何綠琴，閆雪鋒，文心田，曹三杰，黃小波，伍 銳，趙 勤，文翼平*

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 豬病研究中心，成都 611130； 2. 西南醫(yī)科大學(xué)科技處 實驗動物中心，瀘州 646000； 3. 西南醫(yī)科大學(xué)體育學(xué)院，瀘州 646000)

副豬嗜血桿菌(Glaesserellaparasuis)是一種非運動性、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 依賴的細菌[1]，可引起仔豬的豬格氏病(Gl?sser’s disease)[2]，給全世界養(yǎng)豬行業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[3-4]。副豬嗜血桿菌主要臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、跛行、共濟失調(diào)、皮毛粗糙[5-6]。副豬嗜血桿菌常定植于豬上呼吸道，宿主遇到壓力時，可穿透黏膜屏障進入血流，導(dǎo)致嚴重的血管病變和多種綜合征[7]。

雙組分系統(tǒng)由位于細胞膜上的組氨酸蛋白激酶(HK)和細胞質(zhì)中的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(RR)組成[8]，參與調(diào)控細菌的生長繁殖、代謝、運動、耐藥和毒力因子的表達[9]。雙組分系統(tǒng)廣泛存在于副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門菌、流感嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌中[10-15]。

QseBC雙組分系統(tǒng)是腸桿菌科細菌和巴氏桿菌中重要的毒力調(diào)控因子[16]。QseC是一種跨膜蛋白，作為密度感應(yīng)的組氨酸激酶受體[17]，參與體內(nèi)細菌運動、細胞侵襲和競爭性定植。在大腸桿菌中，QseC誘導(dǎo)autoinducer-3和/或腎上腺素/去甲腎上腺素信號分子的自磷酸化，并將磷酸基團轉(zhuǎn)移到QseB，調(diào)節(jié)毒力相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[18]。qseC基因缺失時，細胞內(nèi)細菌群落(IBCs)形成的缺陷削弱了副豬嗜血桿菌感染小鼠的能力[11,19-20]。QseC在大腸桿菌中誘導(dǎo)腎上腺素并促進生物膜形成。QseB調(diào)控傷寒沙門菌的生物膜形成和毒力[21]。

在這項研究中，作者通過自然轉(zhuǎn)化法構(gòu)建了ΔqseBC雙基因缺失株，并對其在血清抗性、生物膜形成、抗生素抗性和脅迫耐受性中的作用進行了研究，以確定QseBC雙組分系統(tǒng)在副豬嗜血桿菌致病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株、引物及細菌生長條件

本研究中使用的菌株見表1，引物見表2。野生型菌株SC1401(血清型11型)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心提供。ΔqseC、ΔqseBC基因缺失株和互補菌株(C-ΔqseBC)由本實驗室在前期研究中構(gòu)建并保存[22]。副豬嗜血桿菌在胰蛋白酶大豆肉湯(TSB；Difco，美國)或胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA；Difco NJ，美國)平板上生長，補充5% 滅活牛血清和0.1% 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD; Sigma-Aldrich, USA)。培養(yǎng)基因缺失株或互補株時，培養(yǎng)基中添加卡那霉素(50 μg·mL-1)或慶大霉素(20 μg·mL-1)。

表1 本研究所用的菌株

1.2 ΔqseBC缺失株和互補株的復(fù)蘇及鑒定

ΔqseBC基因缺失株和互補株C-ΔqseBC由本實驗室在之前的研究中構(gòu)建和保存[22]。將凍干菌株SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC從-80 ℃冰箱中取出。用接種環(huán)小心挑取細菌，放入裝有TSB培養(yǎng)基的試管中，37 ℃培養(yǎng)13 h，吸取菌液進行PCR鑒定。用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計基因缺失及鑒定引物(表2)。

表2 本研究所用的引物

1.3 抗血清殺菌試驗

抗血清殺菌試驗按照之前描述的方法進行[23]。取健康仔豬血清，用0.22 μm濾膜過濾。部分血清在56 ℃下處理30 min，使補體失活。SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC在TSB中培養(yǎng)至OD600 nm為0.8。然后，80 μL細菌培養(yǎng)物與20 μL新鮮血清或熱處理血清混合。混合物在37 ℃下輕輕搖動孵育1 h，隨后將混合物稀釋后涂布于TSA板上，37 ℃孵育24 h。通過測定新鮮血清和熱處理血清中菌落的比例來計算存活率。每個樣本至少進行3次重復(fù)。

