汪銘銳，吳俊花，王 飛，邵紅霞，3，錢 琨，3，葉建強(qiáng)，3，4，秦愛建，3，4*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；4.揚(yáng)州大學(xué) 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

雞傳染性貧血病毒(chicken infectious anemia virus, CIAV)屬圓環(huán)病毒科，是全世界范圍內(nèi)公認(rèn)的重要禽類病原體[1-3]。CIAV在雞群中主要以垂直傳播的方式進(jìn)行傳播，感染后會(huì)引起雞貧血及免疫器官發(fā)育不良，易導(dǎo)致疫苗免疫失敗，并常與其他免疫抑制病毒同時(shí)感染雞群[4-9]。CIAV基因組共包含3個(gè)開放閱讀框[10]，分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和非結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP3，VP2作為非結(jié)構(gòu)蛋白被認(rèn)為在VP1蛋白的組裝以及VP3蛋白的磷酸化中起重要作用[11-13]。在雞群感染CIAV后，僅需要2周就可檢測到針對VP2抗體的存在，因此可以作為檢測CIAV感染的重要靶標(biāo)抗原[14]。

已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道表達(dá)的重組VP2蛋白可以作為間接ELISA的檢測抗原[14-15]，檢測感染雞群中的VP2蛋白抗體，但特異性和靈敏性有待驗(yàn)證。目前，國內(nèi)針對該病的檢測試劑盒較少，且特異性尚有限，而國外的試劑盒價(jià)格十分昂貴，不利于大批量的檢測，因此建立一種特異性好，靈敏性高的檢測方法對我國CIAV的防控有重大意義。

mAb以及抗原表位的研究在疾病防控方面取得諸多成果，基于mAb建立的阻斷ELISA具有高度特異性，在諸多疾病的監(jiān)測中得以應(yīng)用[16-18]，因此制備針對CIAV VP2蛋白的mAb以及抗原表位的研究有助于CIAV防控。本研究通過原核表達(dá)VP2蛋白并免疫小鼠制備mAb，對研制mAb識(shí)別的抗原表位進(jìn)行鑒定，為研究VP2蛋白在CIAV感染中的作用以及病毒檢測方法的建立提供了基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

CIAV海安分離株(HA9805)、低致病性禽流感病毒(LPAIV)及其mAb 2A8、J亞群禽白血病病毒(ALV-J)及其mAb 5D3、馬立克病病毒(MDV)及其mAb BA4、pET-32a載體、MDCC-MSB1細(xì)胞、DF1細(xì)胞、CEF細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、Sf9細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、重組桿狀病毒rBac-CIAV-VP2、pCAGSS-VP2-Flag質(zhì)粒、大腸桿菌BL21 (DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存；6～8周齡BALB/c母鼠由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。Axy Prep基因組DNA小量試劑盒購自Axygen公司;膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；轉(zhuǎn)染試劑TransIT-LT1購自Mirus公司；FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG均購自Sigma公司；聚乙二醇(PEG1500)購自Roche公司；蛋白Marker、高保真酶購于諾唯贊公司，ECL發(fā)光顯色液購自NCM Biotech公司；mAb亞類鑒定試劑盒購自SouthernBiotech公司；RIPA裂解液(強(qiáng))購自康為世紀(jì)公司。

1.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建及VP2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

