陳永杰，劉健新，李慧子，鐘文霞，李保建，皮墨霖，寧章勇,2*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州 510642； 2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術(shù)廣東省實驗室茂名分中心，茂名 525000)

干擾素刺激基因(stimulator of interferon genes，STING)是胞質(zhì)DNA感受器，在機體的天然免疫中發(fā)揮著重要作用[1-2]。當DNA病毒、細菌等侵入細胞時，細胞質(zhì)中的環(huán)腺苷酸鳥苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，c GAS)與dsDNA結(jié)合，產(chǎn)生內(nèi)源性的環(huán)化二核苷酸cGAMP并介導STING構(gòu)象發(fā)生改變且被激活，進而誘導Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，啟動炎癥因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄表達[3-4]。此外，STING自身也可以直接結(jié)合DNA并通過二聚化和易位激活STING-TBK-1-IRF3信號轉(zhuǎn)導途徑，從而觸發(fā)一系列信號級聯(lián)[5-6]。研究表明，腺病毒、牛痘病毒、乳頭瘤病毒和Ⅰ型皰疹病毒等均可以激活STING信號通路，誘導Ⅰ型IFN的表達拮抗病毒的增殖[7-11]。在敲除小鼠STING基因后，小鼠機體內(nèi)感染HBV的滴度明顯升高[12]，這提示STING具有限制DNA病毒增殖的作用。探索STING在不同病毒感染和增殖中的作用，為開發(fā)基于STING蛋白的新型抗病毒藥物提供了可能。

羊口瘡(orf)是由羊口瘡病毒(orf virus，ORFV)引起的一種急性、接觸性人畜共患傳染病，不僅嚴重影響?zhàn)B羊業(yè)的健康發(fā)展，而且威脅人類健康[13-16]。ORFV是痘病毒科副痘病毒屬dsDNA病毒[17]，該病毒及其編碼蛋白可以通過拮抗宿主的天然免疫，在同一動物發(fā)生重復感染[18]。ORFV為什么可以反復突破機體的免疫系統(tǒng)？機體的天然免疫分子對ORFV的具有什么樣的作用？這些問題是今后探索ORFV致病機制的重要研究方向。作為重要的天然免疫核心分子，STING在ORFV感染中的作用如何，該蛋白對ORFV的復制有何影響仍然未知，這也是人們希望探索的問題。

本研究通過構(gòu)建ORFV感染OFTu細胞的模型，獲得了STING及其相關(guān)基因的動態(tài)表達數(shù)據(jù)，分析了OFTu細胞過表達和抑制表達STING對ORFV增殖的影響。研究結(jié)果可為深入理解STING在ORFV復制中的作用提供理論依據(jù)，也可為深入探索ORFV感染和致病的分子機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及耗材

RNAiso Plus Total RNA提取試劑盒、LATaqDNA聚合酶、E.coliJM109感受態(tài)細胞、pMDTM18-T Vector、DL500 marker、DL2000 marker、DL5000 marker、限制性內(nèi)切酶BglⅡ、EcoRI和HindⅢ，熒光定量SYBR Premix ExTaqⅡ等均購自寶生物工程(大連)有限公司。胎牛血清和MEM細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司。L-谷氨酰胺、0.25%胰酶-EDTA、青霉素/鏈霉素雙抗、RIPA裂解液等均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。兔抗β-actin IgG單克隆抗體購自博士德生物有限公司。兔抗GFP IgG多克隆抗體購自SANTA CRUZ生物有限公司。pEGFP載體、pSuper.Retro.Neo+GFP載體、OFTu細胞、GDZC株ORFV和兔抗羊STING多克隆抗體[19]由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院病理教研室保存。

1.2 STING過表達質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)本實驗室提交至NCBI的山羊STING基因(KR060015)的mRNA序列[20]設(shè)計STING引物，上游：5′-ATATATAGATCTCGCCACCATGCCTCACTCCAGCC-3′(下劃線為BglⅡ酶切位點)，下游：5′-GATCACGAATTCGGAAGACATCTGAGCGG-3′(下劃線為EcoR I酶切位點)。采用50 μL 體系進行PCR擴增：10×LATaqBuffer Ⅱ 5 μL，dNTP Mixture 8 μL(2.5 μmol·L-1)，pMD-18T-STING質(zhì)粒1 μL(50 ng·μL-1)，上下引物各2 μL(10 μmol·L-1)，LATaqDNA聚合酶0.5 μL， 加ddH2O補至50 μL。PCR反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個 循環(huán)；72 ℃ 10 min。用BglⅡ和EcoRⅠ對回收PCR產(chǎn)物進行酶切，并連接到具有相同酶切位點的pEGFP-N1載體中，構(gòu)建pEGFP-N1-STING重組質(zhì)粒。