1.4 壓力耐受試驗

壓力耐受試驗根據(jù)之前描述的方法進行。將50 μL SC1401、ΔqseBC和 C-ΔqseBC的過夜培養(yǎng)物以1∶100 的稀釋度傳代培養(yǎng)到 5 mL TSB中，培養(yǎng)至OD600 nm為0.8。對于滲透壓耐受能力測定，細菌分別在50、100、150和 200 mmol·L-1NaCl 的 TSA 板上培養(yǎng)。對于氧化應(yīng)激耐受試驗，將細菌分別用1、2、4、8、16 mmol·L-1的H2O2處理30 min。對于熱休克試驗，細菌分別在39、42或 45 ℃中孵育30 min。每個菌株未處理菌液作為陰性對照納入每個試驗。培養(yǎng)后，在PBS中連續(xù)稀釋培養(yǎng)物，并通過平板計數(shù)測定CFU?？箲?yīng)激細胞的百分比計算為[(應(yīng)激樣品CFU·mL-1)/(對照樣品CFU·mL-1)]×100%。每項分析單獨進行3次。

1.5 微孔板生物被膜檢測試驗

生物被膜的形成有助于細菌抵御不良環(huán)境的侵害，幫助其逃避宿主的免疫系統(tǒng)和抗生素的作用，導(dǎo)致細菌的抵抗能力增強[24]。由于副豬嗜血桿菌野生型菌株CF7066及其突變株ΔclpP可以在48 h形成生物膜[7]，并且流感嗜血桿菌也具有在24 h形成生物膜的能力[25]。參考之前報道進行生物被膜形成試驗[14]，通過96孔微孔板定量檢測副豬嗜血桿菌的生物被膜形成[26]。利用生物被膜內(nèi)物質(zhì)可與某些染料結(jié)合的特點，通過對生物被膜染色的方法進行定性或定量分析。為了確定基因缺失菌株的生物膜形成是否隨著時間的推移始終低于野生菌株。將生物膜形成觀察時間延長至96 h。將SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC接種96孔圓底微量滴定板，37 ℃分別培養(yǎng)48、72和96 h。去除細菌懸浮液，流水洗滌松散黏附在微孔板上的細菌，將微孔板上的生物膜用 99%的甲醇溶液固定15 min，移除甲醇，自然干燥后用0.1%的Hucker’s結(jié)晶紫(CV)溶液染色30 min，再經(jīng)水洗、干燥，33%的乙酸溶解被結(jié)合的結(jié)晶紫。最后在595 nm處測量光密度(OD)。副豬嗜血桿菌SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC均設(shè)8個重復(fù)孔，試驗獨立進行3 次。采用t檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 抗生素敏感性測定

抗生素敏感性試驗參考文獻[27]進行。浮游細菌的最小抑制濃度(MIC-P)通過肉湯微量稀釋測定法測定，使用新鮮TSB培養(yǎng)基進行連續(xù)2倍稀釋。微量滴定板在 37 ℃ 下孵育，并在 24 h后對生長或不生長進行目測評分。

生物膜細菌的最小殺菌濃度(MBC-B)按所述方法確定[28]。將 96 孔微量滴定板中過夜培養(yǎng)的生物膜菌暴露于連續(xù)稀釋的抗生素至少24 h。然后，用新鮮 TSB 替換含抗生素的培養(yǎng)基并培養(yǎng) 24 h。將菌液涂布于TSA 培養(yǎng)觀察菌落個數(shù)來評估生物膜中細菌的生存能力。所有試驗獨立進行3次。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用GraphPad PRISM 5.0軟件分析，當兩個試驗組進行比較時使用t檢驗分析，當3個或更多試驗組進行比較時使用ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1 ΔqseBC缺失株和互補株的復(fù)蘇與鑒定

對復(fù)蘇的細菌進行PCR鑒定(圖1)。只有SC1401和C-ΔqseBC中能擴增出qseB(672 bp)和qseC(1 401 bp)條帶，而ΔqseBC中無法擴增出對應(yīng)條帶。當使用引物Kan-F/R檢測時，親本株不產(chǎn)生條帶，缺失株和互補株產(chǎn)生條帶，大小為935 bp。

SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC均能擴增出822 bp 條帶，表明三者均為副豬嗜血桿菌。使用引物 P5 (qseB-F)/P6 (qseB-R) 從野生株和互補株中擴增出672 bp的qseB基因片段，但未從基因缺失株中擴增出此條帶。使用引物 P7 (qseC-F)/P8 (qseC-R) 從野生株和互補株中擴增出1 401 bp的qseC基因片段，但未從基因缺失株中擴增出此條帶。使用引物P1(Kan-F)/P2(Kan-R)從基因缺失株和互補株中擴增出935 bp的kan片段，但野生型菌株SC1401中沒有擴增出此條帶，表明ΔqseBC基因缺失株及其互補菌株構(gòu)建成功。

M.DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1、5、9. 引物HPS-F/ R鑒定；2、6、10. 引物qseB-F/ R鑒定；3、7、11. 引物qseC-F/ R鑒定；4、8、12. 引物Kan-F/ R鑒定M.DL5000DNA marker；1, 5, 9. Identification with primers HPS-F/ R; 2, 6,10. Identification with primers qseB-F/R; 3,7,11. Identification with primers qseC-F/R; 4, 8,12. Identification with primers Kan-F/ R圖1 ΔqseBC基因缺失株和互補株的鑒定Fig.1 Identification of ΔqseBC mutant and complementary strain C-ΔqseBC

試驗進行3次重復(fù)，每次重復(fù)設(shè)3個平行組，誤差線代表3次重復(fù)試驗的標準差,星號表示使用雙向方差分析的統(tǒng)計顯著性(***. P<0.001)Data indicate the means of three independent experiments performed in duplicate, and error bars show standard deviations. Asterisks indicate a statistical significance using a two-way ANOVA (***. P<0.001)圖2 SCl401、ΔqseBC和C-ΔqseBC在豬血清中的存活率Fig.2 Survival rate of SCl401, ΔqseBC and C-ΔqseBC treated with porcine serum

2.2 親本株和缺失株抗血清殺菌能力比較

結(jié)果(圖2)顯示，野毒株SC1401具有更高水平的抗血清殺菌能力(P<0.05)。ΔqseBC、SC1401和C-ΔqseBC的存活率分別為55.12%、83.76%和81.81%。這些結(jié)果表明QseBC可能與副豬嗜血桿菌抗血清殺菌能力相關(guān)。

2.3 野毒株和缺失株對環(huán)境壓力耐受能力比較

本研究測定了SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC在不同脅迫條件下的存活率。當細胞暴露于50、100和150 mmol·L-1NaCl，ΔqseBC的存活率分別為84.12%、45.35%和15.75%，遠低于SC1401(92.96%、82.85% 和35.5%)(圖3A)。細胞用1、2、4、8和16 mmol·L-1H2O2處理30 min時，ΔqseBC的存活率為50.71%～68.90%，遠低于SC1401(67.14%～94.70%)(圖3B)。在熱休克試驗中也觀察到類似結(jié)果，ΔqseBC的存活率在39、42 ℃分別為94.57%和82.12%，與SC1401(94.57%和82.12%)相比顯著降低。在45 ℃下孵育時，SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC菌株無法存活(圖3C)。C-ΔqseBC恢復(fù)了對滲透壓、氧化應(yīng)激和熱休克的耐受能力。這些結(jié)果表明，qseBC雙基因的缺失削弱了副豬嗜血桿菌對氧化、高滲和熱休克應(yīng)激的耐受力，證實qseBC是副豬嗜血菌中的脅迫相關(guān)基因。

2.4 野毒株和缺失株生物被膜形成能力比較

本研究采用生物被膜結(jié)晶紫染色法對其含量進行定量測定。如圖4所示，缺失株ΔqseBC的生物被膜經(jīng)過Hucker’s結(jié)晶紫(CV)染色后著色較淺，然后用33%的乙酸溶解被結(jié)合的結(jié)晶紫，發(fā)現(xiàn)ΔqseBC的OD595 nm顯著低于野毒株SC1401和互補株。結(jié)果表明QseBC直接或間接參與了生物膜形成的調(diào)控。

