豆夢(mèng)瑩，張 才，李元曉*，邵 琦，朱佳麗，李 旺，曹志軍

(1. 河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽(yáng) 471023； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193)

熱應(yīng)激是造成畜禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的主要原因之一，而奶牛對(duì)熱尤為敏感，熱應(yīng)激是全球奶業(yè)面臨的重要挑戰(zhàn)[1-2]。熱應(yīng)激不僅會(huì)導(dǎo)致奶牛生產(chǎn)性能下降，而且還會(huì)引起奶牛機(jī)體免疫機(jī)能下降和繁殖功能障礙等[3-4]。當(dāng)發(fā)生熱應(yīng)激時(shí)，機(jī)體會(huì)啟動(dòng)散熱機(jī)制，流經(jīng)腸道的血流量減少，導(dǎo)致腸道缺血、缺氧，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，造成腸上皮細(xì)胞損傷且增殖受到影響，使腸道黏膜屏障通透性增加，機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)甚至死亡[5-7]?？梢?jiàn)，腸道損傷是熱應(yīng)激奶牛的重要病理變化。腸道不僅是奶牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的器官，也是在奶牛免疫防御的重要屏障，改善熱應(yīng)激狀態(tài)下奶牛的腸道健康對(duì)奶牛的健康和生產(chǎn)性能具有重要的意義。利用營(yíng)養(yǎng)調(diào)控來(lái)緩解或修復(fù)腸道損傷已成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)，其中，氨基酸營(yíng)養(yǎng)(如谷氨酸、色氨酸等)緩解動(dòng)物腸道損傷的研究也多有報(bào)道[8-9]。

精氨酸是一種條件性必需氨基酸，也是動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞內(nèi)功能最多的氨基酸，不僅是合成蛋白質(zhì)的原料以及多種生物活性物質(zhì)(如一氧化氮、多胺、肌酸等)的前體物質(zhì)，而且還具有抗炎、抗氧化、促進(jìn)腸道功能發(fā)育等生理功能[10-13]。在微生物改變、熱應(yīng)激、膿毒血癥等應(yīng)激或疾病狀態(tài)下[14-16]，動(dòng)物機(jī)體對(duì)精氨酸的營(yíng)養(yǎng)需求量還會(huì)增加。研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸恢復(fù)細(xì)胞正常生長(zhǎng)的作用是其他氨基酸不可替代的[17]。通過(guò)體外模型研究精氨酸對(duì)腸道上皮細(xì)胞熱應(yīng)激損傷的保護(hù)作用和機(jī)制，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中合理使用精氨酸以減少熱應(yīng)激造成的損失具有重要的意義。而體外培養(yǎng)小腸上皮細(xì)胞熱應(yīng)激模型在鼠、豬、雞、山羊的熱應(yīng)激研究中得到了廣泛應(yīng)用[18-21]。因此，本研究在建立奶牛原代小腸上皮細(xì)胞熱應(yīng)激損傷模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞增殖以及線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵基因Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)mRNA和蛋白的表達(dá)，探究精氨酸對(duì)熱應(yīng)激奶牛腸道上皮細(xì)胞損傷修復(fù)效果，以期為精氨酸修復(fù)奶牛腸道屏障損傷提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

精氨酸(L-Arginine，純度>99%)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司，DMEM培養(yǎng)基、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚鹽酸核苷酸染料(DAPI)以及Ⅰ型膠原酶購(gòu)自Gibco公司。胎牛血清(FBS)購(gòu)自德國(guó)PAN-Biotech GmbH。磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、青霉素與鏈霉素混合液(100×)以及Cell Counting Kit(CCK-8)活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Solarbio公司。乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(型號(hào)A020-2-2)購(gòu)自南京建成生物工程研究所。牛Bax、Bcl-2、Caspase-3以及Caspase-9檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司。PrimeScriptTMRT reagent kit(反轉(zhuǎn)錄試劑盒)以及SYBR?Fast qPCR Mix(熒光定量試劑盒)購(gòu)自TaKaRa公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Thermo公司)，Scientific Multiskan FC型酶標(biāo)儀及超微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀(美國(guó)Thermo公司)，Axio Observer A1倒置熒光顯微鏡(德國(guó)蔡司公司)，CFX96熒光定量PCR儀(Bio-RAD公司)，流式細(xì)胞儀CytoFLEXS(美國(guó)貝克曼公司)。

1.2 奶牛原代小腸上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)

