王璐瑤，郝雪飄，雷白時,2，趙 款,2，張武超,2，袁萬哲,2*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，保定 071001；2. 河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心, 保定 071001)

2014年下半年以來，在我國櫻桃谷鴨群中報道了一種宿主范圍改變的鵝細小病毒(goose parvovirus，GPV)變異毒株，被命名為NGPV[1-2]。其臨床癥狀主要為雛鴨個頭矮小、發(fā)育遲緩、喙萎縮、舌頭外伸、跛行癱瘓、腹瀉、脛骨變短、易骨折，被稱為鴨短喙與侏儒綜合征(short beak and dwarfism syndrome，SBDS)[3]。主要感染小日齡雛鴨群，發(fā)病率隨年齡增長而降低[4]，患病鴨淘汰率高，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

目前，對于NGPV的研究更多集中于病原分離與鑒定、病毒的基因序列分析及PCR方法建立等方面，關(guān)于該病毒與宿主細胞相互作用的分子致病機制尚不清楚?；诖?，本研究通過建立NGPV感染雛鴨的動物模型，采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，分析感染后雛鴨肝、胸腺、回腸的基因轉(zhuǎn)錄表達譜差異,尋找參與感染發(fā)生的相關(guān)基因及其信號通路，為探究NGPV致病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒及動物

新型鵝細小病毒SD株(EID50：10-4.3·0.2 mL-1；GenBank登錄號：KY511124)，3日齡櫻桃谷鴨。

1.2 儀器/耗材

Nanodrop 紫外定量設(shè)備購自Thermo Scientific；2100生物分析儀、RNA 6000 nano kit均購自Agilent公司；電泳儀購自北京六一公司；凝膠成像系統(tǒng)購自北京百晶公司； Agarose購自Invitrogen公司；Marker購自TaKaRa公司；

1.3 樣本的采集

將6只雛鴨隨機分為對照組和感染組。對照組肌肉注射生理鹽水0.2 mL·只-1，感染組肌內(nèi)注射NGPV SD株0.2 mL·只-1。在處理后14 d,采集兩組雛鴨肝、胸腺和回腸，-80 ℃保存。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

提取雛鴨肝、胸腺和回腸的總RNA， RNA質(zhì)量檢測，純化mRNA，將mRNA片段化并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，文庫構(gòu)建，Illumina平臺上機測序(由上海派森諾公司完成)。

2 結(jié) 果

2.1 表達差異分析

結(jié)果顯示(圖1)：感染組回腸中上調(diào)基因有78個，下調(diào)基因有31個；感染組胸腺中上調(diào)基因有111個，下調(diào)基因有78個；感染組肝中上調(diào)基因有128個，下調(diào)基因有313個。

圖1 差異表達基因統(tǒng)計結(jié)果Fig.1 Statistical graph of the results of differentially expressed genes

2.2 GO富集分析

GO富集分析涵蓋3個方面，分別描述基因的分子功能(molecular function，MF)、細胞的組分(cellular component，CC)、參與的生物學(xué)過程(biological process，BF)。

回腸差異基因在免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、核苷結(jié)合、抗原結(jié)合、細胞因子活性、碳水化合物衍生物等BF和MF中顯著富集(P<0.05)。

胸腺差異基因在免疫效應(yīng)過程、淋巴細胞介導(dǎo)的免疫、補體激活、白細胞介導(dǎo)的免疫、免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答的激活、細胞黏附等BF顯著富集(P<0.05)。

肝差異基因在異源生物跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、生物黏附、細胞表面受體信號通路、己糖激酶活性、葡萄糖結(jié)合、神經(jīng)酰胺代謝過程等BF和MF中顯著富集(P<0.05)。

2.3 KEGG富集分析

回腸中差異基因在Toll樣受體信號通路、ECM-受體相互作用、JAK-STAT信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、Th1和Th2細胞分化、炎癥介質(zhì)對色氨酸通道的調(diào)節(jié)等過程顯著富集(P<0.05)。

胸腺中差異基因在NF-κB信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、FcεRI信號通路、FcγR介導(dǎo)的吞噬作用、PI3K-Akt信號通路、抗原處理和提呈、Apelin信號通路等過程有顯著富集(P<0.05)。

肝差異基因在Rap1信號通路、Ras信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、淀粉和蔗糖代謝、抗原處理和提呈等過程顯著富集(P<0.05)。

3 討 論

本研究中，建立了NGPV感染雛鴨動物模型，通過PCR檢測感染組組織均為陽性，對照組組織均為陰性。

NGPV具有組織泛嗜性，有人推測禽類細小病毒感染后最早在腸壁發(fā)生復(fù)制，再通過血液達到次級靶器官[5]。但對于NGPV感染后病毒載量分布情況目前沒有統(tǒng)一的研究結(jié)論，研究顯示，NGPV感染后在腸道、肝、胸腺的病毒載量相對較高[6-8]。所以，本研究對感染NGPV雛鴨的胸腺、回腸和肝進行轉(zhuǎn)錄組測序，探究NGPV的感染對雛鴨組織的基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。

NGPV感染后，回腸差異表達基因參與多個免疫相關(guān)生物學(xué)過程；差異表達基因涉及Toll樣受體信號通路、JAK-STAT信號通路、Th1和Th2細胞分化。其中，Toll樣受體信號通路和JAK-STAT信號通路都是重要的抗病毒信號通路，Toll樣受體信號通路可通過多種途徑激活多種免疫細胞，啟動天然免疫應(yīng)答[9]；NGPV感染可以激活TLR3受體觸發(fā)有效的抗病毒天然免疫應(yīng)答[10]。差異表達基因OASL上調(diào)7.82倍， OASL表達可通過JAK-STAT信號通路途徑發(fā)揮抗病毒活性[11]，在抗病毒過程起重要作用。

NGPV感染后，胸腺差異表達基因也參與多個免疫相關(guān)生物學(xué)過程，差異表達基因涉及NF-κB信號通路、B細胞受體信號通路、FcεRI信號通路等多個通路。其中，上調(diào)基因CCL19參與NF-κB信號通路、細胞因子相互作用、趨化因子信號通路等，在炎癥形成過程中起重要作用[12]。

肝感染NGPV后差異表達基因在MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集。研究表明，PI3K-Akt、HIF-1信號通路與某些病毒復(fù)制有關(guān)[13-15]。差異上調(diào)基因中EPSPI1、OASL、IFITM2均在抗病毒免疫中起重要作用[11, 16]。

4 結(jié) 論

NGPV感染雛鴨后，肝、胸腺、回腸差異表達基因參與多個免疫相關(guān)生物學(xué)過程，并在PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、JAK-STAT信號通路等多個經(jīng)典信號通路富集，提示NGPV感染宿主后激活了宿主免疫反應(yīng)及相關(guān)抗病毒信號通路，從而對抗病毒感染。