王 俊，李 軍，崔國(guó)林

(1. 嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院，嘉興 314036；2. 河北工程大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，邯鄲 056038)

鞭毛是沙門(mén)菌重要的運(yùn)動(dòng)器官，幫助其在液體環(huán)境中改變運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和運(yùn)動(dòng)方向[1]。正常情況下，當(dāng)細(xì)菌所處周?chē)h(huán)境的pH、溫度、鹽離子濃度等條件發(fā)生變化時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞膜受體蛋白感應(yīng)刺激，信號(hào)蛋白磷酸化結(jié)合至C環(huán)結(jié)構(gòu)蛋白FliM、FliN等，引起C環(huán)構(gòu)象改變，質(zhì)子流向鞭毛馬達(dá)，向其施加扭轉(zhuǎn)力導(dǎo)致細(xì)菌鞭毛形態(tài)改變從而切換運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，這一過(guò)程是由鞭毛形態(tài)控制細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)[2-4]。

沙門(mén)菌鞭毛蛋白FliC由末端的保守區(qū)域D0、D1和中間的高變區(qū)域D2、D3構(gòu)成[5]。D0和D1區(qū)域參與TLR5識(shí)別和鞭毛絲結(jié)構(gòu)組成，D2和D3區(qū)域參與體液免疫應(yīng)答[6]。FliC蛋白的氨基酸序列與鞭毛形態(tài)和細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性之間存在相關(guān)關(guān)系。Kanto等[7]發(fā)現(xiàn)部分鼠傷寒沙門(mén)菌菌株FliC蛋白的單個(gè)或兩個(gè)氨基酸突變導(dǎo)致鞭毛產(chǎn)生多種形態(tài)，氨基酸序列分析表明，突變位點(diǎn)均位于N端和C端的α螺旋結(jié)構(gòu)。Smith等[8]通過(guò)比對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌與大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌、枯草芽胞桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌等f(wàn)liC基因的TLR5識(shí)別區(qū)域，將其中高度保守的氨基酸依次置換成丙氨酸后發(fā)現(xiàn)部分位點(diǎn)替換后僅能降低TLR5識(shí)別，而部分位點(diǎn)替換能夠?qū)е录?xì)菌運(yùn)動(dòng)性的完全喪失。由此可見(jiàn)，鞭毛蛋白氨基酸序列與鞭毛運(yùn)動(dòng)性密切相關(guān)。Hayashi等[9]分離4株突變株，鞭毛形態(tài)由鈍直轉(zhuǎn)變?yōu)槌菪?，涉?個(gè)新鑒定的氨基酸突變位點(diǎn)均位于D1區(qū)域。Wang等[10]鑒定鼠傷寒沙門(mén)菌FliC蛋白D108A、N133A和D152A突變導(dǎo)致鞭毛蛋白亞基之間的氫鍵作用力破壞從而改變鞭毛形態(tài)和細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性。目前關(guān)于腸炎沙門(mén)菌的FliC蛋白氨基酸位點(diǎn)與鞭毛形態(tài)及細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性之間相關(guān)性尚不明確。

本研究通過(guò)比對(duì)分析D群的腸炎沙門(mén)菌、雞傷寒沙門(mén)菌和雞白痢沙門(mén)菌的FliC蛋白氨基酸序列發(fā)現(xiàn)存在第91位、第339位、第431位3個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異，進(jìn)一步序列比對(duì)結(jié)果揭示，僅雞白痢沙門(mén)菌第91位點(diǎn)為絲氨酸，腸炎沙門(mén)菌、雞傷寒沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌等23個(gè)血清型均為精氨酸。運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、鞭毛形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察、細(xì)胞感染試驗(yàn)和動(dòng)物感染試驗(yàn)揭示了腸炎沙門(mén)菌第91位精氨酸是維持鞭毛形態(tài)結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)性的關(guān)鍵氨基酸，第91位精氨酸突變?yōu)榻z氨酸能夠減弱腸炎沙門(mén)菌黏附入侵細(xì)胞和小鼠體內(nèi)定植能力。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞

腸炎沙門(mén)菌CICC10467購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，雞白痢沙門(mén)菌ATCC13036購(gòu)自美國(guó)菌株保藏中心(ATCC)。pKD3質(zhì)粒、pKD46質(zhì)粒和pCP20質(zhì)粒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院吳文學(xué)研究員惠贈(zèng)；pBR322質(zhì)粒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院吳清民教授惠贈(zèng)。RAW264.7和HCT116細(xì)胞購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7日齡SPF雛雞購(gòu)自勃林格殷格翰維通生物技術(shù)(北京)有限公司，6～8周雌性BALB/c小鼠購(gòu)自斯貝福(北京)有限公司。

1.3 fliC基因序列比對(duì)

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載腸炎沙門(mén)菌部分菌株基因組序列、雞白痢和雞傷寒沙門(mén)菌全部菌株基因組序列，截取fliC基因序列進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。

1.4 腸炎沙門(mén)菌fliC基因突變株及回補(bǔ)株構(gòu)建

參考Yang等[11]構(gòu)建沙門(mén)菌基因缺失株和回補(bǔ)株方法，運(yùn)用λ-Red同源重組方法刪除腸炎沙門(mén)菌CICC10467fliC基因，以pBR322質(zhì)粒為骨架構(gòu)建反式回補(bǔ)株，分別命名為腸炎沙門(mén)菌fliC基因回補(bǔ)株(ΔfliC::S. EnteritidisfliC)和7個(gè)以腸炎沙門(mén)菌FliC蛋白為骨架僅置換雞白痢沙門(mén)菌FliC蛋白差異位點(diǎn)的回補(bǔ)株，包括第91位突變回補(bǔ)株(ΔfliC::R91S)、第339位突變回補(bǔ)株(ΔfliC::Q339K)、第431位突變回補(bǔ)株(ΔfliC::A431T)、第91和第339位雙突變回補(bǔ)株(ΔfliC::R91S/Q339K)、第91和第431位雙突變回補(bǔ)株(ΔfliC::R91S/A431T)、第339和第431位雙突變回補(bǔ)株(ΔfliC::Q339K/A431T)和第91位、第339位及第431位突變回補(bǔ)株(ΔfliC::R91S/Q339K/A431T)。

1.5 腸炎沙門(mén)菌野生株、缺失株和回補(bǔ)株的生長(zhǎng)特性分析

分別將野生株和回補(bǔ)株的過(guò)夜培養(yǎng)物濃度調(diào)整至OD600 nm約為1.0，以1∶100接種至25 mL新鮮TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每2 h測(cè)定培養(yǎng)物OD600 nm值。

1.6 運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)

將過(guò)夜培養(yǎng)菌液濃度調(diào)整至OD600 nm=1.0，移液器吸取2 μL滴加至LB肉湯(0.3%瓊脂)，37 ℃培養(yǎng)6 h，測(cè)量細(xì)菌運(yùn)動(dòng)圈直徑并拍照。

1.7 透射電鏡觀察

向過(guò)夜培養(yǎng)的平板中加入3 mL無(wú)菌水放置5 min，將銅網(wǎng)置于無(wú)菌水液面上靜置5 min，取出銅網(wǎng)置于干凈濾紙上吸取多余水分，放置于100 μL 2%磷鎢酸中負(fù)染5 min，迅速用濾紙吸去磷鎢酸，透射顯微鏡觀察。

1.8 細(xì)胞黏附和入侵試驗(yàn)

1.8.1 細(xì)胞準(zhǔn)備 將RAW 264.7細(xì)胞以4×105個(gè)·孔-1接種至24孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜使細(xì)胞密度達(dá)到80%。PBS洗滌過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物1次，預(yù)熱的RMPI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋菌液濃度至3×107CFU·mL-1，然后進(jìn)行黏附和入侵試驗(yàn)。