將1日齡荷斯坦?fàn)倥０矘?lè)死后，剪取15 cm長(zhǎng)的十二指腸放到預(yù)冷的含4%雙抗的生理鹽水中，盡快轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。采用膠原酶消化法獲取奶牛小腸上皮細(xì)胞[22]。根據(jù)成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞貼壁時(shí)間不同[20]，將細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶培養(yǎng)1 h后，將細(xì)胞上清液吸出，接種到新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，以上步驟重復(fù)3次，此時(shí)小腸上皮細(xì)胞純度可達(dá)90%左右。將分離得到的小腸上皮細(xì)胞于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換1次液，細(xì)胞鋪滿90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化第2代奶牛小腸上皮細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮變圓時(shí)加培養(yǎng)基終止消化，離心后加培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并將細(xì)胞吹打均勻，取少量細(xì)胞懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞懸液的總細(xì)胞數(shù)，加培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于96孔板(1×105個(gè)·mL-1)或6孔板(1×106個(gè)·mL-1)，用于后續(xù)試驗(yàn)。試驗(yàn)用的是第3代奶牛小腸上皮細(xì)胞。

1.3 試驗(yàn)分組和處理

1.3.1 精氨酸添加濃度的篩選 將奶牛小腸上皮細(xì)胞分為空白對(duì)照組(Con組)和試驗(yàn)組，試驗(yàn)組包括熱應(yīng)激組(HS組)和不同濃度精氨酸組(L-Arg組)，每組6個(gè)重復(fù)。處理過(guò)程如下：1)對(duì)照組、試驗(yàn)組均用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，Con組于37 ℃、試驗(yàn)組于42 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h[9,23]。2)棄去培養(yǎng)基用PBS洗兩次，Con組、HS組繼續(xù)用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，L-Arg組更換成不同濃度(2、4、6、8、10 mmol·L-1) 的精氨酸培養(yǎng)基培養(yǎng)，所有處理組均于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后檢測(cè)細(xì)胞活力，篩選出最佳的精氨酸添加濃度，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 精氨酸對(duì)熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響 將奶牛小腸上皮細(xì)胞分為對(duì)照組(Con組)、熱應(yīng)激組(HS組)和6 mmol·L-1精氨酸組(6 mmol·L-1L-Arg組)，每組6個(gè)重復(fù)。處理過(guò)程如下：1)3組細(xì)胞均用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，Con組于37 ℃、HS組和6 mmol·L-1L-Arg組于42 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。2)棄去培養(yǎng)基用PBS洗兩次，Con組、HS組繼續(xù)用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，6 mmol·L-1L-Arg組更換成6 mmol·L-1精氨酸培養(yǎng)基培養(yǎng)，3個(gè)處理組均于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力

按照“1.3.1”試驗(yàn)步驟對(duì)奶牛小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和處理后，棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗1遍，每孔加入100 μL不含血清的培養(yǎng)基和10 μL的CCK-8試劑在37 ℃中孵育2 h，用酶標(biāo)儀450 nm測(cè)OD值以計(jì)算細(xì)胞活力。選擇細(xì)胞活力最高的精氨酸濃度作為后續(xù)試驗(yàn)的濃度。

1.5 DAPI染色觀察細(xì)胞的核形態(tài)變化

按照“1.3.2”試驗(yàn)步驟對(duì)奶牛小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和處理后，棄去培養(yǎng)基，每孔加100 μL 4%多聚甲醛固定20 min；棄甲醛，每孔加200 μL PBS液清洗兩次；每孔加DAPI溶液(10 μg·mL-1)，避光作用20 min；用PBS溶液清洗兩次，置于倒置熒光顯微鏡下在相同熒光強(qiáng)度和曝光時(shí)間下采集圖像信息，激發(fā)光波長(zhǎng)為345 nm，發(fā)射光強(qiáng)度為455 nm。

1.6 微板法檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)含量

按照“1.3.2”試驗(yàn)步驟對(duì)奶牛小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

按照“1.3.2”試驗(yàn)步驟對(duì)奶牛小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和處理后，用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞2次，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，加入-20 ℃預(yù)冷的75%乙醇固定細(xì)胞，4 ℃放置24 h。用冷PBS清洗細(xì)胞，2 500×g離心5 min，加入2 μL濃度為1 mg·mL-1的RNase去除RNA。加入100 μL PI染色液，避光染色20 min。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)585 nm。用Modfit軟件分析細(xì)胞周期以確定細(xì)胞周期分布。

