高巳東 鄧洋洋 王重一 林浩楠 林庶茹

遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[1](postmenopausal osteoporosis，PMOP)屬于Ⅰ型原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。PMOP好發(fā)于絕經(jīng)后5～10年之間[2]，是由于骨吸收與骨生成之間平衡受到破壞，成骨因子合成量減少，骨礦含量低下，導致骨密度下降[3-4]。

淫羊藿入肝、腎經(jīng)，為補腎陽、強筋骨、祛風濕之要藥。《中國藥典》標注，淫羊藿苷(icariin，ICA)是淫羊藿中含量最高的單體[5]，其含量至少為0.5 %[6]。分子式呈植物雌激素樣結構[7]。因ICA療效明顯，易獲取，且基于雌激素-ERα軸探討應用植物雌激素ICA與激素替代療法對比的相關研究較少，遂選擇ICA進行本次實驗。本研究將對比補腎填精中藥單體ICA與雌激素替代療法促進BMSCs向成骨分化及對內(nèi)環(huán)境雌激素(estrogen，E2)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料：SD大鼠BMSCs(凍存代次P2)購自賽業(yè)(蘇州)。

1.1.2主要實驗試劑：SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)液、茜素紅(賽業(yè)，中國)；雌二醇、淫羊藿苷(上海源葉，中國)；大鼠ALP、E2 ELISA試劑盒(聯(lián)碩生物，中國)；羅丹明標記鬼筆環(huán)肽(索萊寶，美國)；ERα抗體(三鷹，中國)；FITC標記山羊抗兔IgG(EARTHOX，美國)。

1.1.3主要實驗儀器：IX71 型倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；Infinite M200 型多功能酶標儀(TECAN，奧地利)；BL610/BL1500 電子天平(賽多利斯，中國)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)：將大鼠BMSCs接種于含體積分數(shù)為10 %胎牛血清的培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)。觀察細胞生長至對數(shù)時期時，進行傳代培養(yǎng)。本次實驗選取第3、4代。將細胞分為正常組、E2組、ICA組和E2+ICA組。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖：根據(jù)前期實驗積累，將總質(zhì)量20 mg、分子量為676.65的ICA溶解于DMSO中，配制濃度為10-6mmol/L。將總質(zhì)量100 mg、分子量為272.382的17β-E2溶解于DMSO中，配制濃度為10-8mmol/L。將消化后的細胞反復吹打混勻，以5×108/孔為標準，均勻鋪滿96孔板。培養(yǎng)24 h，將原有培養(yǎng)液吸走，再加入培養(yǎng)液(含體積分數(shù)為0.5 %胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將原有培養(yǎng)液吸走，加入含藥培養(yǎng)液，設置正常組、E2、ICA組、E2+ICA組，共計4組，每組6個復孔，干預24、48、72 h。然后，按照試劑盒說明書加入MTT溶液，培養(yǎng)1 h。將96孔板放入酶標儀中，用570 nm波長檢測吸光度。

1.2.3茜素紅染色：將BMSCs反復吹打混勻，用24孔板設置細胞為 5×104個/孔均勻鋪板，每組4個復孔，分別培養(yǎng)6、12、18 d。觀察細胞狀態(tài)后棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞兩次，多聚甲醛浸泡30 min固定形態(tài)，再用PBS清洗兩次，滴入茜素紅染液避光染色30 min，置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置。染色后用PBS沖洗2次。待表面水汽蒸發(fā)完全后，鏡下觀察視野內(nèi)礦化結節(jié)。

1.2.4ELISA法檢測ALP[8]、E2[9]活性：取各組細胞上清液，置于- 80 ℃保存；運用ELISA試劑盒對ALP、E2檢測，標準曲線制備及樣品測定方法按照說明說操作。在490 nm的波長處檢測OD值，根據(jù)標準曲線計算各孔濃度。

1.2.5ERα免疫熒光染色：在24孔板中，每孔放入枚爬片，再設置BMSCs為5×104個/孔均勻鋪板,每組4個復孔，分別培養(yǎng)6、12、18 d。爬片用 PBS 洗滌兩次，在室溫下用4 %多聚甲醛固定15 min，將細胞與ERα抗體(1∶200)一起孵育過夜。與FITC標記山羊抗兔IgG (1∶500) 孵育2 h，加羅丹明標記鬼筆環(huán)肽對細胞骨架染色，DAPI復染細胞核。用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察染色的ERα。細胞中ERα的表達量用ImageJV1.8.0.112軟件進行分析統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 MTT法檢測細胞增殖功能

將各組細胞分別培養(yǎng)24、48、72 h，E2組和ICA組的OD值在48 h時到達峰值，隨后降低；E2+ICA組在72 h時到達峰值，但該組48 h與72 h相差不明顯；細胞增殖24 h時，E2組增殖量高于ICA組，48、72 h的結果顯示ICA組增殖量高于E2組，且在48 h時ICA組高于E2+ICA組，見圖1。

圖1 MTT增殖與活力檢測表Fig.1 The MTT proliferation and viability detection table 注：與正常組同一時間比較，**P<0.01；與組內(nèi)不同時間比較：與24 h組比較，○○P<0.01；與48 h組比較，△P<0.05。

2.2 ELISA法檢測ALP、E2

2.2.1ALP活性檢測：檢測各組在6、12、18 d 時的ALP活性，隨著培養(yǎng)時間延長而發(fā)生變化，相同時間點各給藥組ALP活性從小到大依次為ICA組