1.8.2 細(xì)胞黏附試驗(yàn) 1 μg·mL-1Cytochalasin D 37 ℃預(yù)處理細(xì)胞1 h，無(wú)菌PBS徹底洗去Cytochalasin D。以MOI=10感染細(xì)胞，37 ℃繼續(xù)孵育60 min。冰水裂解細(xì)胞10 min，收取裂解液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?00 μL涂布于TSA平板，37 ℃培養(yǎng)18 h后計(jì)數(shù)。將HCT116細(xì)胞以5×105個(gè)·孔-1接種至24孔板，37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)過(guò)夜使細(xì)胞密度達(dá)到90%。將細(xì)胞置于4 ℃預(yù)處理30 min。PBS洗滌過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物1次，預(yù)熱的RMPI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋菌液濃度至4.5×107CFU·mL-1。以MOI=10感染細(xì)胞，4 ℃條件孵育30 min。PBS洗滌細(xì)胞3次。冰水裂解細(xì)胞10 min，將細(xì)胞裂解液梯度稀釋?zhuān)?00 μL涂布于TSB平板，37 ℃培養(yǎng)16 h后計(jì)數(shù)。

1.8.3 細(xì)胞入侵試驗(yàn) 以MOI=10感染細(xì)胞，37 ℃、5% CO2條件孵育50 min。PBS洗滌細(xì)胞3次。加入含100 μg·mL-1慶大霉素的RMPI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，冰水裂解細(xì)胞，對(duì)裂解細(xì)胞液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?00 μL涂布于TSB平板，37 ℃培養(yǎng)16 h后計(jì)數(shù)。HCT116細(xì)胞感染過(guò)程同RAW264.7細(xì)胞[12]。

1.9 間接免疫熒光試驗(yàn)

將RAW264.7細(xì)胞以4×105個(gè)·孔-1接種至24孔板，37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)過(guò)夜使細(xì)胞密度達(dá)到90%。將細(xì)胞置于4 ℃預(yù)處理30 min。PBS洗滌過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物1次，預(yù)熱的RMPI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋菌液濃度至4.5×107CFU·mL-1。以MOI=10感染細(xì)胞，4 ℃孵育30 min。PBS洗滌細(xì)胞3次。固定液室溫固定細(xì)胞20 min；PBS溫和洗滌3次；將鴨源抗腸炎沙門(mén)菌陽(yáng)性血清1∶200稀釋?zhuān)覝胤跤? h后，PBS溫和洗滌3次；將FITC標(biāo)記山羊抗鴨二抗1∶100稀釋?zhuān)覝胤跤? h；PBS溫和洗滌3次；DAPI孵育10 min后PBS溫和洗滌3次；熒光顯微鏡觀察。

1.10 動(dòng)物感染試驗(yàn)

菌株準(zhǔn)備步驟同“1.8”。75只6～8周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成5組，A組(WT)、B組(ΔfliC)、C組(ΔfliC::S. EnteritidisfliC)、D組(ΔfliC::R91S)為試驗(yàn)組，E組為空白對(duì)照組，每組15只。試驗(yàn)組小鼠每只腹腔注射1×105CFU沙門(mén)菌，對(duì)照組注射無(wú)菌PBS，分別在感染后的6、24、48 h每組處死5只，取肝和脾，制成20%組織懸液，梯度稀釋后涂布至XLD瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18 ～24 h后計(jì)數(shù)。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

氨基酸序列比對(duì)分析使用DNASTAR Lasergene 軟件包Megalign 7.0軟件，同源建模使用在線軟件SWISS-model，遺傳進(jìn)化分析使用MEGA 7.0軟件，其他數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism 7.0軟件。差異顯著性檢驗(yàn)采用One-way ANOVA和Two-way ANOVA，ns.P≥0.05; *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001; ****.P<0.000 1。