2.5 野毒株和缺失株對抗生素的敏感性比較

如表3所示，野毒株SC1401對對頭孢噻呋、氨芐青霉素、多黏菌素B和強力霉素的MIC分別是△qseBC相應(yīng)值的16、8、4、4倍，而對恩諾沙星、慶大霉素、青霉素、林可霉素和替米考星的MIC分別是△qseBC相應(yīng)值的2倍。然后，作者使用 MBC-B來檢查 QseBC是否參與生物膜細胞的抗生素抗性(表3)，缺失株與野毒株表現(xiàn)出相似的抗性水平。QseBC在浮游細胞和生物膜細胞中均對同一類抗生素產(chǎn)生抗性，但氟苯尼考除外，△qseBC的MBC-B較SC1401降低了50%(表3)。與新霉素的MIC-P結(jié)果相似，△qseBC對新霉素的抗性較SC1401增加100%。大多數(shù)抗性在互補菌株C-△qseBC中恢復(fù)，表明基因缺失株的抗生素敏感性不是由極性效應(yīng)引起的。綜上，這些結(jié)果表明QseBC 參與了副豬嗜血桿菌的浮游和生物膜細胞對多種抗生素藥物的耐藥性。

A. 滲透壓(50、100 和150 mmol·L-1 NaCl)；B. 氧化應(yīng)激(1、2、4、8和 16 mmol·L-1 H2O2)；C. 高溫(39和42 ℃水浴)。存活百分比計算為在應(yīng)激條件下處理的細菌數(shù)量與在無應(yīng)激條件下存活的細菌數(shù)量的比值。數(shù)據(jù)表示3個獨立試驗的平均值，誤差線表示標準偏差。星號表示使用雙向方差分析的統(tǒng)計顯著性(**. P<0.01; ***. P<0.001)A. Osmotic pressure (50, 100 and 150 mmol·L-1 NaCl); B. Oxidative stress (1, 2, 4, 8 and 16 mmol·L-1 H2O2)；C. High temperature (Incubated in 39 and 42 ℃ water baths). Percent survival was calculated as the ratio of the number of bacteria that treated with stress conditions to the number that survived without stress conditions. Data indicate the means of three independent experiments performed in duplicate, and error bars show standard deviations. Asterisks indicate a statistical significance using a two-way ANOVA (**. P<0.01; ***. P<0.001)圖3 副豬嗜血桿菌SCl401、ΔqseBC和C-ΔqseBC對滲透壓、氧化應(yīng)激和高溫的耐受力Fig.3 Analysis of the stress tolerance of Glaesserella parasuis strains SC1401, ΔqseBC and C-ΔqseBC

3 討 論

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)報道的副豬嗜血桿菌的基因組，主要有4對雙組分系統(tǒng)，分別是CpxA/R、UhpA/Uhpb、QseB/C和ArcA/B。先前研究中，qseB(cheY) 或qseC單基因的缺失影響了副豬嗜血桿菌的部分生物學(xué)特性[10,29]。然而，這可能是由于不同雙組分系統(tǒng)之間的強串擾所致，并不能直接表明是qseB或qseC基因的作用。為進一步研究QseBC 雙組分系統(tǒng)與副豬嗜血桿菌致病機制的關(guān)系，本研究采用自然轉(zhuǎn)化法探究從副豬嗜血桿菌SC1401基因組中同時敲除qseB和qseC基因獲得ΔqseBC雙基因缺失株。繼而比較了缺失株和野生株的抗血清殺菌能力、壓力耐受能力、生物被膜形成能力和對部分抗生素的敏感性。

細菌分別培養(yǎng)48(A)、72(B)和96 h(C)。通過測量OD595 nm對生物膜生成情況進行定量。左圖為生物膜染色結(jié)果，右圖為采用33%的乙酸溶解結(jié)晶紫的脫色結(jié)果。試驗獨立進行3次，誤差線代表3個獨立試驗的標準偏差。星號表示使用雙向方差分析 (***. P<0.001)的統(tǒng)計顯著性Biofilms were cultured for 48 (A), 72 (B) and 96 h (C), respectively. The remaining biofilms were quantitated by OD595nm measurement. The left picture shows the result of biofilm staining, and the right picture shows the decolorization result of crystal violet dissolved with 33% acetic acid. The experiments were performed three times independently in triplicates. Quantification of biofilm production. Error bars represent the standard deviations of three independent experiments. Asterisks indicate statistical significance using a two-way ANOVA (***. P<0.001)圖4 副豬嗜血桿菌SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC在96孔微量滴定板中形成的生物被膜Fig.4 Detachment of biofilm colonies of G.parasuis WT, ΔqseBC and C-ΔqseBC grown in 96-well microtiter plates

