陳錦成 朱國濤 秦曉飛 陳彥丞 羅駿 余博飛 吳宜璟 徐杰*

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)骨傷及運動康復(fù)教育部重點實驗室，福建 福州 350122 2.福建省立醫(yī)院骨二科，福建醫(yī)科大學(xué)，福建 福州 350001

肌少癥(sarcopenia)與骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)在臨床上關(guān)系緊密，但是聯(lián)系兩者間的機制尚未完全闡明。microRNA被證實密切參與骨骼肌肉代謝，有望成為聯(lián)系兩者間的新橋梁。本項目前期研究中發(fā)現(xiàn)miR-381-3p在肌少-骨質(zhì)疏松癥(sarco-osteoporosis，SO)與OP患者中存在顯著的差異性表達(10.57倍)[1]，其可能參與肌少癥患者罹患OP的發(fā)生發(fā)展過程[2]。在細胞實驗中初步證實了miR-381-3p可以通過介導(dǎo)ERK1/2/ETS1信號通路因子抑制MC3T3-E1細胞成骨分化的機制，但是上述機制尚不能很好的解釋miR-381-3p調(diào)控機體骨代謝機制的全部內(nèi)容。

miRNA作為骨質(zhì)疏松癥和肌少癥的發(fā)生發(fā)展過程中重要的調(diào)控分子；成熟的miRNA通過形成沉默復(fù)合體，再通過完全或不完全配對與特定靶基因的3’UTR結(jié)合，起到抑制mRNA 翻譯或是直接降解mRNA 的作用，從而影響了靶點基因的表達水平。綜合miRNA調(diào)控機制存在多靶點與涉及廣泛信號通路因子的復(fù)雜性，本課題采用小鼠前成骨細胞(MC3T3-E1)，基于慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)成功構(gòu)建miR-381-3p在MC3T3-E1細胞中實驗組(MC3-E1-in)與對照組(MC3-E1-NC-in)細胞模型，創(chuàng)新性運用非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選miR381-3p在體外細胞中實驗組與對照組的差異蛋白質(zhì)譜，目的是盡最大可能鑒定出miR381-3p可能涉及的相關(guān)的分子信號通路或重要的轉(zhuǎn)錄因子以揭示其介導(dǎo)成骨分化與骨形成過程更多的調(diào)控機制。本實驗蛋白質(zhì)組學(xué)篩選數(shù)據(jù)為課題組后續(xù)開展SO的更進一步研究提供了參考靶蛋白與相關(guān)的信號通路信息及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗試劑和耗材：Bradford試劑購自于碧云天；二硫蘇糖醇(DTTred，貨號：D9163-25 G)、碘代乙酰胺(IAM，貨號：I6125-25 G)、碳酸氫銨(貨號：5330050050)、三乙基碳酸氫銨緩沖液(貨號：T7408-500 ML)、氨水(貨號：221228-500 ML-A)均購自于Sigma；尿素和十二烷基硫酸鈉(SDS)均購自于國藥；質(zhì)譜級胰酶(貨號：V5280)購自于Promega；LC-MS級超純水(貨號：W6-4)、LC-MS級乙腈(貨號：A955-4)、LC-MS級甲酸(貨號：A117-50)均購自于Thermo Fisher Chemical；丙酮(貨號：11241203810051)購自北京化工廠。

1.1.2實驗儀器：EASY-nLC 1200TM(型號：LC140)、Q ExactiveTMHF-X質(zhì)譜儀、酶標(biāo)儀均購自Thermo Fisher；低溫離心機(型號：D3024R)購自于Scilogex；冷凍干燥機(型號：Scan Speed 40)購自 Labogene；電泳儀、電泳槽均購自Bio-Rad；電子天平(型號：BSA124 S)購自Sartorius；渦旋混合器(型號：HY-6B)購自光合；制冰機購自雪科；超聲波細胞破碎儀(型號：JY92-11 N)購自寧波新芝。