2 結(jié) 果

2.1 FliC第91位氨基酸差異在腸炎和雞白痢沙門(mén)菌血清型間高度保守

比對(duì)分析GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的腸炎、雞白痢和雞傷寒沙門(mén)菌FliC蛋白氨基酸序列，結(jié)果表明腸炎和雞傷寒沙門(mén)菌的序列完全一致，腸炎和雞白痢沙門(mén)菌存在兩種差異位點(diǎn)類(lèi)型，分別命名為雞白痢沙門(mén)菌Type Ⅰ型和Type Ⅱ型，氨基酸位點(diǎn)差異分別是位于ND1區(qū)域的第91位、D3區(qū)域的第339位和CD2區(qū)域的第431位(表1)。進(jìn)一步比對(duì)部分鞭毛型不同的沙門(mén)菌血清型FliC蛋白的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)第91位精氨酸在腸炎沙門(mén)菌、雞傷寒沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌等23個(gè)血清型間高度保守，僅雞白痢沙門(mén)菌為絲氨酸(表2)。

表1 D群3個(gè)沙門(mén)菌血清型FliC蛋白氨基酸序列比對(duì)

表2 部分沙門(mén)菌血清型FliC蛋白氨基酸序列比對(duì)

(轉(zhuǎn)下頁(yè) Carried forward)

2.2 腸炎沙門(mén)菌fliC基因缺失株和突變回補(bǔ)株構(gòu)建

PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，運(yùn)用同源重組技術(shù)成功刪除腸炎沙門(mén)菌CICC10467fliC基因，通過(guò)pBR322質(zhì)粒成功構(gòu)建8個(gè)反式回補(bǔ)株，Western blot分析表明，各回補(bǔ)株的FliC蛋白表達(dá)量與野生株基本一致，fliC基因缺失株不表達(dá)FliC蛋白(圖1A)。體外生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，野生株、fliC基因缺失株和各突變回補(bǔ)株在TSB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度無(wú)顯著差異(P≥0.05)(圖1B)。

A. 野生株、缺失株和反式回補(bǔ)株的PCR和Western blot鑒定；B. 野生株、缺失株和反式回補(bǔ)突變株生長(zhǎng)特性分析，菌株之間生長(zhǎng)差異顯著性檢驗(yàn)采用 One-way ANOVA, ns. 差異不顯著(P≥0.05)。WT.腸炎沙門(mén)菌CICC10467野生株；ΔfliC. 腸炎沙門(mén)菌CICC10467 fliC基因突變株；ΔfliC::S. Enteritidis fliC. 腸炎沙門(mén)菌CICC10467 fliC基因回補(bǔ)株；ΔfliC::R91S/Q339K/A431T. R91S、Q339K和A431T反式回補(bǔ)突變株；ΔfliC::R91S. R91S反式回補(bǔ)突變株；ΔfliC::Q339K. Q339K反式回補(bǔ)突變株；ΔfliC::A431T. A431T反式回補(bǔ)突變株；ΔfliC::R91S/Q339K. R91S和Q339K反式回補(bǔ)突變株；ΔfliC::R91S/A431K. R91S和A431K反式回補(bǔ)突變株；ΔfliC::Q339K/A431K. Q339K和A431K反式回補(bǔ)突變株，下圖同A. PCR and Western blot identification for wild type, mutant and complements; B. Growth analysis of wild type, mutant and trans-complemented strains. Growth characteristic of wild type, fliC mutant and trans-complemented strains was analyzed by One-way ANOVA, ns. No significant (P≥0.05). WT, ΔfliC, ΔfliC::S. Enteritidis fliC, ΔfliC::R91S/Q339K/A431T, ΔfliC::R91S, ΔfliC::Q339K, ΔfliC::A431T, ΔfliC::R91S/Q339K, ΔfliC::R91S/A431K, ΔfliC::Q339K/A431K denoted S. Enteritidis CICC10467 wild type, fliC mutant, S. Enteritidis fliC trans-complemented strain, R91S/Q339K/A431T trans-complemented strain, R91S trans-complemented strain, Q339K trans-complemented strain, A431T trans-complemented strain, R91S/Q339K trans-complemented strain, R91S/A431K trans-complemented strain, Q339K/A431K trans-complemented strain, respectively, the same as below圖1 沙門(mén)菌野生株、fliC缺失株和反式回補(bǔ)突變株鑒定Fig.1 Identification of wild type, fliC mutant and trans-complemented strains

