王 飛，張 禾，蔡淯涵，黃中佐，嚴沛潔，王李格，孫 鴻，李復(fù)煌，何 誠*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.北京市畜牧總站，北京 100107；3. 北京優(yōu)帝鴿業(yè)有限公司，北京 100188)

鴿毛滴蟲(Trichomonasgallinae,T.gallinae)屬毛滴蟲科(Trichomonadidae)、毛滴蟲屬(Trichomonas)，感染鴿造成鴿口腔黏膜潰瘍，呼吸困難[1-3]。白色念珠菌(Candidaalbicans)屬隱球菌目、假絲菌屬中的酵母樣真菌，鴿感染后死亡率高達40%[4]。臨床上防治毛滴蟲主要依賴甲硝唑、地美硝唑等硝基咪唑類藥物[5-6]。肉鴿白色念珠菌防治使用制霉菌素進行預(yù)防[7-8]。毛滴蟲和白色念珠菌耐藥現(xiàn)象日趨嚴重，嚴重威脅著食品安全[4]。

卵黃抗體在治療消化道細菌、真菌以及寄生蟲感染方面具有其獨特的優(yōu)勢[9-10]，關(guān)于肉鴿毛滴蟲與白色念珠菌卵黃抗體的相關(guān)臨床應(yīng)用報道較少。因此，本項目制備鴿毛滴蟲與白色念珠菌二聯(lián)卵黃抗體粉，評價其治療效果，旨在替代甲硝唑、制霉菌素的臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

180日齡產(chǎn)蛋母雞，由涿州牧豐家禽有限公司提供。白羽王鴿，25～30日齡，購自北京順義優(yōu)帝鴿業(yè)有限責(zé)任公司。沙氏液體培養(yǎng)基、牛肝浸粉培養(yǎng)基、胎牛血清、763A佐劑、95%β-1,3/1,6葡聚糖、泊洛沙姆188均購自北京廣達恒益公司。ab6753兔抗雞IgY HRP酶標(biāo)二抗購自Abcam公司。

1.2 毛滴蟲、白色念珠菌的分離和鑒定

采集肉鴿口腔拭子，添加1 mL生理鹽水，混勻，取100 μL接種牛肝浸液培養(yǎng)基，另取100 μL在沙氏瓊脂培養(yǎng)皿上涂布，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。毛滴蟲培養(yǎng)液用吉姆薩染色和鏡檢，白色念珠菌進行革蘭染色并鏡檢。

以特異性引物擴增基因組，毛滴蟲ITS/5.8S基因引物序列：ITS/5.8S-F(5′-GAACCTGCCGTTGGATCAGT-3′)，ITS/5.8S-R(5′-TTCAGT TCAGCGGGTCTTCC-3′)。白色念珠菌ITS1/4基因引物序列：F(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)，R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，回收陽性條帶，送北京華大基因有限公司測序驗證。

1.3 二聯(lián)滅活疫苗的制備

分別收集毛滴蟲、白色念珠菌培養(yǎng)物，超聲波破碎和加熱滅活。將毛滴蟲、白色念珠菌抗原分別稀釋為4×106個·mL-1和4×108cfu·mL-1，抗原比例1∶1混合，添加0.2%的β-1，3/1，6葡聚糖制備水相，以法國賽比克763A佐劑為油相。抗原液與油相按3∶7的比例混合、乳化，轉(zhuǎn)速為3 000 r·min-1，累積6 min，制備油佐劑疫苗。

1.4 卵黃抗體粉制備

以上述制備的二聯(lián)滅活疫苗皮下注射180日齡產(chǎn)蛋母雞，0.5 mL·只-1，間隔14 d，免疫 4次。收集免疫雞蛋，用自制ELISA試劑盒檢測卵黃抗體。收集卵黃抗體效價高的雞蛋蛋黃，加入1.0%泊洛沙姆溶液(pH=7.2)，4～8 ℃靜置72 h，獲得上清。去除上清液中的脂肪，使用30 kD的板式超濾器進行濃縮，濃縮后與麥芽糊精按一定比例混合，以真空低溫連續(xù)干燥機制成粉劑。

1.5 ELISA檢測毛滴蟲與白色念珠菌抗體

將3次免疫后14 d的鴿血清作為陽性對照，對照組鴿血清作為陰性對照，對抗原包被濃度、一抗稀釋度、一抗反應(yīng)時間、二抗稀釋度、二抗反應(yīng)時間等參數(shù)進行優(yōu)化。選取陽性值接近于1，且P/N最高的優(yōu)化條件作為試劑盒推薦方法。

