劉芳君，藍(lán)吳濤，馬悅悅，李鵬飛，張 磊，朱芷葳*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801； 2.忻州師范學(xué)院，忻州 034000)

miRNA是一種內(nèi)源性的、大約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可以與其靶標(biāo)的3′非翻譯區(qū)上的位點(diǎn)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)翻譯抑制[1-2]。自從1993年首次發(fā)現(xiàn)miRNA以來(lái)，人們一直在積極研究miRNA在病理和生理?xiàng)l件下的關(guān)鍵作用[3]。最新證據(jù)表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和臨床治療中發(fā)揮著重要作用。大約50%的miRNA位于腫瘤相關(guān)的脆弱部位或基因組區(qū)域，這表明它們?cè)诎┌Y中具有潛在的關(guān)鍵作用[4]。miRNA直接或間接的與癌基因和抑癌基因相互作用并調(diào)節(jié)其表達(dá)，表明miRNAs可以作為一種新的腫瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。在一系列生物學(xué)過(guò)程中，miR-148a家族同許多miRNA家族一樣具有共同的功能，包括細(xì)胞發(fā)育和分化[5]。目前，miR-148a的研究主要集中在病理生理?xiàng)l件下，如膽管癌、食道癌、卵巢癌和結(jié)腸癌[6-9]。miR-148a調(diào)控胃癌發(fā)生發(fā)展的作用及其在胃癌細(xì)胞中的具體機(jī)制已經(jīng)確定[10-11]。miR-148a也能調(diào)節(jié)黑色素瘤的形成和進(jìn)展[12]。因此miR-148a在腫瘤領(lǐng)域的研究是十分有前景的。miR-148a-3p是miR-148家族的一員，已有研究結(jié)果顯示，其在多種腫瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)失調(diào)。在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中miR-148a-3p表達(dá)較低，而過(guò)表達(dá)miR-148a-3p可以通過(guò)抑制PIK3CA繼而抑制MG-63和U2OS細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并降低骨肉瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的致瘤性[13]。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-148a-3p在上皮性卵巢癌中表達(dá)降低，而過(guò)表達(dá)miR-148a-3p可抑制上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞的侵襲和增殖能力。

本研究通過(guò)分析miR-148a-3p在不同組織中的表達(dá)水平，預(yù)測(cè)miR-148a-3p靶基因的功能和參與的通路，并構(gòu)建基因互作網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步闡明miR-148a在癌癥中的功能提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)小鼠為6周齡C57BL/6 J小鼠，體重(24±2)g，按照山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)倫理委員會(huì)的要求，對(duì)小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)。采用脊椎脫臼法處死小鼠后，分別收集3只小鼠的胃、肺、脾、皮膚、肝、心和腎7個(gè)組織，置于液氮研磨，每組3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑

TRIzol購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；miRcute miRNA First-Strand cDNA合成試劑盒購(gòu)自天根科技(北京)有限公司；TB Green Advantage qPCR PreMix購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.3 小鼠組織總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

將不同組織置于研缽中，加入液氮研磨。使用TRIzol法提取組織總RNA，Nanodrop2000C檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和純度。

根據(jù)miRcute miRNA First-Strand cDNA合成試劑盒步驟進(jìn)行總miRNA的反轉(zhuǎn)錄。第一步，將1 μg RNA、0.2 μL大腸桿菌聚(A)聚合酶(5 U·μL-1)、 1 μL 10×聚合酶緩沖液和2 μL 5×rATP液加入離心管中，加ddH2O補(bǔ)足至10 μL后37 ℃孵育60 min。第二步，將2 μL第一步的溶液、2 μL 10×引物、2 μL 10×RT緩沖液、1 μL dNTPs、1 μL RNasin(40 U·μL-1)和0.5 μL Quant Rtase混合，加入11.5 μL的無(wú)核糖核酸酶的ddH2O于37 ℃下孵育60 min。

1.4 小鼠不同組織中miR-148a-3p表達(dá)的檢測(cè)