根據(jù)CIAV的VP2(NCBI序列號(hào)：M55918.1)的序列，設(shè)計(jì)合成了1對引物(EcoRⅠ-F:5′-CCGGAATTCATGCACGGGAACGGCG-3′,XhoⅠ-R:5′-CCGCTCGAGCACTATACGTACCGGGG-CG- 3′)，按照文獻(xiàn)[19]的方法培養(yǎng)CIAV，CIAV感染MSB1細(xì)胞48～72 h后收集細(xì)胞懸液提取基因組，以基因組為模板，PCR擴(kuò)增CIAV的VP2基因并克隆至原核表達(dá)載體pET-32a，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建表達(dá)菌株，同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)化pET-32a空載體組為對照。參考文獻(xiàn)[20]進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)：將重組菌加入含有氨芐青霉素的LB液體中過夜培養(yǎng)，以1∶100的比例接種于含有氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中，約3 h后(OD600 nm=0.6～0.8)加入IPTG使其終濃度為0.1 mmol·L-1誘導(dǎo)4 h，所得菌液離心后，使用PBS洗滌并以1∶5的比例重懸，冰浴裂解5 min，分別取上清和沉淀15 μL進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3 蛋白樣品的制備及小鼠免疫

按參考文獻(xiàn)[20]方法制備蛋白樣品并免疫小鼠。主要過程：將表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后考馬斯亮藍(lán)染色并充分脫色，切下目的蛋白條帶，將目的條帶置于凍干機(jī)中過夜凍干后，加入適量PBS研磨，直至樣品能順暢地通過1 mL注射器。取6周齡的雌性BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，免疫方式均為腹腔注射，第4次免疫后72 h按照常規(guī)方法，用聚乙二醇(PEG1500)融合。

1.4 IFA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞

用桿狀病毒rBac-CIAV-VP2感染Sf9細(xì)胞，72 h 后以預(yù)冷的丙酮乙醇(3∶2)固定，作為IFA篩選抗原進(jìn)行篩選：以雜交瘤上清為一抗，37 ℃孵育45 min，PBS洗4遍；再以FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1∶200稀釋)為二抗，37 ℃孵育45 min，PBS洗5遍， 最后滴加甘油于熒光顯微鏡下觀察。將pCAGGS-VP2-Flag轉(zhuǎn)染至DF1細(xì)胞，48 h后使用丙酮乙醇固定，用于陽性克隆的進(jìn)一步驗(yàn)證。3次篩選后，對陽性克隆進(jìn)行3次亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌抗CIAV VP2蛋白的雜交瘤細(xì)胞株。取雜交瘤培養(yǎng)上清，按照SouthernBiotech公司的mAb亞類鑒定試劑盒對制備的mAb進(jìn)行亞類鑒定。將陽性雜交瘤細(xì)胞株連續(xù)傳代15代；各代次凍存6個(gè)月后復(fù)蘇，并采用上述IFA檢測雜交瘤細(xì)胞中的mAb。

1.5 單抗腹水制備以及效價(jià)測定

取8周齡的BALB/c小鼠，腹腔注射石蠟油500 μL·只-1，2周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，每天觀察腹部變化，待腹部明顯膨大后，采集腹水。以rBac-CIAV-VP2感染的Sf9細(xì)胞為檢測抗原，將腹水倍比稀釋作為一抗，進(jìn)行IFA效價(jià)檢測。

1.6 Western blot鑒定

參考文獻(xiàn)[21]中的方法進(jìn)行Western blot的鑒定，將感染rBac-CIAV-VP2的Sf9細(xì)胞裂解產(chǎn)物、轉(zhuǎn)染pCAGGS-VP2-Flag的DF1細(xì)胞裂解產(chǎn)物以及原核表達(dá)的His-VP2蛋白分別與5×SDS Loading Buffer以4∶1混勻并煮沸5 min作為蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將硝酸纖維素膜置于5%脫脂乳中，37 ℃封閉1.5 h；以雜交瘤上清(1∶5稀釋)為一抗，37℃孵育1 h，PBST洗4遍；再以HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1∶30 000稀釋)為二抗，37 ℃孵育45 min，PBST洗5遍后,經(jīng)ECL發(fā)光顯色液顯色觀察。

1.7 mAb特異性鑒定

將感染ALV-J的DF1細(xì)胞、感染LPAIV的MDCK細(xì)胞、感染MDV的CEF細(xì)胞固定作為檢測原，IFA鑒定mAb的特異性，同時(shí)設(shè)置針對相應(yīng)病毒的抗體5D3(ALV-J)、2A8(LPAIV)、BA4(MDV)為陽性對照。

