羅桂花，林翠清，肖鸕華，方 媛，莫穗芬，楊惠琳，嚴 萍＊，詹若挺

（1.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006，2.廣州中醫(yī)藥大學中藥資源科學與工程研究中心 嶺南中藥資源教育部重點實驗室（廣州中醫(yī)藥大學） 國家中成藥工程技術研究中心南藥研發(fā)實驗室，廣東 廣州 510006）

三叉苦[Melicope pteleifolia (Champion ex Bentham) T.G.Hartley]為蕓香科蜜茱萸屬植物，嶺南本草著作《山草藥指南》是對三叉苦最早記載的著作，主要作為地方藥材被廣泛應用，其用藥部位廣泛，包括枝、根、莖、葉。三叉苦又名三丫苦、三叉虎，主要產(chǎn)于我國廣東、廣西等地區(qū)[1]。據(jù)《中藥炮制學詞典》記載，三叉苦味苦性寒，有清解熱毒,祛風除濕,消腫止痛之效。目前已經(jīng)具有相關臨床基礎，市場上主要用于乳癖安消膠囊、三九胃泰、三九感冒靈等多種中成藥。三叉苦中所含化學成分主要為黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油、色烯等[2]，且三叉苦總黃酮具有較好的抗炎及抗氧化活性[3-4]。三叉苦作為廣東省常用的藥食同源植物，食用價值較高，已被廣泛用于制作涼茶[5]。目前對于三叉苦提取的研究報道更多集中于抗炎作用[6]，為更好地開發(fā)利用三叉苦總黃酮類成分抗氧化作用，本實驗采用星點設計響應面法對三叉苦總黃酮的單因素考察結果進行優(yōu)化，并評價其體外抗氧化活性，為該藥的開發(fā)研究提供基礎。

1 儀器與材料

1.1 藥材與試劑

所用藥材于2016年3月采自廣東河源，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學中藥學院詹若挺研究員鑒定為蕓香科蜜茱萸屬植物三叉苦Melicope pteleifolia (Champion ex Bentham) T.G.Hartley的干燥帶葉嫩枝。

蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201409），供UV測定含量為92.6 %；無水三氯化鋁（批號：K1505035，阿拉?。粺o水乙酸鈉（批號：J1523067，阿拉?。?；冰醋酸（批號：H2004148，阿拉丁）；L-抗壞血酸（維生素C，批號：SLBS0712V，Sigma）；DPPH（批號：STBG8547，Sigma-Aldrich）；ABTS（批號：SLBK9616V，SIGMA）；過硫酸鉀（K2S2O8，批號：L1509054，阿拉?。籔BS pH 7.4緩沖液（批號：8120122，Gibco）。

1.2 儀器

搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺林大機械有限公司）；萬分之一分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；離子酸度計（pH計，Thermo）；紫外可見分光光度計（日本島津）。

2 方法

2.1 三叉苦總黃酮提取方法比較

2.1.1 加熱回流法 精密稱取三叉苦藥材粉末1 g置入錐形瓶，加入80 %乙醇溶液50 ml浸泡30 min后稱重，加熱回流提取30 min后補足失重，濾過，取續(xù)濾液即得三叉苦提取液。

2.1.2 超聲提取法 精密稱取三叉苦藥材粉末1 g，置入錐形瓶，加入80 %乙醇溶液50 ml浸泡30 min后稱重，超聲提取30 min后補足失重，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2 三叉苦總黃酮回流提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 供試品溶液制備 精密稱取三叉苦藥材粉末1 g，置入錐形瓶，加入80 %乙醇溶液50 ml浸泡30 min之后稱重，加熱回流提取30 min后補足失重，濾過，取續(xù)濾液即得到三叉苦提取液。

2.2.2 對照品溶液制備 稱取蘆丁對照品適量，加入甲醇制成每1 ml含0.2 mg蘆丁對照品溶液，取續(xù)濾液即得到對照品溶液。

2.2.3 顯色條件 本實驗檢測三叉苦提取液中總黃酮含量主要采用三氯化鋁-醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（AlCl3-HAc-NaAc）顯色法[7]。精密移取1.0 ml供試品溶液，置入10 ml量瓶，分別加入0.1 mol/L AlCl3溶液和NaAc-HAc（pH 5.2）溶液1 ml，純水定容后顯色15 min，于415 nm波長處檢測吸光值。

2.2.4 標準曲線的繪制 依次移取蘆丁對照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 ml，轉移至20 ml量瓶，按2.1.3項下方法顯色測定?；貧w方程為y=1.2861x+0.0043，R2=0.9992，表明對照品溶液在4.00～24.00 μg/ml范圍內(nèi)，吸光度與濃度線性關系良好。