1.6 肉鴿人工感染和治療試驗

動物模型：30只25～30日齡健康白羽王鴿隨機分為3組，每組10只肉鴿，1組肉鴿灌服生理鹽水為對照，2組肉鴿分別灌服1×106個毛滴蟲和1×108cfu白色念珠菌，連續(xù)5 d， 剖檢肉鴿，觀察口腔和嗉囊病理變化。

治療試驗：40只肉鴿隨機分為8組，每組5只，4組人工感染1×106個毛滴蟲，另外4組人工感染1×108cfu白色念珠菌，持續(xù)感染5 d后,4個毛滴蟲感染組分別給予0.1 g甲硝唑·只-1，1 g卵黃抗體·只-1，0.5 g卵黃抗體·只-1，0 g卵黃抗體·只-1進行治療。4個白色念珠菌感染組分別給予20萬單位制霉菌素·只-1，1 g卵黃抗體·只-1，0.5 g卵黃抗體·只-1，0 g卵黃抗體·只-1進行治療，連續(xù)治療5 d。記錄肉鴿的發(fā)病率以及死亡率。給藥后第7天，采集口腔拭子，分離毛滴蟲與白色念珠菌并進行計數(shù)。剖檢和觀察口腔、嗉囊黏膜的病理變化。

1.7 統(tǒng)計分析

原始數(shù)據(jù)用Excel 2010進行處理，運用IBM SPSS Statistics 22對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，利用t-test比較毛滴蟲與白色念珠菌不同免疫次數(shù)間卵黃抗體水平差異以及給藥后不同組別毛滴蟲與白色念珠菌計數(shù)的差異，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 毛滴蟲、白色念珠菌分離和鑒定

光學(xué)顯微鏡下毛滴蟲呈橢圓形或梨形，前端有4根鞭毛，后方有1根鞭毛。白色念珠菌在培養(yǎng)基上呈現(xiàn)表面光滑的白色或乳白色菌落，革蘭染色呈染色不均勻的橢圓形。用毛滴蟲和白色念珠菌特異性引物擴增片段大小與目的片段大小相符，分別為400和500 bp左右，見圖1A、B。陽性條帶測序鑒定為毛滴蟲與白色念珠菌。

A.毛滴蟲ITS特異基因擴增結(jié)果;M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，分離株1和2為毛滴蟲陽性樣本；B.白色念珠菌ITS1/4特異基因檢測結(jié)果; M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，分離株3和4為白色念珠菌陽性樣本A.PCR result of ITS gene of Trichomonas gallinae；M.DNA marker, Isolates 1 and 2 were positive samples of Trichomonas gallinae；B. PCR result of ITS1/4 gene of Candida albicans；M. DNA marker，Isolates 3 and 4 were positive samples of Candida albicans圖1 毛滴蟲和白色念珠菌PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR results of Trichomonas gallinae and Candida albicans

2.2 ELISA抗體檢測方法建立

毛滴蟲抗體的檢測優(yōu)化條件：抗原包被濃度為1×106個·mL-1；一抗稀釋度為1∶100；一抗反應(yīng)條件為37 ℃ 1 h；二抗稀釋度為1∶20 000；二抗反應(yīng)條件為37 ℃30 min。白色念珠菌ELISA法抗原包被濃度為1×107cfu·mL-1；二抗稀釋度為1∶30 000；其余檢測條件同毛滴蟲ELISA檢測方法。

優(yōu)化的ELISA法檢測蛋黃中毛滴蟲抗體,結(jié)果見圖2。第1次免疫后抗體上升(P<0.01)，第2次免疫后抗體上升到高峰，OD值>0.9。第3次和第4次免疫后抗體增加的趨勢低于第2次免疫。但與免疫前相比，免疫后抗體水平極顯著上升(P<0.01)。免疫后抗體持續(xù)時間達到60 d，OD值>0.85。白色念珠菌抗體上升趨勢與毛滴蟲抗體相似。第2次免疫抗體達到高峰，平均OD值為0.66。與免疫前相比，免疫后抗體水平極顯著上升(P<0.01)，如圖2所示。濃縮后毛滴蟲和白色念珠菌抗體OD值分別可達2.95和2.65。

與免疫前相比，***. P<0.01Compared with pre-immunization，***. P<0.01圖2 毛滴蟲與白色念珠菌卵黃抗體檢測Fig.2 Detecting yolk antibody against Trichomonas gallinae and Candida albicans

