2.2.1骨密度與骨量：與Sham組相比，MIA造模后脛骨軟骨下出現(xiàn)了骨密度下降、骨量降低的情況，且隨著造模時間增加而逐漸加重。Sham組軟骨下松質(zhì)骨BMD平均為(1 367.97±37.43)mg/cc，OA-2W組軟骨下松質(zhì)骨BMD平均為(1 330.66±38.99)mg/cc(t=2.060，P=0.047 6)。而OA-4W組BMD下降至(1 285.5±47.08)mg/cc(t=5.143，P<0.000 1)。Sham組BV/TV平均為(38.22±3.284)%，OA-2W組相比下降至(30.72±5.122)%(t=4.563，P<0.000 1)，OA-4W組持續(xù)下降至(25.81±2.608)%(t=8.068，P<0.000 1)。見圖3。

2.2.2骨小梁結(jié)構(gòu)：與Sham組相比，MIA造模后軟骨下骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)稀疏改變，骨小梁變薄，軟骨下骨質(zhì)疏松進(jìn)一步加重。Sham組Tb.Th平均為(0.191 2±0.029 3)mm，OA-2W組下降至(0.175 0±0.019 4)mm(t=1.074，P=0.291 8)，OA-4W組下降至(0.141 4±0.029 9)mm(t=4.595，P<0.000 1)。Sham組Tb.Sp平均為(0.428 8±0.071 0)mm，OA-2W組升高至(0.475 0±0.090 3)mm(t=1.249，P=0.222 0)，OA-4W組升高至(0.530 7±0.089 3)mm(t=2.945，P=0.006 4)。Sham組Conn.D平均為(57.94±8.050)mm-3，OA-2W組下降至(52.39±8.781)mm-3(t=1.727，P=0.096 0)，OA-4W組下降至(45.48±10.14)mm-3(t=3.368，P=0.002 4)，見圖3。

2.2.3組織切片染色及評分：通過顯微鏡下觀察HE染色切片、甲苯胺藍(lán)染色切片和番紅固綠染色切片可見(圖4)，Sham組關(guān)節(jié)表面平整，軟骨細(xì)胞排列整齊。細(xì)胞及軟骨基質(zhì)染色正常，沒有減退現(xiàn)象；OA-2W組軟骨表面粗糙出現(xiàn)裂隙，軟骨表層變薄，軟骨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈團簇樣聚集，軟骨表面纖維化，深層軟骨細(xì)胞出現(xiàn)肥大，空泡狀改變，表層軟骨失染，部分軟骨染色減退；OA造模4周后可見軟骨表面大面積潰瘍?nèi)睋p，部分軟骨下骨質(zhì)裸露，軟骨表面覆蓋大量的纖維素，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞排列紊亂，局灶性細(xì)胞壞死，僅存少數(shù)淡染區(qū)域甚至全部失染。軟骨組織切片OOCHAS評分，Sham組平均為0(0,1)分，OA-2W組平均為12(9.75,15)分，較Sham組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004 7)，OA-4W組平均為24(20,24)分，較Sham組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)。見圖5。

圖3 大鼠脛骨軟骨下骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)Fig.3 Subchondral bone microstructural parameters of knee tibial in rats注：OA-2W組、OA-4W組與空白組之間分別進(jìn)行比較，nsP≥0.05，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1。

圖4 大鼠膝關(guān)節(jié)脛骨軟骨面HE染色切片、甲苯胺藍(lán)染色切片和番紅固綠染色切片F(xiàn)ig.4 HE staining section, toluidine blue staining section and Safranin-Fast Green Staining section of knee tibial cartilage surface in rats注：SBP：軟骨下骨板；AC：關(guān)節(jié)軟骨；比例尺：100 μm。

圖5 大鼠膝關(guān)節(jié)脛骨軟骨組織OOCHAS評分Fig.5 OOCHAS score of knee tibial cartilage in rats注：OA-2W組、OA-4W組與空白組之間分別進(jìn)行比較，**P<0.01，****P<0.000 1。

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎動物模型是研究骨關(guān)節(jié)炎病理機制和治療方法的重要途徑。OA模型通常分為自發(fā)性模型和繼發(fā)性模型。繼發(fā)性模型主要包括侵入性模型和非侵入性模型，是目前最為常用的造模方式[6]。侵入性模型包括手術(shù)誘導(dǎo)和化學(xué)誘導(dǎo)兩種方式。手術(shù)誘導(dǎo)的優(yōu)點是可重復(fù)性好，造模時間短，文獻(xiàn)報道[7]用于研究的時間長，材料方法獲取方便，對于技術(shù)要求低。缺點是與人類自然發(fā)生的退變性O(shè)A的變化特點相似性較差，存在感染的風(fēng)險，由于造模速度快，對于慢性病理特點的研究效果較差；化學(xué)誘導(dǎo)方法無需手術(shù)，能夠減少潛在的感染風(fēng)險，相對于手術(shù)造模侵入性更小。MIA作為一種甘油醛-3-磷酸脫氫酶抑制劑，是目前最常用的化學(xué)造模方法。Morais等[8]在關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA后發(fā)現(xiàn)，OA模型表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞的變性和凋亡，能夠造成軟骨損傷，與人體骨關(guān)節(jié)炎癥狀十分相似。很多學(xué)者使用MIA造模后，對于造模時間與OA嚴(yán)重程度的關(guān)系，沒有一個準(zhǔn)確的判斷，這就給使用動物模型研究疾病帶來了很大的不確定性和困難。既往學(xué)者報道[9-10]隨著注射MIA濃度劑量增加，OA的嚴(yán)重程度會逐漸加重，局部關(guān)節(jié)注射1.5～3 mg MIA造模1周后即可產(chǎn)生明顯的OA改變。本研究在使用3 mg MIA膝關(guān)節(jié)注射2周后發(fā)現(xiàn)，大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)了局部軟骨缺損，軟骨表面不規(guī)則，屬于OA疾病中期的病理表現(xiàn)。而在造模4周后可見關(guān)節(jié)表面軟骨大量缺損，軟骨下骨質(zhì)裸露，關(guān)節(jié)周緣大量骨贅形成，屬于晚期的OA程度。