2.3 FliC第91位精氨酸突變減弱腸炎沙門(mén)菌鞭毛運(yùn)動(dòng)性

運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，S. EnteritidisfliC回補(bǔ)株和R91S/Q339K/A431T回補(bǔ)株的運(yùn)動(dòng)性恢復(fù)至野生株的80%，fliC基因缺失株運(yùn)動(dòng)能力喪失，R91S、R91S/Q339K、R91S/A431T回補(bǔ)株與缺失株的運(yùn)動(dòng)能力基本一致，并且顯著低于野生株(P<0.000 1)(圖2)。結(jié)果表明，F(xiàn)liC第91位精氨酸置換為絲氨酸后導(dǎo)致腸炎沙門(mén)菌運(yùn)動(dòng)性喪失。

2.4 FliC第91位精氨酸突變改變腸炎沙門(mén)菌鞭毛形態(tài)

研究表明，細(xì)菌鞭毛形態(tài)與運(yùn)動(dòng)性密切相關(guān)，為進(jìn)一步探究FliC第91位精氨酸突變?yōu)榻z氨酸是否通過(guò)改變腸炎沙門(mén)菌的鞭毛形態(tài)從而改變其運(yùn)動(dòng)性，通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，S. EnteritidisfliC和R91S/Q339K/A431T(Type Ⅱ)回補(bǔ)株的鞭毛形態(tài)與野生株基本一致，Q339K、A431T和Q339K/A431T回補(bǔ)株鞭毛形態(tài)基本一致，彎曲程度大，柔韌性較強(qiáng)，R91S、R91S/Q339K和R91S/A431T回補(bǔ)株均存在第91位精氨酸突變，鞭毛形態(tài)與野毒株明顯不同，形態(tài)鈍直柔韌性較低，表明FliC蛋白R(shí)91S突變導(dǎo)致鞭毛的形態(tài)發(fā)生改變從而影響其運(yùn)動(dòng)性(圖3)。同時(shí)揭示了腸炎沙門(mén)菌運(yùn)動(dòng)性、鞭毛形態(tài)和氨基酸位點(diǎn)三者之間密切相關(guān)性，第91位、第339位和第431位3個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在結(jié)構(gòu)互作使得沙門(mén)菌鞭毛形態(tài)得到一定程度恢復(fù)。

菌株之間運(yùn)動(dòng)性的差異顯著性檢驗(yàn)采用 One-way ANOVA, ****.P<0.000 1Comparisons of colony diameter was analyzed by One-way ANOVA, ****.P<0.000 1圖2 野生株、fliC基因突變株和反式回補(bǔ)突變株的運(yùn)動(dòng)性分析Fig.2 Motility analysis of wild type, fliC mutant and trans-complemented strains

圖3 野生株、fliC基因突變株和反式回補(bǔ)突變株鞭毛的透射電鏡圖(Bar=2 μm)Fig.3 Transmission electron micrograph of flagellum on wild type, fliC mutant and trans-complemented strains (Bar=2 μm)

2.5 FliC第91位氨基酸突變降低腸炎沙門(mén)菌黏附和入侵細(xì)胞能力

為探究FliC第91位精氨酸突變?yōu)榻z氨酸對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞黏附和入侵能力的影響，通過(guò)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7的感染試驗(yàn)證實(shí)S. EnteritidisfliC回補(bǔ)株和R91S/Q339K/A431T回補(bǔ)株的細(xì)胞黏附和入侵能力顯著強(qiáng)于fliC缺失株(P<0.01)，R91S、R91S/Q339K、R91S/A431T回補(bǔ)株與fliC基因缺失株的黏附和入侵細(xì)胞能力無(wú)顯著差異(P≥0.05)并且均顯著低于親本毒株(P<0.001)(圖4)。間接免疫熒光試驗(yàn)獲得相似的結(jié)果(圖5)。以上結(jié)果揭示R91S突變能夠顯著減弱腸炎沙門(mén)菌對(duì)HCT116和RAW264.7細(xì)胞的黏附和入侵能力。