1.2 方法

1.2.1MC3T3-E1成骨細胞總蛋白提?。篗C3T3-E1成骨細胞慢病毒轉(zhuǎn)染成功并試試熒光定量PCR驗證轉(zhuǎn)染效率后，將細胞樣品凍存于- 80 ℃ 冰箱中；正式實驗時從- 80 ℃冰箱取出細胞樣品，冰上操作，根據(jù)凍存時的細胞計數(shù)所得的細胞量加入一定體積的蛋白裂解液(100 mmol/L碳酸氫銨、8 mol/L尿素、0.2 % SDS，pH=8)，渦旋并振蕩混勻，超聲5 min使充分裂解；迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)冷好的1.5 mL離心管中，于4 ℃、12 000g離心15 min，取上清加入終濃度10 mmol/L DTTred于56 ℃反應(yīng)1 h，之后加入適量的IAM，于溫箱37 ℃避光孵育1 h。加入4倍體積的預(yù)冷好的丙酮于- 20 ℃環(huán)境下沉淀處理2 h，于4 ℃、12 000g至少離心15 min，收集沉淀。之后加入1 mL預(yù)冷好的丙酮重懸處理，隨后清洗沉淀樣品，于4 ℃、12 000g離心15 min，收集沉淀，風(fēng)干，最后加入一定體積的蛋白溶解液(6 mol/L尿素、100 mmol/L TEAB，pH=8.5)以溶解蛋白沉淀。

1.2.2成骨細胞總蛋白質(zhì)量控制和酶解：使用碧云天蛋白質(zhì)定量試劑盒進行BCA定量和測量蛋白樣品濃度[3]，按照試劑盒的說明書先在1.5 mL離心管中配制好BSA標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白溶液，使其濃度梯度范圍為0～ 0.5 μg/μL。按照說明設(shè)置不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液和稀釋一定倍數(shù)的待測樣品試劑逐個加入96孔板中，用PBS補足每孔體積至20 μL，每個梯度需設(shè)置復(fù)孔3個。最后加入180 μL G250染色液工作液，室溫反應(yīng)5 min，酶標(biāo)儀上測定吸光度并在excel表格中運用標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計算每組待測樣品的蛋白總濃度。隨后每組取40 μg樣品進行10 % SDS-PAGE凝膠電泳，其中上層膠電泳條件為80 V跑30 min，下層膠電泳條件為110 V跑80 min；電泳結(jié)束后將條帶用考馬斯亮藍染色進行驗證。為了進行蛋白水解，在37 ℃下于2.5 μg胰蛋白酶中將100 μg蛋白質(zhì)/樣品水解4 h(蛋白質(zhì)：酶比= 40∶1)。然后以相同比例再次添加胰蛋白酶，并在37 ℃下繼續(xù)酶解8 h。接下來，使用Strata X柱將水解的肽脫鹽，并在真空下干燥。

1.2.3液質(zhì)檢測：流動相A液體(100 %水+0.1 %甲酸)和B液(80 %乙腈+0.1 %甲酸)預(yù)配置。使用A液10 μL溶解凍干粉末，隨后4 ℃離心機中14 000g離心20 min，取上清1 μg實驗樣品上樣，進行液質(zhì)檢測。使用EASY-nLC 1200TM的UHPLC系統(tǒng)，預(yù)柱為自制預(yù)柱(2 cm×75 μm，3 μm)，其中分析柱為自制分析柱(15 cm×150 μm，1.9 μm)，根據(jù)試劑使用說明書操作液相色譜的洗脫程序，在Q ExactiveTMHF-X質(zhì)譜儀上機，生成質(zhì)譜檢測原始數(shù)據(jù)(文件格式.raw)[4]。

1.2.4蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索和差異表達蛋白的功能分析：使用 Interproscan軟件進行GO功能注釋(涉及Pfam、PANTHER、ProDom、ProSite、SMART等數(shù)據(jù)庫)，COG和KEGG對鑒定到的蛋白質(zhì)進行功能蛋白家族及通路分析[5]。針對具有DEPs進行火山圖分析、聚類熱圖分析以及GO和KEGG的通路富集分析[6]，并使用STRING DB軟件[7]預(yù)測可能的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(http:// STRING.embl.de/)。