2.2.2E2活性檢測：根據(jù)ALP結果，檢測各組在 12 d 時E2活性，各給藥組E2活性從低到高依次為：正常組

表1 不同時間各組ALP活性比較

表2 各組細胞E2活性比較

2.2.3茜素紅染色結果：BMSCs誘導12 d，經(jīng)茜素紅染色后光鏡下觀察礦化結節(jié)(+)，大小不等，分布不均，各組礦化結節(jié)數(shù)量有所不同(圖2)。各給藥組礦化結節(jié)數(shù)量均多于正常組(A)，數(shù)量從少到多，依次為ICA組(C)< E2組(B)< E2+ICA組(D)。與ALP活性結果趨勢一致。

圖2 各組茜素紅染色結果Fig.2 Results of alizarin-red staining in each group注：A：正常組；B：E2組；C：ICA組；D：E2+ICA組。

2.2.4ERα免疫熒光染色：通過免疫熒光技術[10]對細胞骨架(紅色)、ERα(綠色)和細胞核(藍色)進行染色，觀測正常組、E2組、ICA組和E2+ICA組的ERα表達量及其亞細胞的定位改變(圖3、圖4)。結果顯示，ERα在成骨細胞中主要分布于細胞質(zhì)內(nèi)，與正常組相比，各給藥組細胞核內(nèi)ERα的分布增多，核內(nèi)的基因轉錄隨之增加。數(shù)量從少到多，依次為ICA組

圖3 免疫熒光染色法檢測ERαFig.3 Immunofluorescence staining method to detect ERα

圖4 各組ERα平均熒光強度Fig.4 Average fluorescence intensity of ERα注：與正常組比較，**P<0.01；與E2組比較，○P<0.05，○○P<0.01；與ICA組比較，△△P<0.01。

3 討論

3.1 “腎精”“內(nèi)環(huán)境雌激素水平”與PMOP的關系

近代研究[11]表明，PMOP誘因除年齡因素外，雌激素缺乏、ER相關蛋白表達水平下降在PMOP發(fā)病機制中至關重要。雌激素與維生素 D、鈣及其他激素一起，在體內(nèi)進行有效地分解并參與骨重建。其中，雌激素的骨保護作用主要由雌激素受體α介導[12]。在雌性小鼠中，雌激素-ERα軸的激活對于皮質(zhì)骨和小梁骨的擴張、成骨細胞成熟至關重要[10,13-14]。

《黃帝內(nèi)經(jīng)》提到“二七天癸至，...，月事以時下”“女子七七，...，天癸竭，地道不通”，天癸與女子月事息息相關，也可反映腎中精氣盛衰。腎精充，天癸至，女子初潮；腎精衰，天癸竭，女子絕經(jīng)。PMOP可引起骨質(zhì)、骨量及骨功能的異常。中醫(yī)將“腎、骨、髓”組成了一個相互關聯(lián)的系統(tǒng)。其根本在于腎，以腎藏精，灌輸、濡潤、滋養(yǎng)骨腔腦髓。骨作為“靶器官”，與腎中精氣關系密切。維系腎與骨之間的中間精微物質(zhì)則是髓液，為腎精所化生。PMOP的發(fā)生與中醫(yī)腎精虧虛，雌激素異常相關。

3.2 雌激素替代療法與植物激素應用的比較

眾所周知，絕經(jīng)后婦女雌激素缺乏會導致PMOP的發(fā)生。研究[3,15]表明，雌激素替代療法(estrogen replacement therapy , ERT)能夠治療因雌激素水平缺乏引起的PMOP相關癥狀，但ERT同時也存在弊端，如造成肥胖、高血糖，甚至引起乳腺癌、心血管疾病及血栓等嚴重副作用。與ERT相比[16]，植物雌激素或植物來源的異種雌激素同樣具有緩解PMOP相關癥狀的功能。植物雌激素最大的優(yōu)點在于通過雙向調(diào)節(jié)以維持雌激素含量升降平衡，具有更安全、高效、全面的特性。

3.3 ICA對內(nèi)環(huán)境雌激素水平、ALP的影響

補腎填精中藥單體ICA屬于植物雌激素，可促進BMSCs向成骨分化[11]。ICA的藥效反應更快、毒性更小、短期藥效水平維持良好，本研究僅進行單藥最佳濃度1∶1配合應用，也為后續(xù)探討根據(jù)藥物反應時效調(diào)整不同時間段的用藥比例以發(fā)揮最佳藥效提供了實驗基礎。ALP是成骨細胞的一種早期特征性生物標志物[17]，可進一步促進成骨細胞礦化。對比各給藥組E2活性與ALP活性趨勢，盡管單純補充雌激素療法可以更顯著地提高細胞內(nèi)雌激素含量，但ICA在促進BMSCs向成骨分化以防治骨質(zhì)疏松癥的同時，又能將內(nèi)環(huán)境雌激素的含量趨于正常標準，以此規(guī)避ERT的副作用，效果良好。

綜上所述，根據(jù)中醫(yī)理論“腎藏精主骨”，腎精充足，骨骼強健，補腎填精中藥單體ICA可以通過提高ERα核內(nèi)表達，增加ALP含量，維持正常雌激素水平。能夠用于治療雌激素缺乏為主的PMOP，亦可為絕經(jīng)后雌激素分泌異常導致的其他慢性病提供新靶點和新思路。