1.3 STING抑制表達質(zhì)粒的構(gòu)建

參考shRNA設(shè)計原則[21]，使用Oligoengine Workstation 2.0設(shè)計2條特異性靶向STING基因的shRNA，分別命名為shRNA-ST-1和shRNA-ST-2，同時設(shè)計1條陰性對照序列即shRNA-ST-0，并用BLAST驗證其特異性。寡核苷酸序列見表1。

表1 shRNA-STING寡核苷酸序列

合成的2對shRNA和1對陰性對照shRNA單鏈模板用超純水稀釋為2 mg·L-1，shRNA上下游引物各取1 μL與48 μL的退火緩沖液(100 mmol·L-1乙酸鈉，30 mmol·L-1HEPES-KOH pH7.4，2 mmol·L-1乙酸鎂)混合，退火條件為90 ℃ 4 min，70 ℃ 10 min，冷卻至10 ℃，用BglⅡ和Hind Ⅲ酶切pSuper.Retro.Neo+GFP質(zhì)粒并膠回收，然后將退火產(chǎn)物與膠回收產(chǎn)物連接，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細胞中，提取質(zhì)粒用BglⅡ和Hind Ⅲ酶切鑒定，然后將陽性質(zhì)粒送公司測序驗證。

1.4 實時熒光定量PCR

將提取的細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時熒光定量PCR方法檢測STING、cGAS、TBK1、IRF3、IRF7、IL-6、IL-1β、IFN-β、IFN-α、RIG-1、DDX41、IFI16和TNF-α的轉(zhuǎn)錄情況，引物序列見表2。mRNA的相對轉(zhuǎn)錄量采用2-ΔΔct方法計算，同時以β-actin作為內(nèi)參對照基因。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

OFTu細胞的培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染根據(jù)本實驗室建立的方法[22]進行。將OFTu以2×105～3×105個·孔-1接種于6孔板，細胞融合率達到80%～90%時使用LipofectamineTM2000進行轉(zhuǎn)染。過表達組，使用2.5 μg pEGFP-N1-STING質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，并轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒作為陰性對照；干擾表達組，使用2.5 μg shRNA-ST-1、shRNA-ST-2和shRNA-ST-0進行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后6 h更換培養(yǎng)基，24 h時觀察熒光強度。

1.6 Western blot蛋白檢測

將細胞樣本經(jīng)處理后進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫孵育1.5 h，TBST洗滌硝酸纖維膜3次后，加入STING一抗(1∶500)，β-actin一抗(1∶2 000)，4 ℃過夜，二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h，洗滌后置于Tanon-5200化學發(fā)光分析儀進行曝光。以β-actin蛋白為內(nèi)參，使用Image J軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

表2 用于實時定量熒光PCR引物

1.7 不同STING表達狀態(tài)的OFTu細胞病毒滴度的測定

將OFTu接種于含10%胎牛血清MEM的6孔板中，細胞融合度達到80%～90%時，分別轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒(2.5 μg·孔-1)。為了評估ORFV在具有STING過量表達或干擾表達的細胞模型中的復制情況，將pEGFP-N1-STING和pEGFP-N1或shRNA-ST-1、shRNA-ST-2和shRNA-ST-0轉(zhuǎn)染的OFTu細胞用ORFV感染(MOI=1)。分別在感染后6、12、24、36、48、72 h收集病毒上清液和細胞樣品，使用Reed-Muench方法檢測每個時間點病毒上清液的TCID50。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 ORFV感染OFTu細胞對STING、cGAS、TBK1、IRF3、IRF7、IL-6、IFN-β、IL-1β和TNF-α基因轉(zhuǎn)錄的影響

ORFV(MOI=1)感染OFTu細胞后，real-time PCR檢測不同時間點STING、cGAS、TBK1、IRF3、IRF7、IL-6、IFN-β、IL-1β和TNF-α基因轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果顯示：這些基因的轉(zhuǎn)錄呈現(xiàn)出不同程度的升高。STING、cGAS、TBK1、IL-6的轉(zhuǎn)錄在細胞被感染后24、36和48 h顯著上升(P<0.01或P<0.05)，而IRF3、IRF7、IFN-β、IL-1β和TNF-α在病毒感染細胞后36和48 h顯著上升(P<0.01或P<0.05，圖1)。

a. STING; b. cGAS; c. TBK1; d. IRF3; e. IRF7; f. IL-6; g. IFN-β; h. IL-1β; i. TNF-α圖1 ORFV感染OFTu細胞后相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄Fig.1 Gene transcription of related genes in OFTu cells infected with ORFV