軟骨下骨對表面的關(guān)節(jié)軟骨起到重要的減震功能，可以通過重塑在關(guān)節(jié)活動期間不斷適應(yīng)機械環(huán)境的變化，衰減約30 %的關(guān)節(jié)負(fù)荷[11]。既往研究[12]表明，OA發(fā)病過程中的各種原因可能會導(dǎo)致軟骨下骨吸收和骨重塑，進(jìn)而引起關(guān)節(jié)軟骨應(yīng)力改變導(dǎo)致退行性變加重。因此研究OA發(fā)生時軟骨下骨的骨微結(jié)構(gòu)改變，有助于我們更好的了解骨關(guān)節(jié)炎疾病的病理進(jìn)展特點。

許多研究[13]發(fā)現(xiàn)人體非膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨密度與軟骨厚度間存在正相關(guān)性，即軟骨越薄，軟骨下骨密度越低。在手術(shù)誘導(dǎo)OA造模的研究中，有學(xué)者[14]發(fā)現(xiàn)早期關(guān)節(jié)軟骨下骨及骨小梁厚度降低，骨吸收增加導(dǎo)致骨密度下降，晚期雖然會有軟骨下骨骨形成增加，骨贅形成，但其下方的松質(zhì)骨丟失嚴(yán)重，骨小梁進(jìn)一步變薄[15]。Siebelt等[16]注射木瓜蛋白酶造模后也發(fā)現(xiàn)隨著時間推移，軟骨下骨板會變薄，出現(xiàn)孔隙率增高，骨小梁丟失，骨量降低等表現(xiàn)。本研究通過使用MIA對大鼠進(jìn)行OA造模發(fā)現(xiàn)，隨著造模時間延長，OA程度逐漸加重，軟骨下骨會出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，骨密度下降，松質(zhì)骨會呈現(xiàn)骨小梁變薄，骨分離度增加，骨小梁連接密度下降的情況，并且這種情況會隨著OA嚴(yán)重程度加重而逐漸加重。在造模4周后達(dá)到OA的晚期階段，并沒有出現(xiàn)很多文章中報道的OA軟骨下骨密度增高的情況[17]。

結(jié)合以往的動物實驗和人體的相關(guān)研究結(jié)果，筆者推測在OA早期，骨吸收活躍，新生骨組織礦化率低，會出現(xiàn)軟骨下骨密度降低，骨小梁變薄，造成骨小梁間隙增大，導(dǎo)致軟骨下骨板結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞。在人體的OA發(fā)展過程中，早期軟骨下骨小梁連接密度的下降會造成軟骨下骨在緩沖軟骨受到的應(yīng)力方面能力下降。但隨著人體OA的進(jìn)展，膝關(guān)節(jié)軟骨磨損加重，關(guān)節(jié)會逐漸通過代償出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形，促使軟骨下負(fù)重能力發(fā)生改變，為了提供更多的載荷以承載緩沖關(guān)節(jié)承受的沖擊，軟骨下骨發(fā)生代償性致密改變，造成了晚期部分區(qū)域骨密度增高的現(xiàn)象[18]。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA等藥物引起的軟骨損傷退變，由于造模時間短，病情進(jìn)展快，不會出現(xiàn)人類自然病情發(fā)展過程中由于承受膝關(guān)節(jié)應(yīng)力負(fù)荷而導(dǎo)致軟骨下骨代償性骨密度增加的情況。本研究對動物進(jìn)行OA造模的時候，短期內(nèi)就可以模擬OA從輕度到重度的病理改變過程，軟骨下骨呈現(xiàn)的骨密度下降、骨質(zhì)疏松改變，可能是關(guān)節(jié)內(nèi)炎性破壞本身造成的直接結(jié)果。

本研究采用的是藥物注射形成關(guān)節(jié)內(nèi)炎性反應(yīng)、破壞關(guān)節(jié)軟骨來模擬OA的形成，相比于手術(shù)造模等其他方法，可能和人體創(chuàng)傷形成的OA存在一定的區(qū)別。另外，在造模的過程中，由于空白組注射后干預(yù)4周，沒有設(shè)立同OA造模2周組對比的空白注射2周組，并且組之間可能存在個體及活動能力的差異，給實驗結(jié)果帶來偏倚。

通過對大鼠膝關(guān)節(jié)注射MIA進(jìn)行OA造模，發(fā)現(xiàn)在MIA造模2周時達(dá)到OA中期階段，造模4周時為OA晚期階段，這為將來更好的應(yīng)用動物OA模型形成了理論依據(jù)。同時通過對軟骨下骨的骨微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，OA會造成軟骨下骨密度減低、骨小梁稀疏等骨質(zhì)疏松表現(xiàn)，并且隨著OA病情進(jìn)展，這種情況會逐漸加重。