1.8 mAb識(shí)別抗原表位的鑒定

參考文獻(xiàn)[20]進(jìn)行表位鑒定：以PCR擴(kuò)增CIAVVP2基因的截短片段并連接入pET-32a表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入BL21(DE3)后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)截短蛋白，裂解菌體用于抗原表位的鑒定。參照“1.6”方法進(jìn)行Western blot分析，鑒定截短蛋白與mAb的反應(yīng)性，同時(shí)以鼠抗His標(biāo)簽抗體檢測蛋白是否成功表達(dá)。所用到的截短蛋白引物見表1。

1.9 mAb識(shí)別表位的保守性分析

參照GenBank中23株國內(nèi)外CIAV毒株VP2的氨基酸序列，登錄號(hào)分別為AAA91822.1、AAB06180.1、AAC58476.1、AAD09422.1、BAA77832.1、AAG34179.1、AAM20897.1、AAL79913.1、AAL99895.1、AAK83006.1、ABJ90437.1、AAZ73182.1、ADJ18276.1、AEN71111.1、AFZ94856.1、AGW323371、AID81956.1、AIZ75615.1、AIV09094.1、ANA51883.1、APQ44720.1、ASL68907.1、ATG84571.1，利用DNAStar分析以上序列，對抗體識(shí)別氨基酸序列進(jìn)行保守性分析。

表1 截短表達(dá)CIAV VP2蛋白引物設(shè)計(jì)

2 結(jié) 果

2.1 His-VP2融合蛋白的表達(dá)

按照“1.2”中引物PCR擴(kuò)增CIAV的VP2基因，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，結(jié)果成功擴(kuò)增出目的基因，大小約為648 bp(圖1A)。與pET-32a連接并轉(zhuǎn)化BL21細(xì)菌，經(jīng)SDS-PAGE結(jié)果顯示，成功獲得His-VP2融合蛋白，相對分子質(zhì)量約50 ku(圖1B)。

2.2 mAb的制備

取免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，經(jīng)過多次IFA篩選，結(jié)果成功篩選到1株穩(wěn)定分泌針對CIAV VP2蛋白mAb的雜交瘤細(xì)胞株，命名為CIAV-VP2-4A12。該細(xì)胞株分泌的mAb可以與轉(zhuǎn)染pCAGGS-VP2-Flag的DF1細(xì)胞以及感染桿狀病毒rBac-CIAV-VP2后表達(dá)VP2蛋白的Sf9細(xì)胞反應(yīng)(圖2)。經(jīng)過亞類鑒定試劑盒鑒定mAb CIAV-VP2-4A12重鏈為IgG1型，輕鏈為kappa鏈。經(jīng)測定，腹水的IFA效價(jià)為1∶12 800。

2.3 Western blot鑒定

Western blot結(jié)果顯示，mAb CIAV-VP2-4A12能與原核表達(dá)、桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)以及轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞表達(dá)的VP2蛋白反應(yīng)，產(chǎn)生特異性條帶(圖3)，桿狀病毒表達(dá)的VP2蛋白經(jīng)過加工修飾大小約為38 ku，轉(zhuǎn)染pCAGGS-VP2-Flag(Flag標(biāo)簽大小為0.9 ku)的DF1細(xì)胞所表達(dá)的VP2大小約為35 ku。