2.2.5 重復性試驗 精密稱藥材粉末6份，按2.2.1項下進行制備，取1 ml，置入10 ml量瓶，按2.1.3項下顯色后測定各溶液中的吸光度。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取2.2.1項下的總黃酮溶液1 ml，置入10 ml量瓶，顯色后平行測定6次吸光度。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2.1”項下的總黃酮溶液1 ml置入10 ml量瓶，顯色后，于0，10，20，30，40，50，60，90，120，150，180 min測定吸光度。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密吸取6份總黃酮含量已知的供試品溶液1 ml，加入蘆丁對照品溶液適量，顯色后測定吸光度。

2.3 三叉苦總黃酮的單因素試驗

2.3.1 乙醇體積分數(shù) 按2.1.1項下制備方法，固定料液比為50:1、提取時間30 min，考查乙醇體積分數(shù)為50 %，60 %，70 %，80 %，95 %條件下的含量。

2.3.2 料液比 按供試品溶液制備方法，固定乙醇體積分數(shù)為70 %，提取時間30 min，考查料液比為10，25，50，75，100 ml/g條件下的含量。

2.3.3 提取時間 按供試品溶液制備方法，固定液料比為50 ml/g，乙醇體積分數(shù)為70 %，考查提取時間為15，30，60，90，120 min條件下的含量。

2.4 星點設計響應面法

使用Design Expert 12.0軟件基于單因素考察的結果，以表1所列出條件為考察范圍，采用星點設計進行三因素五水平的響應面試驗，具體試驗設計見表1。

表1 三因素五水平星點設計響應面試驗表

2.5 體外抗氧化活性測定

2.5.1 三叉苦總黃酮對DPPH的清除能力 將三叉苦提取液旋蒸成濃縮液（1 g/ml）后用真空冷凍干燥機制成凍干粉，加90 %乙醇配成濃度為50，100，250，500，750，1000 μg/ml樣品溶液，分別加入3.6 ml DPPH（0.2 mmol/L）溶液，混勻后避光靜置30 min，于λ=517 nm波長處測定吸光度值[4]，按樣品操作方法平行操作3次。

DPPH自由基清除率（%）=(A0-Ai)/A0×100 %

式中：A0為DPPH溶液與溶劑混合液的吸光度值；Ai為DPPH溶液與供試品溶液反應后的吸光度值。

2.5.2 三叉苦總黃酮對ABTS自由基的清除能力 將ABTS儲備液（7.4 mmol/L）與K2S2O8儲備液（2.6 mmol/L）等體積混勻后，避光、常溫靜置12 h，PBS稀釋成吸光值0.7±0.02，即為ABTS工作液。

將三叉苦提取液旋蒸成濃縮液（1 g/ml）后用真空冷凍干燥機制成凍干粉，加90 %乙醇配成濃度分別為50，100，250，500，750，1000 μg/ml樣品溶液，取0.8 ml ABTS工作液分別與0.2 ml不同濃度樣品溶液混勻，常溫避光靜置6 min，測定734 nm處的吸光值[9]，按樣品操作方法平行操作3次。

ABTS自由基清除率（%）=(A0-Ai)/A0×100 %

式中：A0為ABTS工作液與溶劑混合液的吸光度值；Ai為ABTS工作液與供試品溶液反應后的吸光度值。

3 結果與分析

3.1 總黃酮含量測定結果

加熱回流及超聲法提取結果比較表明，加熱回流提取的含量測定結果比超聲提取法高2.49 mg/g，為提高提取率，故選用加熱回流作為提取方式。

重復性試驗中吸光度的RSD為1.7 %，表明該方法重復性良好；精密度試驗中吸光度的RSD為1.14 %，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗中吸光度的RSD為1.72 %，表明總黃酮溶液在顯色后180 min內(nèi)穩(wěn)定性良好；加樣回收率試驗中吸光度的平均加樣回收率為103.64 %，RSD為1.63 %，表明該方法可用于總黃酮的含量測定。

3.2 單因素試驗結果

3.2.1 不同乙醇體積分數(shù)的影響 乙醇體積分數(shù)對提取物中總黃酮含量的影響見圖1。由圖1可見，在一定濃度范圍內(nèi)，乙醇體積分數(shù)濃度的增加與三叉苦總黃酮含量成正比，當乙醇體積分數(shù)達70 %時，含量不再增加，此時含量最高為27.42 mg/g。濃度超過70 %后含量反而降低，可能與溶出雜質有關。因此選擇乙醇體積分數(shù)為70 %為最佳條件。

圖1 乙醇體積分數(shù)考察

3.2.2 液料比的影響 液料比對提取物中總黃酮含量的影響見圖2。由圖2可見，在一定范圍內(nèi)，液料比與總黃酮含量成正比，當液料比為75 ml/g時含量達到最高，超過之后不再增加。因此，液料比為75 ml/g時最佳。