2.2 OFTu細胞過表達STING對RIG-1、DDX41、IFI16、IRF3、IRF7、IL-6、TNF-α、IFN-α和IFN-β基因轉(zhuǎn)錄的影響

將pEGFP-N1-STING質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至OFTu細胞48 h后，提取細胞總蛋白，Western blot檢測其蛋白表達情況，結(jié)果顯示，pEGFP-N1-STING組的STING蛋白水平顯著高于pEGFP-N1對照組(圖2a)，過表達率為225%(圖2b)。STING的過表達使RIG-1、DDX41、IFI16、IRF3、IRF7、IL-6、TNF-α、IFN-α和IFN-β的轉(zhuǎn)錄顯著升高(P<0.01)(圖2c)。與轉(zhuǎn)染空載體組相比，TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平升高了54.6倍(P<0.01)，IFN-β升高43.5倍(P<0.01)，IFN-α升高41.7倍(P<0.01)，IL-6升高33倍(P<0.01)，IRF7升高29.2倍(P<0.01)，IRF3增加23.5倍(P<0.01)，RIG-1增加6.7倍(P<0.01)，IFI16增加4.9倍(P<0.01)，而DDX41增加4.3倍(P<0.01)。

2.3 ORFV感染過表達STING的OFTu細胞對TBK1、IRF3、IFN-β和TNF-α基因轉(zhuǎn)錄以及ORFV增殖的影響

ORFV感染過表達STING的細胞后，TBK1、IRF3、IFN-β和TNF-α轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比變化明顯。TBK1在6 h時顯著下降(P<0.01)，但在48 h時顯著增加(P<0.01)；IRF3在12、24和48 h時顯著增加；IFN-β在6 h時顯著增加(P<0.01)，而在12 h后顯著降低(P<0.05)；TNF-α在6 h時顯著升高(P<0.01)， 而在12 h時顯著降低(P<0.01)，并在12 h后顯示出增加的趨勢，在48 h時顯著增加(P<0.01) (圖2 d～g)。ORFV感染過表達STING細胞后，對不同時間點的病毒滴度進行測定，結(jié)果顯示，在所有檢測時間點上，過表達STING組的ORFV 滴度均低于陰性對照組的滴度，尤其是在48 h (P<0.05)和72 h(P<0.01)(圖2h)。

a. Western blot檢測OFTu細胞轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒后STING蛋白表達水平；b. Image J分析STING蛋白過表達效率； c.OFTu細胞過表達STING后RIG-1、DDX41、IFI16、IRF3、IRF7、IL-6、TNF-α、IFN-α和IFN-β的mRNA表達水平；d～g. ORFV感染過表達STING的OFTu細胞對TBK1、IRF3、IFN-β和TNF-α的mRNA表達的影響；h. ORFV感染過表達STING的OFTu細胞后病毒的生長曲線a. The expression of STING protein was detected by Western blot in OFTu cells transfected with overexpressed plasmid; b. The overexpression efficiency of STING protein was analyzed by Image J; c. The mRNA expression levels of RIG-1, DDX41, IFI16, IRF3, IRF7, IL-6, TNF-α, IFN-α and IFN-β in OFTu cells after overexpression of STING; d-g. Effect of ORFV infection of overexpressing STING OFTu cells on mRNA expression of TBK1, IRF3, IFN-β and TNF-α; h. The growth curve of ORFV virus after infection with STING overexpressing OFTu cells圖2 ORFV感染過表達STING的OFTu細胞后增強了TBK-1、IRF3、IFN-β、TNF-α的表達并抑制ORFV的復制Fig.2 ORFV infection of the OFTu cell overexpressing STING enhanced the expression of TBK-1, IRF3, IFN-β and TNF-α and inhibited the replication of ORFV

2.4 ORFV感染干擾表達STING的OFTu細胞對TBK-1、IRF3、IFN-β和TNF-α基因轉(zhuǎn)錄以及ORFV增殖的影響

核苷酸測序證實重組質(zhì)粒sh-RNA-ST-0、sh-RNA-ST-1和sh-RNA-ST-2已成功構(gòu)建(圖3a)。將重組質(zhì)粒shRNA-ST-0、shRNA-ST-1和shRNA-ST-2轉(zhuǎn)染到OFTu細胞48 h后提取細胞總蛋白，Western blot檢測STING蛋白，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染shRNA-ST-1和shRNA-ST-2組的STING蛋白水平均低于shRNA-ST-0對照組，說明構(gòu)建的質(zhì)?？梢杂行TING蛋白表達進行干擾(圖3b)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)shRNA-ST-1干擾了70%的蛋白表達，shRNA-ST-2則為40%(圖3c)，基于此，后續(xù)選擇shRNA-ST-1進行試驗。