A. CIAV VP2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果(M. DL10000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. VP2基因；2. 陰性對照)；B. 原核表達(dá)VP2蛋白的SDS-PAGE分析(M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET-32a誘導(dǎo)后的上清；2. pET-32a誘導(dǎo)后的沉淀；3. pET-32a-VP2誘導(dǎo)后的上清；4. pET-32a-VP2誘導(dǎo)后的沉淀)A. PCR amplification result of CIAV VP2 gene (M. DL10000 DNA marker; 1. VP2 gene; 2. Negative control); B. SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression of VP2 protein (M. Protein marker; 1. Supernatant of induced pET-32a lysate; 2. Precipitation of induced pET-32a lysate; 3. Supernatant of induced pET-32a-VP2 lysate; 4. Precipitation of induced pET-32a-VP2 lysate)圖1 CIAV VP2基因的PCR擴(kuò)增及原核表達(dá)VP2蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 Amplification of CIAV VP2 and SDS-PAGE analysis of recombinant protein His-VP2 expressed in E. coli

A. 感染rBac-CIAV-VP2的Sf9細(xì)胞；B. 感染野生型桿狀病毒的Sf9細(xì)胞；C. 轉(zhuǎn)染pCAGGS-VP2-Flag的DF1細(xì)胞；D. 轉(zhuǎn)染pCAGGS的DF1細(xì)胞A. Sf9 cells infected with rBac-CIAV-VP2; B. Sf9 cells infected with wild baclovirus; C. DF1 cells transfected with pCAGGS-VP2-Flag; D. DF1 cells transfected with pCAGGS圖2 mAb CIAV-VP2-4A12的IFA鑒定(400×)Fig.2 IFA Identification of mAb CIAV-VP2-4A12(400×)

2.4 特異性鑒定

將LPAIV、ALV-J、MDV感染的細(xì)胞經(jīng)過固定后以mAb CIAV-VP2-4A12以及針對各自病毒的mAb為一抗，進(jìn)行IFA鑒定，結(jié)果顯示，陽性對照組均出現(xiàn)了特異性熒光，而mAb CIAV-VP2-4A12不與3種病毒反應(yīng)(圖4)，說明mAb的特異性較好。

2.5 抗原表位的鑒定

將截短表達(dá)CIAV VP2蛋白作為抗原，以mAb CIAV-VP2-4A12和His標(biāo)簽抗體為一抗進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果顯示，當(dāng)VP2蛋白分為兩段(aa1～aa130和aa111～aa216)表達(dá)時(shí)，mAb可以識(shí)別aa111～aa216(圖5)；將該區(qū)域分成兩段，發(fā)現(xiàn)mAb識(shí)別的區(qū)域?yàn)閍a111～aa170，而不與aa156～aa216反應(yīng)(圖5)，說明mAb識(shí)別表位的N端位于aa111～aa156；再將VP2蛋白N端從aa111逐步截短表達(dá)，進(jìn)一步確定mAb識(shí)別表位的N端位于aa147～aa156片段(圖5)。為精確定位mAb識(shí)別序列的N端位置，將VP2蛋白N端從aa148開始逐個(gè)缺失表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn),mAb與片段aa155～aa216仍可以反應(yīng)(圖5)，由上述結(jié)果可知,mAb不與aa156～aa216反應(yīng)，故mAb CIAV-VP2-4A12識(shí)別表位的N端為aa155；之后將VP2蛋白C端從aa165逐個(gè)截短表達(dá)，發(fā)現(xiàn)mAb可以識(shí)別截短片段aa1～aa159而不識(shí)別aa1～aa158，說明mAb CIAV-VP2-4A12識(shí)別的最短序列aa155～aa159，該區(qū)域的氨基酸序列為155KTVRW159(圖5)。

陽性對照所用抗體為2A8(LPAIV)、5D3(ALV-J)和BA4(MDV)The antibodies used in positive control were 2A8 (LPAIV),5D3(ALV-J) and BA4(MDV)圖4 mAb CIAV-VP2-4A12 特異性鑒定(200×)Fig.4 Specific identification of mAb CIAV-VP2-4A12(200×)

A. Western blot分析；B. 截短片段示意圖A. Western blot analysis; B. Schematic diagram of the truncated fragments圖5 mAb CIAV-VP2-4A12識(shí)別表位的定位Fig.5 Identification of antigen epitope recognized by mAb CIAV-VP2-4A12