細菌生物被膜的形成會增加病原菌對抗生素的抵抗力, 生物被膜形成對于引起持續(xù)感染至關(guān)重要[30-32]。QseBC雙組分系統(tǒng)參與了伴放線菌和大腸桿菌的生物被膜形成[3,19,33-35]，并通過修飾毒力相關(guān)的表面結(jié)構(gòu)，如鞭毛、菌毛和分泌系統(tǒng)等，調(diào)節(jié)遲發(fā)性大腸桿菌的細胞內(nèi)毒力[5]。副豬嗜血桿菌中PotD、galU、galE、ClpP等基因均參與了該菌生物被膜等形成[7,23,36]，在先前研究中發(fā)現(xiàn)，副豬嗜血桿菌的ΔqseB和ΔqseC基因缺失株與野毒株相比，生物被膜形成能力明顯減弱[10,29]。在本研究中，副豬嗜血桿菌qseB和qseC雙基因缺失后，形成的生物被膜明顯弱于野毒株。

抗血清殺菌能力是病原菌抵抗宿主殺傷作用，引起宿主全身性感染的重要工具。Ding等[37]通過自然轉(zhuǎn)換敲除ArcA/B雙組分系統(tǒng)中的arcA基因，發(fā)現(xiàn)arcA基因參與副豬嗜血桿菌的血清抗性和毒力。謹瑾等[36]構(gòu)建了副豬嗜血桿菌potD基因缺失株，發(fā)現(xiàn)potD基因的缺失導(dǎo)致該菌的抗血清殺菌能力顯著降低。Zou等[23]發(fā)現(xiàn)galU和galE基因在副豬嗜血菌 SC096 菌株的血清抗性中起關(guān)鍵作用。本研究顯示，與野毒株SC1401相比，ΔqseBC對豬血清殺菌活性的敏感性明顯增加。

表3 副豬嗜血桿菌野生菌株SC1401、△qseBC缺失株和互補株對不同抗菌物質(zhì)的敏感性

細菌侵入宿主面臨巨大的生存壓力。副豬嗜血桿菌通常定植于豬的上呼吸道和肺部以及其他富含活性氧的部位，對細菌的生存是巨大挑戰(zhàn)。QseBC與腸出血性大腸桿菌和鼠傷寒沙門菌適應(yīng)宿主環(huán)境有關(guān)，可通過感應(yīng)腎上腺素、去甲腎上腺素和自誘導(dǎo)劑 3 來調(diào)節(jié)毒力相關(guān)基因的表達[30, 38]。為了研究QseBC是否影響副豬嗜血桿菌對外界壓力的耐受能力，作者在體外使用H2O2、高濃度 NaCl和高溫對SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC進行處理，發(fā)現(xiàn) ΔqseBC對高溫、氧化應(yīng)激和滲透壓的耐受能力明顯下降，表明QseBC參與了副豬嗜血桿菌對外界壓力的耐受能力。

迄今為止，大多數(shù)已發(fā)表的關(guān)于細菌耐藥性的研究主要集中在浮游細菌，而對生物膜細菌知之甚少。Cao等[33]研究發(fā)現(xiàn)Cpx雙組分系統(tǒng)與副豬嗜血桿菌應(yīng)激耐受和對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性相關(guān)。Feng等[39]發(fā)現(xiàn)acrB基因缺失后副豬嗜血桿菌對新生霉素、紅霉素、克拉霉素和阿奇霉素敏感性增強。眾所周知，生物膜中的細菌比浮游細菌對抗生素的耐受力更強。然而，其耐藥機制仍不完全清楚，需進一步研究。本研究表明，與親本菌株相比，ΔqseBC基因缺失株的浮游細菌和生物膜細菌對抗生素藥物的敏感性顯著增加。作者推測QseBC可能參與了一些耐藥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，導(dǎo)致ΔqseBC較野生菌株SC1401增加了藥物敏感性。而具體的耐藥機制有待進一步研究。

4 結(jié) 論

qseB/C雙基因的缺失影響副豬嗜血桿菌對滲透壓、氧化應(yīng)激和高溫的耐受性，導(dǎo)致該菌生物被膜形成能力、抗血清殺菌能力和對抗生素的耐藥性減弱。QseBC雙組分系統(tǒng)可能與副豬嗜血桿菌的致病性相關(guān)。