黏附試驗(yàn)：分別將HCT116(A)和RAW264.7 細(xì)胞(B)4 ℃預(yù)冷 30 min，以MOI=10感染細(xì)胞后 4 ℃繼續(xù)孵育30 min，裂解細(xì)胞收集裂解液，稀釋后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)；入侵試驗(yàn)：以MOI=10菌量分別感染 HCT116(C)和RAW264.7細(xì)胞(D)，37 ℃孵育2 h 后，裂解細(xì)胞收集裂解液，稀釋后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)；采用One-way ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(ns.P≥0.05; *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001)For adhesion assay, HCT116 (A) and RAW 264.7 (B) cells were precooled at 4 ℃ for 30 min, cells were lysed after infecting with strains (MOI=10) at 4 ℃ for 30 min, then inoculated TSA plate for bacteria mount; For invasion assay, HCT116 (C) and Raw2647 (D) cells were lysed after infecting with strains (MOI=10) at 37 ℃ for 2 h, followly inoculated TSA plate for bacteria amount, comparison of bacterial load were analyzed by One-way ANOVA (ns. P≥0.05; *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001)圖4 野生株、fliC基因突變株和反式回補(bǔ)突變株對(duì)HCT116細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的黏附和入侵Fig.4 Adhesion and invasion assay of wild type, fliC mutant and trans-complemented strains in HCT116 cells and RAW264.7 cells

藍(lán)色熒光表示RAW264.7細(xì)胞核，綠色熒光表示腸炎沙門(mén)菌Blue fluorescence and green fluorescence represented nucleus of RAW264.7 cells and Salmonella Enteritidis, respectively圖5 間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定各菌株對(duì)RAW264.7細(xì)胞的黏附能力(400×)Fig.5 Adhesion ability of each Salmonella strain to RAW264.7 cells identified by indirect immunofluorescence assay (400×)

2.6 FliC第91位氨基酸突變減弱腸炎沙門(mén)菌在動(dòng)物體內(nèi)定植能力

BALB/c小鼠腹腔注射感染各菌株后，評(píng)估各組肝和脾中細(xì)菌載量，細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，感染后6、24、48 h，fliC缺失株和R91S回補(bǔ)株感染的小鼠器官載量無(wú)顯著差異，野生株和S. EnteritidisfliC回補(bǔ)株感染的小鼠器官載量無(wú)顯著差異，野生株和S. EnteritidisfliC回補(bǔ)株入侵小鼠肝和脾能力顯著高于fliC缺失株和R91S回補(bǔ)株(P<0.001或P<0.000 1)(圖6)，以上結(jié)果提示fliC基因缺失影響腸炎沙門(mén)菌在BALB/c小鼠肝和脾的定植能力，R91S突變能夠減弱腸炎沙門(mén)菌的體內(nèi)定植能力。

細(xì)菌感染后24 h肝和脾載菌量整體均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，48 h時(shí)組織中的細(xì)菌載量高于24 h，并且fliC缺失株和R91S回補(bǔ)株的器官載量顯著低于野生株和S. EnteritidisfliC回補(bǔ)株(P<0.000 1)，表明感染后48 h細(xì)菌出現(xiàn)增殖，fliC基因缺失株和R91S突變株的黏附和入侵能力減弱直接影響其胞內(nèi)增殖(圖6)。