2.6 抗原表位的保守性分析

在GenBank下載國內(nèi)外的23株CIAV VP2氨基酸序列，并使用DNAStar軟件分析mAb識(shí)別區(qū)域在不同毒株中的保守性，結(jié)果顯示,CIAV的VP2蛋白在aa155～aa159處沒有發(fā)生氨基酸突變(圖6)，表明mAb CIAV-VP2-4A12識(shí)別的氨基酸序列在各毒株間高度保守。

圖6 mAb CIAV-VP2-4A12識(shí)別表位的保守性分析Fig.6 Conservative analysis of antigen epitope recognized by mAb CIAV-VP2-4A12

3 討 論

CIAV是一種重要的禽類免疫抑制病，自1979年被發(fā)現(xiàn)以來，包括我國在內(nèi)的多個(gè)國家陸續(xù)分離到該病原體[22-25]，目前商品化疫苗防止該病的效果有限，且沒有特效藥可用于CIAV的治療，對于該病及時(shí)準(zhǔn)確的監(jiān)測是防控中的重要環(huán)節(jié)[26-27]。

近年來，mAb以及抗原表位的研究成為疾病的防控的熱門研究領(lǐng)域。通過病毒抗原及其mAb建立的阻斷ELISA，相比于常規(guī)的ELISA，不會(huì)受到血清中的細(xì)胞因子等雜質(zhì)的影響，極大提高了檢測的特異性[16-18]。因此制備針對病毒蛋白的mAb并對其進(jìn)行表位研究具有應(yīng)用前景。CIAV目前只有1個(gè)血清型，在病毒的3個(gè)蛋白中，VP2蛋白在不同毒株中具有較高的保守性[28]，是建立檢測方法的理想抗原。鑒于CIAV生長速度緩慢，難以獲得滴度較高的病毒，利用外源表達(dá)的病毒蛋白免疫小鼠制備mAb是制備CIAV mAb的主要途徑[29-31]。本研究在制備VP2蛋白mAb時(shí)選擇原核表達(dá)的VP2重組蛋白為免疫原，并嘗試使用切膠純化直接免疫小鼠，省去了變性純化等步驟，節(jié)約了時(shí)間與成本。在篩選mAb時(shí)，為了避免非特異性抗體的產(chǎn)生，不同于陸桂麗等[30]和陳延飛[31]使用原核表達(dá)的抗原進(jìn)行間接ELISA篩選，本研究采用真核系統(tǒng)表達(dá)的VP2蛋白進(jìn)行IFA篩選，提高了篩選方法的特異性，最終獲得了高效價(jià)的特異性mAb。

目前，與VP2蛋白抗原表位的相關(guān)研究較少，陳延飛等[31]和王曉燕等[32]制備了VP2蛋白的mAbs并初步定位識(shí)別表位，發(fā)現(xiàn)所制備mAbs的識(shí)別區(qū)域分別位于VP2蛋白的aa21～aa36、aa111～aa126、aa121～aa136以及aa20～aa40，但均未精確定位具體識(shí)別的氨基酸。為了研究已制備的mAb針對的抗原表位與先前報(bào)道是否存在差異，本研究通過逐步截短表達(dá)VP2蛋白，采用Western blot方法檢測與不同截短蛋白的反應(yīng)性，對表位進(jìn)行精確定位，確定該mAb識(shí)別抗原表位為aa155～aa159，發(fā)現(xiàn)了不同于前人鑒定的新的抗原表位并定位至5個(gè)氨基酸，經(jīng)過同源性比較分析，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外不同毒株在該識(shí)別區(qū)域十分保守，具有潛在應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

成功制備針對CIAV VP2蛋白的mAb，確定其識(shí)別表位為155KTVRW159，為VP2蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究以及CIAV檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。