1.3 生物信息學(xué)分析

對鑒定到的蛋白進行GO數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫和亞細胞定位等常見功能數(shù)據(jù)庫注釋；針對篩選出來的DEPs結(jié)果運用火山圖與表達聚類圖進行整合分析，然后進行GO功能富集、KEGG功能富集分析、DEPs亞細胞定位分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析等DEPs功能分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-381-3p轉(zhuǎn)染效率實時熒光定量PCR驗證

在MC3T3-E1細胞中轉(zhuǎn)染對照組(MC3-E1-NC-in)和實驗組(MC3-E1-in)對應(yīng)的病毒，并且經(jīng)過嘌呤霉素篩選后構(gòu)建成穩(wěn)轉(zhuǎn)株，采用實時熒光定量PCR驗證這兩組的miR-381-3p表達水平；對照組和實驗組相比，差異倍數(shù)0.74倍(P<0.05)，證明miR-381-3p表達水平被抑制；兩組中miR-381-3p轉(zhuǎn)染效率經(jīng)實時熒光定量PCR驗證達到預(yù)期結(jié)果(圖1)，細胞實驗?zāi)Ｐ蜆?gòu)建成功。

圖1 實驗組與對照組MC3T3-E1細胞慢病毒轉(zhuǎn)染效率(*P<0.05)Fig.1 Lentiviral transfection efficiency of MC3T3-E1 cells in experimental group and control group (*P<0.05)

2.2 定量差異蛋白質(zhì)譜篩選結(jié)果

在實驗組(MC3-E1-in)組與對照組(MC3-E1-NC-in)中共篩選出了4 764種差異表達蛋白，其中527種差異顯著并具有統(tǒng)計學(xué)意義，表達上調(diào)的有357種，有170種則是表達下調(diào)，見表1。對顯著DEPs繪制了火山圖，見圖2。

2.3 GO富集結(jié)果分析

為了評估所有鑒定出的蛋白質(zhì)的功能意義，使用 interproscan 軟件進行GO注釋分析。結(jié)果顯示這些DEPs參與多個生物學(xué)過程(BP)，主要的代謝過程為細胞代謝過程、核酸代謝過程、細胞蛋白修飾過程和蛋白質(zhì)磷酸化通路；DEPs參與的主要分子功能(MF)為蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性和甲基轉(zhuǎn)移酶活性；DEPs的細胞組分(CC)分析顯示主要由細胞骨架部分、微管細胞骨架和外泌體組成；DEPs主要定位于膜的整體組分、膜上和胞質(zhì)。GO富集柱狀圖見圖3。

表1 差異表達蛋白質(zhì)譜Table 1 Differentially expressed protein profile

圖2 鑒定細胞樣品中的差異蛋白火山圖Fig.2 Identify the difference protein volcano plot in the cell sample注：X軸表示蛋白質(zhì)差異(log2轉(zhuǎn)換的倍數(shù)變化)；Y軸則表示相應(yīng)的- log10轉(zhuǎn)換的P值；紅點表示蛋白上調(diào)顯著；綠點表示蛋白下調(diào)顯著；灰點表示沒有明顯變化的蛋白。

2.4 KEGG通路富集分析

課題組進行了KEGG通路[8-9]分析，以進一步表征已鑒定DEPs的生物學(xué)功能。結(jié)果表明，DEPs涉及549條信號通路，差異蛋白富集結(jié)果中排名最高的20種生物學(xué)功能如圖4所示，主要通路是細胞周期通路(14種)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路(9種)、Ras信號通路(7種)和過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR)信號通路(6種)。在這些途徑中，“細胞周期通路、MAPK信號通路和PPAR信號通路”富含絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶PLK、脂滴包被蛋白2、Ras相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-β的進化保守信號中間物2型受體和其他蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的表達隨年齡增加而增加；另一方面，在本次成骨細胞樣本中檢測到的各種DEPs中也豐富了一些氧化代謝過程，尤其是一些與成骨和成肌代謝有關(guān)的過程。