105CFU腸炎沙門(mén)菌野生株或突變株腹腔感染BALB/c小鼠，感染后6、24、48 h測(cè)定肝和脾的載菌量；顯著性檢驗(yàn)采用Two-way ANOVA，ns. P≥0.05; *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001; ****.P<0.000 1BALB/c mice were intraperitoneally infected with 1×105CFU Salmonella Enteritidis wild type and mutations. At 6, 24, 48 h post infection, the bacterial load were assessed on liver and spleen； Comparison of bacterial load was analyzed by Two-way ANOVA with: ns. P≥0.05; *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001; ****.P<0.000 1圖6 FliC第91位精氨酸突變對(duì)腸炎沙門(mén)菌體內(nèi)定植能力的影響Fig.6 The effect of 91 arginine mutation in FliC protein on colonization of Salmonella Enteritidis in vivo

3 討 論

細(xì)菌的鞭毛是復(fù)雜的運(yùn)動(dòng)器官，形成過(guò)程需要多個(gè)結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因參與[13]。雞白痢沙門(mén)菌不表達(dá)鞭毛，從而能夠有效避免引發(fā)宿主的促炎反應(yīng)[14]。本研究前期通過(guò)功能基因序列分析揭示flgK基因在373 bp處堿基突變形成終止子，導(dǎo)致FliC蛋白翻譯過(guò)程提前終止[15]，flhB基因存在197 bp的片段缺失，推測(cè)這兩個(gè)基因的突變可能導(dǎo)致雞白痢血清型不能形成鞭毛。進(jìn)一步的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)雞白痢FliC蛋白與腸炎沙門(mén)菌也存在2～3個(gè)不同的氨基酸位點(diǎn)。以鼠傷寒沙門(mén)菌FliC蛋白同源建模發(fā)現(xiàn)3個(gè)氨基酸位點(diǎn)分別位于D1和D2區(qū)域。Vonderviszt等[16]研究揭示鼠傷寒沙門(mén)菌D1區(qū)域是影響鞭毛絲穩(wěn)定性和多態(tài)性構(gòu)象的主要位置。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示相鄰兩個(gè)鞭毛單體的D1區(qū)域和D2小部分區(qū)域形成的凸面和凹面圍繞中心軸相互作用形成鞭毛原絲結(jié)構(gòu)[17]。Smith等[8]將D1區(qū)域的第84位谷氨酸、第91位精氨酸和第95位亮氨酸突變?yōu)楸彼岷?，鼠傷寒沙門(mén)菌的運(yùn)動(dòng)性基本喪失，而第90位谷氨酰胺、第101位天冬酰胺等突變后并不影響細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性，可見(jiàn)D1區(qū)域中存在參與鞭毛空間結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。本研究經(jīng)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)僅雞白痢沙門(mén)菌FliC蛋白第91位為絲氨酸并且在血清型內(nèi)高度保守，其他23個(gè)不同鞭毛抗原型沙門(mén)菌血清型均為精氨酸。將腸炎沙門(mén)菌第91位精氨酸置換為絲氨酸后，腸炎沙門(mén)菌運(yùn)動(dòng)性基本喪失，此結(jié)果與Smith等[8]將精氨酸置換位丙氨酸所獲得的結(jié)果一致，表明第91位精氨酸是維持腸炎沙門(mén)菌運(yùn)動(dòng)性的關(guān)鍵氨基酸。進(jìn)一步的透射電鏡觀察鞭毛形態(tài)明確表明R91S突變引起鞭毛形態(tài)發(fā)生顯著變化，揭示鞭毛絲形態(tài)和細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性之間存在相關(guān)性，鞭毛形態(tài)變得鈍直，柔韌性下降可能是導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)性丟失的主要原因，這與Kanto等[7]的研究結(jié)果基本符合，F(xiàn)liC蛋白部分氨基酸位點(diǎn)改變能夠直接影響鞭毛絲的形態(tài)。