為了確定miR-148a-3p在小鼠胃、肺、脾、皮膚、肝、心和腎組織中的表達(dá)情況，用miR-148a-3p的通用引物和序列特異性正向引物5′-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3′進(jìn)行qRT-PCR。U6正、反向引物序列分別為5′-TTGTGGAAAGGACGAAACAC-3′和5′-GGCCATGCTAATCTTCTG-3′。反應(yīng)體系包括1 μL cDNA、0.4 μL反向引物和0.4 μL序列特異性正向引物，5 μL TB Green Advantage qPCR PreMix和3.2 μL的ddH2O，按照TaKaRa熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置條件。

1.5 miR-148a-3p轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)的預(yù)測(cè)

在Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索miR-148a-3p的前體，確定其上游約10 kb的片段。利用Promoter Scan和TRANSFAC數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-148a-3p的TFBS進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.6 miR-148a-3p的保守性和靶基因預(yù)測(cè)

在miBase中檢索并分析不同物種的miR-148a-3p序列，包括獼猴、大猩猩、人、牛、黑猩猩、褐家鼠、小鼠、山羊和家犬。為了保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確，本研究利用TargetScan、miRanda 和PicTar 3個(gè)軟件對(duì)miR-148a-3p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。3個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集作為最后的結(jié)果。

1.7 miR-148a-3p 靶基因的GO和KEGG富集分析

為了分析miR-148a-3p靶基因的作用，利用DAVID 在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)mRNA進(jìn)行GO和KEGG分析。對(duì)靶基因參與的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能和信號(hào)通路進(jìn)行富集分類。P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.8 TF-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape3.2.0軟件，根據(jù)預(yù)測(cè)的靶向結(jié)合關(guān)系，將轉(zhuǎn)錄因子、靶基因和miR-148a-3p的結(jié)合作用繪制成功能關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.9 數(shù)據(jù)分析

熒光定量數(shù)據(jù)采用2-△△CT法計(jì)算基因的表達(dá)情況。利用Graphpad Prism進(jìn)行差異性統(tǒng)計(jì)分析。其中認(rèn)為P<0.05表現(xiàn)為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠不同組織中miR-148a-3p的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果表明，miR-148a-3p在腎、心、肝、皮膚、脾、胃、肺等組織中均有表達(dá)。miR-148a-3p的豐度與U6 snRNA的豐度進(jìn)行了歸一化。其中，miR-148a-3p在脾中的表達(dá)水平最高(P<0.001)，肝次之(P<0.001)，在皮膚、胃、心、腎、肺中的表達(dá)水平逐漸降低(圖1)。

2.2 miR-148a-3的TFBS預(yù)測(cè)

通過(guò)Promoter Scan Version和TRANSFAC兩個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-148a-3p前體上游的TFBS進(jìn)行預(yù)測(cè)，在啟動(dòng)子區(qū)域檢測(cè)到多個(gè)基因可以作用于miR-148a-3p前體，例如DNA聚合酶β結(jié)合蛋白(BATA-pol)、CAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、E1A調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子(E4F1)核因子S(NF-S)、激活增強(qiáng)子結(jié)合蛋白2α(AP-2)和轉(zhuǎn)錄因子IID(TFIID)等。

2.3 miR-148a-3p的保守性分析

通過(guò)比較獼猴、大猩猩、人、牛、泛穴居人、褐家鼠、小鼠、山羊、家犬共9個(gè)物種的miR-148a-3p成熟體序列，發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p高度保守(表1)，成熟miRNAs具有相似的序列和相同的種子區(qū)(CAGUGCA)。

2.4 miR-148a-3p靶基因預(yù)測(cè)

將TargetScan、PicTar和miRanda預(yù)測(cè)出的miR-148a-3p的靶基因取交集，共得到25個(gè)交集靶基因(圖2)。再結(jié)合miRwalk數(shù)據(jù)庫(kù)中已證實(shí)的23個(gè)基因和已證實(shí)發(fā)表的15個(gè)基因，共得到63個(gè)miR-148a-3p的靶基因，用于GO富集和KEGG通路富集分析(表2)。