圖3 所有已鑒定細胞樣品蛋白的功能性GO分類Fig.3 Functional GO classification of all identified cell sample proteins注：X軸表示GO三個大類(細胞組分、分子功能、生物過程)的富集結(jié)果；Y軸為與該GO相關(guān)的差異蛋白數(shù)目占GO注釋的所有差異蛋白數(shù)目的百分比。

圖4 差異蛋白KEGG富集的前20條途徑Fig.4 Top 20 pathways enriched by differential protein KEGG注：X軸表示富集因子(Ratio)，即注釋到每個途徑的差異蛋白的數(shù)目除以注釋到同一途徑的所有鑒定的蛋白質(zhì)；值的大小表示注釋到每個路徑的DEPs的比例大?。稽c大小代表注釋到每個路徑的差異蛋白數(shù)量。

2.5 DEPs中與SO相關(guān)的蛋白

在發(fā)現(xiàn)的DEPs中，篩選出己糖激酶2、驅(qū)動蛋白樣蛋白22、cAMP調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白19和脂滴包被蛋白2等4個SO相關(guān)蛋白，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖見圖5。

圖5 差異蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 PPI network diagram of differential proteins注：紅色和藍色節(jié)點分別表示DEPs上調(diào)和下調(diào)；圓圈的大小指示節(jié)點度。

3 討論

本實驗研究運用Label-free定量蛋白質(zhì)組技術(shù)構(gòu)建出小鼠前成骨細胞實驗組與對照組的差異表達蛋白質(zhì)譜，用T-test檢驗對蛋白質(zhì)定量結(jié)果進行統(tǒng)計分析，將實驗組(MC3-E1-in)和對照組(MC3-E1-NC-in)之間定量差異顯著的蛋白質(zhì)(FC≥2.0，同時P≤0.05時，標(biāo)記為上調(diào)表達蛋白；當(dāng)FC≤0.50，同時P≤0.05時，標(biāo)記為下調(diào)表達蛋白) 定義為DEPs。結(jié)合文獻梳理結(jié)果并初步篩選出己糖激酶2、驅(qū)動蛋白樣蛋白22、cAMP調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白19和脂滴包被蛋白2等OP相關(guān)蛋白，分析這些DEPs，緊密結(jié)合課題組前期SO高通量測序發(fā)現(xiàn)肌肉和骨組織樣品中顯著差異表達miR-381-3p等臨床實驗發(fā)現(xiàn)，并通過本項目的細胞層面蛋白質(zhì)組學(xué)研究為進一步闡明SO的內(nèi)在分子機制提供更多基礎(chǔ)研究依據(jù)。

己糖激酶2(hexokinase-2，HK2)在正常的機體骨代謝過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，國內(nèi)外研究者研究發(fā)現(xiàn)，HK2不僅在糖酵解中起重要作用，而且在細胞存活中也起重要作用；Miyamoto 等[10]研究發(fā)現(xiàn)HK2是骨骼肌和脂肪組織等胰島素敏感組織中的主要同工型的酶，其上調(diào)表達有助于自噬反應(yīng)，其機制可能是HK2充當(dāng)從糖酵解到自噬的分子轉(zhuǎn)換，以確保機體在一定條件下的細胞能量穩(wěn)態(tài)，以實現(xiàn)保護肌細胞的目的。