沙門(mén)菌鞭毛絲由11根鞭毛原絲(protofilament)構(gòu)成，約3 000個(gè)鞭毛蛋白亞基參與組成，鞭毛原絲形態(tài)分為L(zhǎng)型和R型兩種，通過(guò)相互切換改變鞭毛形態(tài)從而改變運(yùn)動(dòng)狀態(tài)[9]。Wang等[10]解析鼠傷寒沙門(mén)菌鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)揭示呈縱向排列的兩個(gè)鞭毛蛋白亞基之間的接觸面均位于FliC蛋白N端的α螺旋結(jié)構(gòu)，通過(guò)氫鍵相互作用，參與氫鍵構(gòu)成的氨基酸殘基突變導(dǎo)致R型鞭毛原絲轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)型，從而改變鞭毛形態(tài)。鼠傷寒沙門(mén)菌FliC第91位精氨酸殘基參與氫鍵構(gòu)成，同源建模揭示腸炎沙門(mén)菌FliC第91位精氨酸與鼠傷寒沙門(mén)菌具有相似的空間結(jié)構(gòu)位置，R91S突變改變鞭毛形態(tài)和細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性可能與鞭毛原絲構(gòu)象發(fā)生變化有關(guān)。Zhang等[18]研究表明，鼠傷寒沙門(mén)菌FliC蛋白氨基酸序列89—96 aa區(qū)域缺失導(dǎo)致TLR5無(wú)法識(shí)別，至于腸炎沙門(mén)菌第91位精氨酸突變?yōu)榻z氨酸是否影響TLR5受體識(shí)別和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)還需要進(jìn)一步研究。Hayashi等[9]鑒定了多個(gè)新的第2突變位點(diǎn)能夠幫助沙門(mén)菌的鞭毛絲形態(tài)從鈍直轉(zhuǎn)變?yōu)槌菪Y(jié)構(gòu)，并且第2突變位點(diǎn)均位于D1區(qū)域。本研究中發(fā)現(xiàn)的第2位點(diǎn)(339位)和第3位點(diǎn)(431位)也是首次鑒定的參與鞭毛形態(tài)從鈍直轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪瓦^(guò)程的兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)，3個(gè)位點(diǎn)空間結(jié)構(gòu)相互作用使得鞭毛轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪?。本研究中鑒定出雞白痢沙門(mén)菌fliC基因存在兩種形式，遺傳進(jìn)化分析表明，兩個(gè)基因型雞白痢菌株位于相關(guān)的兩個(gè)進(jìn)化分枝，Ⅱ型雞白痢菌株較Ⅰ型菌株可能發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化，全基因組序列分析表明，雞白痢沙門(mén)菌毒力和代謝基因可能從祖代菌株914CE產(chǎn)生多樣性變異[19]。Ⅰ型和Ⅱ型雞白痢菌株產(chǎn)生兩種不同的運(yùn)動(dòng)表型，這與鞭毛形態(tài)差異密切相關(guān)[20]。沙門(mén)菌的鞭毛參與細(xì)菌的腸道定植和感染過(guò)程[21-22]，這與本研究結(jié)果揭示的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性丟失導(dǎo)致腸炎沙門(mén)菌對(duì)HCT116細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的黏附和入侵能力顯著下降現(xiàn)象基本符合，BALB/c小鼠的感染試驗(yàn)結(jié)果也充分揭示這一現(xiàn)象。綜上，本研究揭示了FliC第91位精氨酸是維持腸炎沙門(mén)菌鞭毛形態(tài)和細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的關(guān)鍵位點(diǎn)，精氨酸突變改變鞭毛形態(tài)，減弱腸炎沙門(mén)菌在小鼠體內(nèi)的定植能力。鞭毛參與細(xì)菌的致病過(guò)程同時(shí)又作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[23-24]。

4 結(jié) 論

腸炎沙門(mén)菌FliC蛋白第91位精氨酸在雞傷寒沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、甲型副傷寒沙門(mén)菌等23個(gè)血清型內(nèi)高度保守，R91S突變能夠改變腸炎沙門(mén)菌的鞭毛形態(tài)，減弱腸炎沙門(mén)菌的運(yùn)動(dòng)性，細(xì)胞黏附入侵能力及小鼠體內(nèi)定植能力，為腸炎沙門(mén)菌的疫苗研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。