1.8 RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)

用PBS清洗細(xì)胞兩遍，用TRIzol提取總RNA，超微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀檢測(cè)其濃度和純度，OD260 nm/OD280 nm=1.9～2.0 表示RNA純度較高；用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 于-20 ℃冰箱保存。根據(jù)NCBI公布的牛的目的基因CyclinE1、CyclinB、CyclinG1、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9和內(nèi)參基因GAPDH的mRNA序列，使用Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，委托生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL:2×SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，RNase Free ddH2O 4 μL。每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù)。采用2-△△Ct法計(jì)算各組基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.9 ELISA檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白含量

按照“1.3”試驗(yàn)步驟對(duì)奶牛小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和處理后，用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞2次，用細(xì)胞刮板將細(xì)胞從6孔板底部刮下，置于1.5 mL的EP管中。用細(xì)胞破碎儀破碎，得到待測(cè)樣本。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的蛋白含量。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)先用EXCEL進(jìn)行整理，然后利用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異顯著。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié) 果

2.1 精氨酸對(duì)熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，與Con組相比，HS組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)；與HS組相比，精氨酸濃度為2、4 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活力差異不顯著(P>0.05)；精氨酸濃度為6 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活力顯著高于HS組(P<0.05)，且低于Con組(P<0.05)；精氨酸濃度為10 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活力受到抑制(P<0.05)。

2.2 精氨酸對(duì)熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響

如圖2(Ⅰ)和(Ⅱ)所示，與Con組相比，HS組染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞的核形態(tài)不規(guī)則變化。與HS組相比，6 mmol·L-1L-Arg組染色濃縮、細(xì)胞的核形態(tài)不規(guī)則變化減少。

2.3 精氨酸對(duì)細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶(LDH)含量的影響

由圖2G可知，與Con組相比，HS組上清液中LDH 的含量顯著升高(P<0.05)。與HS 組相比，6 mmol·L-1L-Arg組上清液LDH的含量顯著降低(P<0.05)，與Con組相比差異不顯著(P>0.05)。

表1 引物序列

數(shù)據(jù)柱標(biāo)含有相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Value columns with the same small letter mean no significant difference (P>0.05)，while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below圖1 精氨酸對(duì)熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of L-Arg on the activity of bovine intestinal epithelial cells challenged by heat stress

2.4 精氨酸對(duì)熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細(xì)胞周期細(xì)胞比率的影響

由圖3和表2可知，與Con組相比，HS組G1期細(xì)胞比率升高(P<0.05)，S期細(xì)胞比率顯著降低(P<0.05)，G2期細(xì)胞比率無(wú)顯著差異(P>0.05)；6 mmol·L-1L-Arg組G1期和G2期細(xì)胞比率顯著低于Con組和HS組(P<0.05)，S期細(xì)胞比率顯著高于Con組和HS組(P<0.05)。

2.5 精氨酸對(duì)熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細(xì)胞調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

如圖4所示，HS組和6 mmol·L-1L-Arg組CyclinE1的mRNA相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，均顯著高于Con組(P<0.05)。與HS組相比，6 mmol·L-1L-Arg組的CyclinB和CyclinG1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于HS組(P<0.05)。 與Con組相比，HS組CyclinB和CyclinG1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均差異不顯著(P>0.05)。

2.6 精氨酸對(duì)熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖5可得，HS組Bax、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量以及Bax/Bcl-2比值均顯著高于Con組(P<0.05)。與HS組相比，6 mmol·L-1L-Arg組Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量以及Bax/Bcl-2比值顯著降低(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

(I).明場(chǎng)圖，(Ⅱ).DAPI染色圖；其中，A、D為對(duì)照組；B、E為熱應(yīng)激組；C、F為6 mmol·L-1精氨酸組；紅色箭頭指的是染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則；G.是細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶的含量(I) Bright field figure, (Ⅱ) DAPI staining diagram. A, D. Control group; B, E. Heat stress group; C, F. 6 mmol·L-1 L-Arg group. The red arrows refer to chromatin condensation and irregular nuclear morphology. G. The content of lactate dehydrogenase in the supernatant of cells圖2 精氨酸對(duì)熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細(xì)胞形態(tài)及乳酸脫氫酶含量的影響Fig.2 Effects of L-Arg on morphology and lactate dehydrogenase content of intestinal epithelial cells challenged by heat stress

圖3 各組細(xì)胞周期檢測(cè)Fig.3 Detection of cell cycle in each group

表2 精氨酸對(duì)小腸上皮細(xì)胞各期細(xì)胞比率的影響

圖4 精氨酸對(duì)小腸上皮細(xì)胞調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig.4 The effect of L-Arg on the expression of cell cycle regulation-related genes in intestinal epithelial cells