驅(qū)動蛋白樣蛋白22(kinesin-like protein 22，KIF22)屬于微管依賴性分子運動蛋白，可與微管和染色體結(jié)合，轉(zhuǎn)運細胞器，蛋白質(zhì)和mRNA[11]。郭曉強等[12]研究發(fā)現(xiàn)驅(qū)動樣蛋白作為重要地的分子馬達，其重點調(diào)控肌肉細胞和非肌肉細胞的機體運動，此外，驅(qū)動樣蛋白可與動力蛋白搭配后沿著微管運動在細胞內(nèi)負責(zé)進行物質(zhì)運輸，其在細胞有絲分裂、細胞骨架動力學(xué)以及減數(shù)分裂中染色體分離過程充當(dāng)重要角色[13]；Faire等[14]的研究還發(fā)現(xiàn)在成肌分化過程中，許多細胞器會重新定位，并在肌管的整個生命周期內(nèi)保持不對稱分布，而驅(qū)動樣蛋白超家族的成員可能負責(zé)這些微管依賴性運動中的一些或全部，在研究者后續(xù)鑒定過程中同樣證實了驅(qū)動蛋白樣蛋白在所有階段的成肌細胞中以及在各種大鼠組織中普遍表達。在小鼠前成骨細胞實驗組與對照組對比中發(fā)現(xiàn)KIF22處于高表達水平，提示驅(qū)動蛋白樣蛋白22可能作為有效轉(zhuǎn)錄因子參與老年性肌肉-骨骼系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展過程。

Yoshikawa等[15]在鑒定大鼠骨骼肌的失神經(jīng)萎縮差異基因表達研究中發(fā)現(xiàn)，cAMP調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白19(cAMP-regulated phosphoprotein 19，ARPP19)處于高表達水平。眾所周知，cAMP對L-型鈣通道功能具有重要的調(diào)控作用。李芳萍[16]研究成骨細胞Ros 17/2.8中肌動蛋白對cAMP調(diào)節(jié)的L-型鈣通道的作用及其分子機制時，發(fā)現(xiàn)肌動蛋白可以通過改變L-型鈣通道動力學(xué)特征以調(diào)節(jié)L-型鈣通道的活性, 研究者深入研究發(fā)現(xiàn)機體肌動蛋白狀態(tài)可以顯著影響L-型鈣通道的功能，而cAMP可以介導(dǎo)肌動蛋白4與L-型鈣通道的相互作用來調(diào)控L-型鈣通道的功能。

脂滴包被蛋白2(perilipin-2，Plin2)是一種與細胞內(nèi)脂質(zhì)小滴(LDs)代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)[17]，其過表達會影響肌肉減少癥、骨質(zhì)疏松癥等多種代謝和與年齡有關(guān)的疾病的進程，這表明該蛋白可能在這些病理狀態(tài)下起作用；Conte等[18]的研究則在老年人和不運動的人群中發(fā)現(xiàn)了Plin2與較低的肌肉質(zhì)量和力量之間的密切關(guān)系，但其在骨骼肌中的功能仍不清楚，Conte等研究者通過后續(xù)實驗研究了Plin2在肌肉中的作用，實驗數(shù)據(jù)表明Plin2是控制肌肉質(zhì)量的關(guān)鍵介質(zhì)。Vasuri F等[19]的研究發(fā)現(xiàn)Plin2表達隨年齡增長而增加，以Plin2包被的脂質(zhì)滴形式存在于骨骼肌中的脂肪沉積會隨著年齡的增長而增加，并且與肌肉強度和厚度的降低有關(guān)，其機制可能是通過IGF-1和p53依賴性調(diào)控的[20]。

本研究采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)并結(jié)合文獻閱讀篩選出己糖激酶2、驅(qū)動蛋白樣蛋白22、cAMP調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白19和脂滴包被蛋白2等可能在miR-381-3p介導(dǎo)肌-骨系統(tǒng)代謝過程起到調(diào)控作用的特異性靶蛋白。課題組后續(xù)研究將綜合miR-381-3p在成肌細胞中的蛋白質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)，綜合分析miR-381-3p在成骨細胞和成肌細胞中蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系以便發(fā)現(xiàn)肌少-骨質(zhì)疏松癥密切聯(lián)系的共同轉(zhuǎn)錄因子。并且在本實驗蛋白質(zhì)組學(xué)篩選數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上課題組后續(xù)開展重要靶蛋白與相關(guān)的信號通路信息的干預(yù)處理及機制分析，針對有特定意義的蛋白將通過動物基因敲除及細胞層面的熒光素酶報告基因驗證，以更好地說明所鑒定到的靶蛋白在研究肌少-骨質(zhì)疏松癥疾病發(fā)生、發(fā)展中的意義。