2.5 miR-148a-3p靶基因的GO富集分析

GO富集分析表明，miR-148a-3p的靶基因集中在離子轉(zhuǎn)運(yùn)、膜電位調(diào)節(jié)、心發(fā)育、細(xì)胞對(duì)膽固醇的應(yīng)答和對(duì)有機(jī)物的應(yīng)答等多種生物學(xué)過(guò)程中。主要的分子功能是乙酰膽堿激活的陽(yáng)離子選擇通道活性、乙酰膽堿結(jié)合活性和乙酰膽堿受體活性，且這些靶基因主要在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜上發(fā)揮作用(圖3)。

***. P<0.001圖1 miR-148a-3p在不同組織中的表達(dá)情況Fig.1 The miR-148a-3p expression in different tissues

表1 miR-148a在不同物種中的序列

2.6 miR-148a-3p靶基因的KEGG通路富集分析

KEGG途徑富集分析提供了miR-148a-3p靶基因所參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。結(jié)果表明，miR-148a-3p靶基因主要富集在TGF-β、肥厚性心肌病和黏附連接等信號(hào)通路中(圖4)。

2.7 TF-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)

轉(zhuǎn)錄因子ATF、CREB、NF-S、bata-pol和E4F1與miR-148a-3p及其靶基因形成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。涉及70個(gè)點(diǎn)和70條邊，包含5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和63個(gè)mRNAs。從網(wǎng)絡(luò)圖中可以直觀地看出miR-148a-3p通過(guò)調(diào)控靶基因(FMRP、Nrp1、BRCA1、p27等)參與了肥厚性心肌病途徑、黏附連接通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工等許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(圖5)。

3 討 論

miRNA家族是基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、細(xì)胞遷移和血管生成的許多重要信號(hào)通路[15]。目前，有關(guān) miR-148a-3p的研究主要中在其抗增殖潛能[16-19]以及誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[20]、分化[21]、凋亡[22]等重大生命進(jìn)程方面。

A.3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的韋恩圖；B. 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)應(yīng)的基因數(shù)統(tǒng)計(jì)圖；C. 韋恩圖中3個(gè)部分：不相交的，兩兩相交的和三個(gè)相交的基因數(shù)量A.Venn diagram of 3 databases; B. The statistics of the number of genes corresponding to the 3 databases; C. Three parts in the Venn diagram: genes number of disjoint, pairwise intersecting and three intersecting圖2 預(yù)測(cè)的miR-148a-3p靶基因的三重維恩圖及直方圖Fig.2 Ternary Venn diagram and the histogram of miR-148a-3p predicted target genes

表2 miR-148a-3p靶基因的統(tǒng)計(jì)

Liu和Sun等[23]研究發(fā)現(xiàn)，miR-148a-3p可以通過(guò)破壞p300依賴的Nrf2通路激活來(lái)阻止成骨細(xì)胞分化和骨重塑。Wu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，miR-148a-3p可以上調(diào)AGO1的表達(dá)，繼而參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)途徑促進(jìn)卵巢癌進(jìn)展。大腸癌中腫瘤細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體I類(MHC-I)的低表達(dá)是腫瘤逃避T細(xì)胞識(shí)別的機(jī)制之一，而抑制miR-148a-3p的表達(dá)可以恢復(fù)MHC-I的水平，并顯著增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫攻擊作用[25]。這些研究都證明了miR-148a-3p與mRNA互作網(wǎng)絡(luò)在腫瘤中可以參與不同的信號(hào)通路，發(fā)揮不同的生理作用。本試驗(yàn)分析還發(fā)現(xiàn)，miR-148a-3p可以參與蛋白呈遞、黏附連接通路和蛋白泛素化等通路，這些都是維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)的基礎(chǔ)通路。