圖5 精氨酸對(duì)小腸上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of L-Arg on the expression of apoptotic-related genes in intestinal epithelial cells

2.7 精氨酸對(duì)熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細(xì)胞凋亡蛋白含量的影響

由圖6可知，與Con組相比，HS組的Bax、Caspase-3、Caspase-9的蛋白含量以及Bax/Bcl-2比值顯著升高(P<0.05)，HS組Bcl-2蛋白含量顯著降低(P<0.05)。6 mmol·L-1L-Arg組Bax、Caspase-3、Caspase-9的蛋白含量及Bax/Bcl-2比值顯著低于HS組(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2蛋白含量顯著高于HS組(P<0.05)；與Con組相比，6 mmol·L-1L-Arg 組Bax蛋白含量顯著升高(P<0.05)，而Caspase-3、Caspase-9蛋白含量及Bax/Bcl-2比值差異不顯著(P>0.05)，Bcl-2蛋白含量顯著降低(P<0.05)。

圖6 精氨酸對(duì)小腸上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of L-Arg on the expression of apoptotic-related proteins in intestinal epithelial cells

3 討 論

熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞凋亡，造成腸道黏膜屏障損傷[24]。預(yù)防或緩解腸道上皮損傷是解決奶牛熱應(yīng)激的有效策略。研究表明，功能性氨基酸精氨酸在胃腸道的生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟、修復(fù)等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用[25]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在2～10 mmol·L-1范圍內(nèi)，精氨酸濃度為6 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活力達(dá)到最高值；精氨酸濃度低于6 mmol·L-1，細(xì)胞活力隨著濃度的增加而增加；精氨酸濃度高于6 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活力逐漸降低，這可能是過(guò)量的精氨酸會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性[26]。細(xì)胞周期是細(xì)胞功能的基本過(guò)程，分為G1期、S期(DNA合成)、G2期以及M期(有絲分裂)[27]，細(xì)胞周期對(duì)進(jìn)一步研究細(xì)胞活力是非常重要的。熱應(yīng)激會(huì)使細(xì)胞阻滯在G0/G1期[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加6 mmol·L-1精氨酸后，G1期的細(xì)胞比率顯著低于熱應(yīng)激組，且6 mmol·L-1精氨酸組S期的細(xì)胞比率顯著高于熱應(yīng)激組和對(duì)照組，表明精氨酸可以緩解熱應(yīng)激造成的細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，這與前人的研究結(jié)果相符[27,29]。整個(gè)細(xì)胞周期進(jìn)程有多種細(xì)胞周期特異性蛋白(Cyclins)和蛋白依賴(lài)性蛋白激酶家族(CDKs)驅(qū)動(dòng)，如G1期到S期主要由CyclinD與CDK4/6的復(fù)合物和CyclinE與CDK2的復(fù)合物驅(qū)動(dòng)，G2期到M期主要由CyclinB與CDK1的復(fù)合物驅(qū)動(dòng)[29]。本研究中，熱應(yīng)激組S期的細(xì)胞比率顯著低于對(duì)照組和精氨酸組，但是CyclinE1基因的表達(dá)量要高于對(duì)照組，而與精氨酸組相比差異不顯著。這可能是熱應(yīng)激組CyclinE1基因在表達(dá)翻譯的過(guò)程受到了干擾。精氨酸組的CyclinE1和CyclinB基因的相對(duì)表達(dá)量均高于熱應(yīng)激組，表明精氨酸通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)了熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細(xì)胞的增殖。CyclinG1是新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白G家族的重要成員，其對(duì)細(xì)胞的進(jìn)程的調(diào)控具有正、負(fù)調(diào)節(jié)作用，這可能與CyclinG1作用的細(xì)胞和組織不同及其表達(dá)水平有關(guān)。有研究顯示，CyclinG1對(duì)小鼠子宮細(xì)胞增殖產(chǎn)生負(fù)面影響[30-31]。柳朝華[32]在研究CyclinG1在小鼠卵巢的表達(dá)及其與卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)CyclinG1可能作為細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)因子參與了卵泡生長(zhǎng)發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟過(guò)程的調(diào)控。Yue等[30]發(fā)現(xiàn)，CyclinG1呈孕激素依賴(lài)性表達(dá)，參與孕激素對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的促增殖作用。本研究中，精氨酸組的CyclinG1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，結(jié)合前面的研究結(jié)果，CyclinG1可能正向調(diào)控了熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細(xì)胞的增殖。乳酸脫氫酶(LDH)是一種穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)酶。當(dāng)細(xì)胞膜受損時(shí)，LDH會(huì)迅速釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清中，是細(xì)胞發(fā)生損傷的一種重要特征[33]。精氨酸可以促進(jìn)細(xì)胞損傷修復(fù)。Zhang等[34]研究報(bào)道，培養(yǎng)基中添加100 μmol·L-1精氨酸能顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的綿羊腸上皮細(xì)胞LDH的釋放量。梁鑫[35]研究發(fā)現(xiàn)，25 mmol·L-1精氨酸顯著降低了100、300 μg·mL-1丙稀晴染毒大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH的活性。本試驗(yàn)中，6 mmol·L-1精氨酸組的LDH含量顯著低于熱應(yīng)激組，細(xì)胞損傷減少。無(wú)論是誘導(dǎo)損傷還是染毒損傷，添加精氨酸可以減少細(xì)胞損傷，其添加濃度和損傷程度、作用的靶器官以及物種等的不同均有關(guān)系。這表明不同的動(dòng)物品種、生長(zhǎng)階段、損傷誘因等的精氨酸添加量是不同的，需要在明確其作用機(jī)制的前提下，探索精氨酸在生產(chǎn)實(shí)踐中的合理應(yīng)用。