3.2.3 回流提取時間的影響 回流提取時間對提取物中總黃酮含量的影響見圖3。由圖3可見，當液料比為75 ml/g，乙醇體積分數(shù)70 %時，對提取時間考察發(fā)現(xiàn)，30 min時總黃酮含量最高，30～120 min含量呈緩慢增加的趨勢，最終120 min和30 min含量相近。可能因為黃酮類物質在加熱前浸泡的30 min內(nèi)已經(jīng)大量溶出，使總黃酮提取較完全[10]。因此最佳回流時間確定為30 min。

圖3 提取時間考察

綜上，最佳提取條件為：乙醇體積分數(shù)70 %，液料比75 ml/g，提取時間30 min，在該條件下三叉苦總黃酮的提取率較高且較為節(jié)約能源。

3.3 響應面分析法試驗結果

基于表1的設計因素水平，結合單因素試驗考察結果，以總黃酮提取率（Y）為因變量，乙醇體積分數(shù)（A）、液料比（B）、提取時間（C）為自變量進行三因素五水平試驗。

表2 星點設計響應面試驗結果

將所得數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到的回歸方程為Y=2.75+0.0883×A+0.0434×B+0.0439×C-0.0488×AB+0.0287×AC-0.0188×BC-0.0316×A2+0.0301×B2+0.0284×C2（R2=0.8648），擬合度良好，相關系數(shù)較高，方差分析中的模型P＜0.05，表明模型具有統(tǒng)計學意義；與此同時，失擬項P＞0.05，表明失擬項不明顯。

響應面曲線的彎曲程度與該因素對響應值的影響成正比；曲線平滑則表明該因素影響不顯著[8]。圖4表明響應面起伏坡度較大，乙醇體積分數(shù)和料液比對三叉苦總黃酮含量測定的影響較大；圖6可見響應面較為平緩，料液比和提取時間的交互作用較小。此結果與方差分析一致。因此乙醇體積分數(shù)的影響值大于液料比，液料比的影響值大于提取時間。

圖4 乙醇體積分數(shù)和液料比對總黃酮含量的響應面圖

圖6 料液比和提取時間對總黃酮含量的響應面圖

3.4 最佳提取工藝及驗證試驗

在以下范圍內(nèi)預測最佳提取條件：乙醇體積分數(shù)50 %～95 %，液料比10～50 ml/g，提取時間10～30 min。通過星點設計結合實驗表明，當乙醇體積分數(shù)為90 %，液料比為10 ml/g，提取時間為30 min時為最佳組合因素。對上述條件進行驗證發(fā)現(xiàn)總黃酮提取率實測值2.99 %，與預測值3.25 %偏差較小，表明模型能較好預測三叉苦中黃酮得率，認為該優(yōu)化工藝較穩(wěn)定可靠。

3.5 三叉苦總黃酮清除DPPH的能力

三叉苦總黃酮的DPPH自由基清除率見圖7。由圖7可見，當質量濃度為1 mg/ml時，三叉苦總黃酮的DPPH自由基清除率為47.11 %，三叉苦總黃酮清除DPPH的能力與質量濃度成正比。維生素C的IC50值為109.5 μg/ml，清除率可達90 %，表明三叉苦提取物除DPPH自由基的能力弱于維生素。

圖7 三叉苦提取物對DPPH自由基清除率的影響

3.6 ABTS自由基清除能力測定

三叉苦醇提物的ABTS自由基清除率見圖8。由圖8可見，當質量濃度為100 μg/ml時，三叉苦醇提物的ABTS自由基清除率與維生素C相近，質量濃度增加至250 μg/ml則與維C的清除能力相當。結果表明，三叉苦提取物具有較好的清除ABTS自由基的作用。

圖8 三叉苦提取物對ABTS自由基清除率的影響

4 結論

目前對于三叉苦響應面法設計的研究報道較少，三叉苦的黃酮類成分具有較好的抗氧化作用，本實驗通過比較加熱回流和超聲兩種提取方式，結果表明加熱回流的含測值比超聲高出2.49 mg/g，因此選擇加熱回流提取三叉苦總黃酮，并運用響應面法對提取工藝中常見的3個因素進行考察并優(yōu)化，篩選出三叉苦總黃酮的最佳工藝。結果表明最佳條件為：乙醇體積分數(shù)90 %，液料比10 ml/g，提取時間30 min。按照此條件下三叉苦總黃酮含測值為27.57 mg/g，即總黃酮得率為2.99 %，與預測值3.25 %差距較小，表明星點設計建立的數(shù)學模型對實際的試驗結果可擬合，表明該提取工藝有較強的可行性。

抗氧化活性相關測定試驗表明，當三叉苦總黃酮提取物濃度達到250 μg/ml時，對ABTS的清除能力與維C相當，對DPPH的清除能力與濃度存在量效關系，表明其具有較好的抗氧化活性，可應用于開發(fā)功能食品或藥品等。