此外，已有研究表明 miR-148a-3p在人體各種組織中表達(dá)，如心、肝、胎盤和睪丸，在正常生理?xiàng)l件下miR-148a-3p在造血系統(tǒng)中也有表達(dá)[26-27]，這與本研究結(jié)果相似。本試驗(yàn)qRT-PCR結(jié)果表明，miR-148a-3p在小鼠的肝、心、皮膚、腎、胃、脾、肺組織中均有表達(dá)，而在脾中的表達(dá)要明顯高于其他組織。眾所周知，脾是血循環(huán)中重要的過(guò)濾器，能清除血液中的異物、病菌以及衰老死亡的細(xì)胞[28]。脾中的免疫細(xì)胞可以產(chǎn)生免疫球蛋白、補(bǔ)體等免疫物質(zhì)，發(fā)揮免疫作用，有助于對(duì)抗某些引起肺炎和腦膜炎的細(xì)菌[29]。機(jī)體發(fā)生腫瘤的主要原因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)監(jiān)控失調(diào)，而脾作為人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，無(wú)疑與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[30]。因此，維持miR-148a-3p在脾中的穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)于維持機(jī)體免疫系統(tǒng)保持恒定水平具有重要意義。推測(cè)，miR-148a-3p可能是參與脾正常功能維持的重要調(diào)節(jié)因子，深入研究miR-148a-3p在脾中的作用對(duì)治療人類疾病具有重要意義。

圖3 miR-148a-3p靶基因GO分析Fig.3 GO enrichment analysis of miR-148a-3p predicted target genes

圖4 miR-148a-3p靶基因KEGG通路分析Fig.4 The KEGG pathway analysis of miR-148a-3p target genes

圖5 TF-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 TF-miRNA-mRNA interacting pathway network

轉(zhuǎn)錄因子、miR-148a-3p和靶基因的互作形成了一個(gè)全面的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，控制著機(jī)體正常的生命活動(dòng)，任何一環(huán)的失調(diào)都可能導(dǎo)致疾病，甚至癌癥的發(fā)生。其中P27是一種抑癌基因，為細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子[31-33]。研究表明，晚期胃癌患者miR-148a-3p的表達(dá)偏高，其下游靶基因P27嚴(yán)重失調(diào)，這可能是胃癌細(xì)胞惡化的一個(gè)重要因素[34]。miR-148a-3p還可以與Smad2的3′UTR結(jié)合并抑制其活性，激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β/SMAD2途徑，抑制細(xì)胞遷移、侵襲、生長(zhǎng)和存活[35]。PTEN作為抑癌基因，可通過(guò)去磷酸化參與細(xì)胞調(diào)控[36-40]。在黑色素瘤中，miR-148a-3p可以靶向抑癌基因PTEN，負(fù)向調(diào)控PTEN的表達(dá)，從而促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，并抑制其凋亡[41]。DNA損傷誘導(dǎo)蛋白GADD45A下調(diào)是膠質(zhì)瘤預(yù)后差的一個(gè)主要原因，miR-148a-3p可以通過(guò)下調(diào)GADD45A促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和腫瘤發(fā)生。本試驗(yàn)預(yù)測(cè)的互作網(wǎng)絡(luò)中涉及5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和63個(gè)mRNAs，這些mRNA參與了細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等一系列進(jìn)程，部分互作已被證實(shí)，但還有許多預(yù)測(cè)結(jié)合的mRNA未被試驗(yàn)證實(shí)。

4 結(jié) 論

本研究顯示，miR-148a-3p在小鼠脾組織中高表達(dá)且受E4F1、ATF、NF-S等多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，并調(diào)控Smad2、GADD45A、P27、PTEN等靶基因。這些靶基因通過(guò)多種生物學(xué)途徑影響細(xì)胞的增殖、分化和代謝，調(diào)節(jié)和維持生物體的相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。推測(cè)miR-148a-3p在維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)的基礎(chǔ)通路和癌癥的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。