在STING干擾表達的感染細胞中，TBK-1、IRF3、IFN-β和TNF-α的表達顯著降低(圖3 d～g)。TBK1、IFN-β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄在6～48 h顯著降低(P<0.05或P<0.01)，而IRF3在24～48 h時顯著降低(P<0.01)。ORFV感染干擾表達STING的OFTu細胞后，在所有檢測時間點，STING干擾組的ORFV的滴度均高于陰性對照組的滴度(圖3h)，但差異不顯著(P>0.05)。

a.重組干擾STING表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定,1、2、3、4泳道分別為pSUPER.retro.neo+GFP載體、shRNA-ST-0、shRNA-ST-1、shRNA-ST-2；b. Western blot檢測干擾STING表達后STING蛋白的表達水平；c. Image J分析STING蛋白干擾效率；d～g. ORFV感染干擾表達STING后的OFTu細胞對TBK1、IRF3、IFN-β和TNF-α的mRNA表達的影響；h. ORFV感染干擾STING的OFTu細胞后病毒的生長曲線a. Identification of recombination interference STING expression plasmid with double enzyme digestion, Lanes 1, 2, 3 and 4 were pSUPER.retro.neo+GFP vector, shRNA-ST-0, shRNA-ST-1, shRNA-ST-2 respectively；b. STING protein expression level was detected by Western blot after interference with STING expression; c. The interference efficiency of STING protein was analyzed by Image J; d-g. Effects of interfering expression of STING OFTu cells infected with ORFV on mRNA expression of TBK1, IRF3, IFN-β and TNF-α; h. The growth curve of ORFV virus after infection with OFTu cells interfering with STING圖3 ORFV感染干擾表達STING的OFTu細胞后下調(diào)了TBK-1、IRF3、IFN-β、TNF-α的表達并促進ORFV的復制Fig.3 ORFV infection with the OFTu cells with interference expression of STING downregulated the expression of TBK-1, IRF3, IFN-β and TNF-α and promoted the replication of ORFV

3 討 論

宿主的天然免疫系統(tǒng)可以有效地識別侵入的病原體并啟動宿主免疫反應，進而在病原清除和免疫中發(fā)揮重要作用。宿主細胞通過模式識別受體(pathogen-recognition receptors, PRRs)激活宿主的天然免疫反應，誘導干擾素、抗病毒因子和促炎細胞因子的產(chǎn)生，從而限制病原的擴散[2,23-28]。STING作為機體天然免疫信號通路中重要的核心蛋白，在防御病原體入侵、介導Ⅰ型干擾素產(chǎn)生過程中發(fā)揮著極其重要的作用，但STING在ORFV感染中的作用仍然不清楚。

本研究通過構(gòu)建細胞感染模型，分析了ORFV感染細胞后對STING及其相關(guān)基因表達的影響，探索了STING基因在干擾表達和過表達狀態(tài)下對ORFV在細胞上增殖的影響。結(jié)果顯示，ORFV感染OFTu細胞后顯著增加了STING、cGAS、TBK1、IRF3、IRF7、IL-6、IFN-β、IL-1β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄，這與HBV感染Li23細胞、HSV-1感染小膠質(zhì)細胞介導STING及相關(guān)基因表達顯著上升相一致[5, 7-8 ]。TBK1、IRF3、IFN-β和TNF-α是cGSA-STING信號通路中的重要表達因子，ORFV感染過表達STING的OFTu細胞后可以顯著增加TBK1、IRF3、IFN-β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄，ORFV感染干擾表達STING的OFTu細胞可以顯著減少TBK1、IRF3、IFN-β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄，這與之前研究HIV感染干擾表達STING蛋白的THP-1細胞可以抑制TBK-1-IRF3通路的結(jié)果相一致[11]。OFTu細胞在STING過表達狀態(tài)下感染ORFV，可以顯著抑制ORFV的復制，這與以前研究STING的過表達可以有效抑制巨噬細胞和肝細胞中乙型肝炎病毒復制的報道相一致[29]。同時，在STING干擾表達狀態(tài)下感染ORFV，則有助于病毒的復制，這也與敲除STING后則有助于人類巨細胞病毒[30]、單純皰疹病毒1[31]和乳頭瘤病毒[32]的增殖報道相一致。

4 結(jié) 論

STING通過上調(diào)OFTu細胞抗病毒因子的表達抑制了羊口瘡病毒的增殖，這進一步豐富了STING蛋白的抗病毒譜，也為深入探究STING蛋白在ORFV感染和復制中的作用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。