2.3 人工感染模型建立和治療試驗

動物模型：以分離的毛滴蟲與白色念珠菌分別感染肉鴿，5 d后，毛滴蟲接種組口腔發(fā)現(xiàn)黃色干酪物沉著，排黃綠色水樣稀糞。剖檢口腔和咽喉黏膜出現(xiàn)白色干酪樣沉著物，嗉囊附著黃色結(jié)節(jié)，發(fā)病率為80%。白色念珠菌接種組鴿精神沉郁，排水樣稀糞。嗉囊黏膜表面有一層白膜覆蓋，局部有潰瘍發(fā)生，發(fā)病率100%，死亡率30%，這顯示毛滴蟲和白色念珠菌人工感染肉鴿模型建立成功。

治療試驗：毛滴蟲0.5 g卵黃抗體組肉鴿精神狀態(tài)正常，個別肉鴿口腔和咽部黏膜有小潰瘍灶。1 g卵黃抗體組剖檢后口腔嗉囊無明顯病變。白色念珠菌0.5 g卵黃抗體組肉鴿狀態(tài)良好，個別有腹瀉癥狀，發(fā)現(xiàn)肉鴿嗉囊小潰瘍灶病變。相反，1 g卵黃抗體組剖檢后口腔和嗉囊無明顯病理變化?？瞻讓φ战M和甲硝唑、制霉菌素治療組肉鴿精神狀態(tài)良好，口腔和嗉囊無明顯病理病變。

依據(jù)報道的口腔和嗉囊病變評分指數(shù)[11]，甲硝唑組和空白對照組評分為0，毛滴蟲感染組口腔病變評分為2.2，卵黃抗體組與毛滴蟲感染組口腔病變差異顯著(P<0.05)，其中，1 g卵黃抗體組差異極顯著(P<0.01)，病變評分為0.4。制霉菌素組和空白對照組嗉囊病變評分為0，卵黃抗體組和白色念珠菌感染組嗉囊病變差異顯著(P<0.05)。白色念珠菌感染組評分為2.0，白色念珠菌1 g卵黃抗體組評分最低為0.2?？诜煌瑒┝康穆腰S抗體后，鴿毛滴蟲病原載量顯著降低，1 g卵黃抗體組(3.0×10個·拭子-1)、0.5 g卵黃抗體組(2.0×102.1個·拭子-1)與人工感染對照組(2.5×105個·拭子-1)相比差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。1 g卵黃抗體組與制霉菌素組白色念珠菌載量無顯著差異，0.5 g卵黃抗體組與制霉菌素組差異顯著(P<0.05)。1 g卵黃抗體組白色念珠菌載量(4.0×10 cfu·拭子-1)和0.5 g卵黃抗體組白色念珠菌載量(1.2×102.0cfu·拭子-1)較人工感染組(2.1×106cfu·拭子-1)極顯著(P<0.01)降低。

3 討 論

肉鴿口服卵黃抗體對人工感染毛滴蟲、白色念珠菌都有良好的治療效果，且呈現(xiàn)一定的劑量-療效關(guān)系。1 g卵黃抗體組治療毛滴蟲感染的效果與甲硝唑治療效果接近，治療白色念珠菌感染的效果與制霉菌素的療效無差別。本研究證明研制的口服抗體粉可以實現(xiàn)完全替代抗菌素，為肉鴿產(chǎn)業(yè)健康養(yǎng)殖提供一種新的替代產(chǎn)品。

二聯(lián)抗體粉防治毛滴蟲、白色念珠菌感染的機制：1)卵黃抗體經(jīng)過口腔、嗉囊吸收后，直接作用于寄生的2種病原菌表面，抑制2種病原的增殖，減輕了病原的危害[12-13]；2)二聯(lián)抗體通過損傷的胃腸道黏膜直接吸收進入血液循環(huán)，直接抑制肺、肝中的毛滴蟲，減少毛滴蟲對肺和肝的損傷。抗體吸收后直接減輕白色念珠菌造成的菌血癥[14]。二聯(lián)抗體粉的優(yōu)勢：1)產(chǎn)蛋母雞持續(xù)生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本和使用成本;其次，利用真空低溫干燥技術(shù)制備的抗體粉，保持了抗體活性，方便存儲和運輸，可以實現(xiàn)抗體粉的產(chǎn)業(yè)化[15];2)抗體粉可以飲水，也可以添加到飼料中;3)抗體不會引起耐藥性和副作用，是一種綠色可持續(xù)性的蛋白類抗體添加劑[9]。

4 結(jié) 論

成功制備出毛滴蟲與白色念珠菌二聯(lián)卵黃抗體粉，有望替代甲硝唑和制霉菌素等抗菌素，保證肉鴿食品安全。