凋亡指機(jī)體細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中或在一定條件下，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)外因素調(diào)控下而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡，其特征在于特定的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化，在早期屬于可逆過(guò)程[19,36]。研究發(fā)現(xiàn)，添加精氨酸可以減少鼠肝缺血再灌注損傷出現(xiàn)的染色質(zhì)濃縮的凋亡細(xì)胞[37]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，精氨酸組染色質(zhì)濃縮細(xì)胞數(shù)要低于熱應(yīng)激組(圖2)，減少了凋亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡主要包括兩種途徑：外源性(死亡受體介導(dǎo))和內(nèi)源性(線粒體介導(dǎo))凋亡傳導(dǎo)通路[38]。霍愛(ài)華等[39]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可導(dǎo)致線粒體凋亡通路的激活。Bcl-2家族的Bax以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族的Caspase-9、Caspase-3在線粒體介導(dǎo)的凋亡通路中起著關(guān)鍵的起始調(diào)控和執(zhí)行作用。黃琳[40]研究表明，精氨酸降低了飼喂氧化魚(yú)油仔豬腸道Caspase-3的活性，緩解了仔豬腸道的氧化損傷。王萬(wàn)鐵等[41]研究報(bào)道，精氨酸降低了兔肺缺血-再灌注損傷的肺細(xì)胞Bax基因表達(dá)，提高了Bcl-2基因的表達(dá)，有效地減輕了缺血再灌注損傷。而在晏利瓊等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸對(duì)熱應(yīng)激肉雞空腸Caspase-3及Bcl-2 mRNA的表達(dá)量均無(wú)影響。這可能與精氨酸添加量、動(dòng)物個(gè)體差異以及試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，小腸上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)熱應(yīng)激處理后，促凋亡因子Bax、Caspase-3、Caspase-9的相對(duì)表達(dá)水平和蛋白的含量顯著升高。雖然熱應(yīng)激組Bcl-2基因表達(dá)量升高，但Bcl-2蛋白含量是降低，蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，且Bax/Bcl-2的基因比值是顯著升高的，說(shuō)明熱應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡增多[43-44]。通過(guò)添加精氨酸進(jìn)行修復(fù)處理，促凋亡因子Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著降低，抗凋亡因子Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著升高。這表明精氨酸可能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)Bax和Bcl-2的表達(dá)，抑制了線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)Caspase-3酶解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減少了細(xì)胞的凋亡。可見(jiàn)，精氨酸緩解了熱應(yīng)激對(duì)奶牛小腸上皮細(xì)胞的凋亡損傷，這為精氨酸應(yīng)用于預(yù)防或緩解奶牛熱應(yīng)激提供了體外試驗(yàn)理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究表明，精氨酸對(duì)體外培養(yǎng)的熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細(xì)胞的活力具有低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的作用效果。其中，添加6 mmol·L-1精氨酸的細(xì)胞活力最高，顯著改善細(xì)胞在G1期的阻滯；同時(shí)，6 mmol·L-1精氨酸可調(diào)控?zé)釕?yīng)激奶牛小腸上皮細(xì)胞與細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的mRNA和蛋白水平的表達(dá)，顯著降低熱應(yīng)激導(dǎo)致的小腸上皮細(xì)胞凋亡損傷。