牛曉艷，曹 亮，明世清，李燕平，詹海杰，姜志廣，衛(wèi)順生，張?jiān)獞c*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801； 2. 山西省畜禽繁育工作站，太原 030001；3. 廣靈縣優(yōu)種驢場(chǎng)，廣靈 037500； 4. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

驢是一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其馴化史可追溯到距今6 000～6 500年前的古埃及[1-2]。目前廣泛認(rèn)為，家驢起源于非洲[3-4]，但其確切的馴化地仍未知。我國(guó)有4 000年的驢馴養(yǎng)史[5-6]，驢存欄量占世界家驢數(shù)量的5.89%[7]，并形成了24個(gè)適應(yīng)不同氣候環(huán)境、地形地貌的地方品種[5]。廣靈驢是我國(guó)優(yōu)良的地方品種，具有體型高大、耐粗飼、抗病抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，是改良中小型驢種的重要品種之一，也是生產(chǎn)驢肉、驢皮的優(yōu)良品種。廣靈驢主要分布在山西省廣靈、靈邱兩縣及其周?chē)骺h的邊緣地區(qū)[8]，以廣靈縣南村鎮(zhèn)、壺泉鎮(zhèn)、加斗鄉(xiāng)分布最多，質(zhì)量最好，其品種形成具有200多年的歷史[9]。之后，隨著驢役用性能逐漸退出歷史舞臺(tái)，廣靈驢的存欄量逐年下降。據(jù)《中國(guó)畜禽遺傳資源志—馬驢駝志》報(bào)道，2006年末廣靈驢共存欄4 808頭，其中母驢1 700頭，種用公驢220頭[10]。2020年報(bào)道廣靈驢存欄量為3 000頭左右[11]，種群數(shù)目萎縮，保種形式嚴(yán)峻。

保種工作的總目標(biāo)是保持種群的遺傳多樣性，其核心內(nèi)容是“原封不動(dòng)的保存全部基因”，其指導(dǎo)思想是控制群體近交系數(shù)的上升速率，避免基因由于遺傳漂變而丟失[12-13]。而保種的基礎(chǔ)工作是種群具有完整、準(zhǔn)確、清楚的系譜記錄。廣靈驢的保種群體主要飼養(yǎng)于廣靈縣優(yōu)種驢場(chǎng)，該場(chǎng)建成于1960年，為國(guó)家級(jí)保種場(chǎng)，飼養(yǎng)種驢150余頭。但由于保種場(chǎng)地處偏僻，加之建場(chǎng)年代久遠(yuǎn)，飼養(yǎng)員更換頻繁，存在種驢系譜錯(cuò)記、漏記、缺失等情況，給種群的擴(kuò)繁、選配方案的制訂帶來(lái)了一定困難，也為今后的品系培育帶來(lái)了不利影響。因此，利用分子標(biāo)記對(duì)系譜的校正和完善以及群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析具有一定意義。

目前，用于親緣關(guān)系分析、評(píng)估群體遺傳多樣性水平、遺傳圖譜構(gòu)建的分子標(biāo)記主要為微衛(wèi)星標(biāo)記和SNP標(biāo)記。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)在動(dòng)物遺傳資源管理和可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略計(jì)劃中，將微衛(wèi)星標(biāo)記作為優(yōu)先推薦的分析工具，并制訂了家畜品種之間遺傳距離測(cè)定的全球方案[14]。采用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行的親緣關(guān)系鑒定準(zhǔn)確率可達(dá)99%以上，且具有多態(tài)性豐富、高保守性、結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在畜禽遺傳資源多樣性評(píng)估、親緣關(guān)系鑒定、品種起源進(jìn)化方面發(fā)揮了重要作用[14]。

本研究以廣靈縣優(yōu)種驢場(chǎng)保種群為研究群體，采用FAO和國(guó)際動(dòng)物遺傳協(xié)會(huì)(ISAG)共同推薦的馬屬動(dòng)物遺傳多態(tài)性標(biāo)記中的13個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，進(jìn)行保種群的親緣關(guān)系鑒定和分子系譜構(gòu)建，并進(jìn)一步對(duì)群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(NJ樹(shù))構(gòu)建。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選取及采樣 選取山西省廣靈縣優(yōu)種驢場(chǎng)種公驢13頭，種母驢94頭，采集頸靜脈血10 mL，采用EDTA法抗凝，充分混勻后立即放入4 ℃保溫箱內(nèi)冷藏，在24 h內(nèi)離心并分離白細(xì)胞層，置于-80 ℃下保存。

1.1.2 微衛(wèi)星引物 用于親緣關(guān)系分析的微衛(wèi)星引物序列參考自王敏等[15]鑒定德州驢親緣關(guān)系時(shí)所用的13個(gè)標(biāo)記引物序列，經(jīng)預(yù)擴(kuò)增后選擇12個(gè)標(biāo)記進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。微衛(wèi)星熒光引物(表1)由上海生工生物工程公司合成。

1.1.3 試劑與耗材 動(dòng)物血液DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，PCR反應(yīng)用Mix購(gòu)自北京全式金公司，瓊脂糖凝膠購(gòu)自BBI公司，其余耗材購(gòu)自Axygen公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 PCR儀(BioRad公司，美國(guó))，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))，凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech，美國(guó))，移液槍(Eppendorf公司，美國(guó))，電泳儀(北京六一儀器廠)。

表1 12對(duì)微衛(wèi)星引物的堿基序列及PCR反應(yīng)條件

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和純化 DNA提取按照OMEGA Blood DNA Mini Kit(D3392)步驟進(jìn)行。DNA純化按照OMEGA MicroElute?DNA Clean Up Kit(D6296)步驟進(jìn)行。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為20.0 μL：模板DNA(濃度為50 ng左右)2.0 μL，上游引物1.0 μL， 下游引物1.0 μL，PCR Mix 10.0 μL，ddH2O 6.0 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50～ 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40循環(huán)；72 ℃終末延伸10 min，產(chǎn)物保存在4 ℃。

1.2.3 微衛(wèi)星產(chǎn)物的分型 微衛(wèi)星擴(kuò)增體系為每孔內(nèi)加入分子量?jī)?nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液(0.5∶8.5)9.0 μL，與PCR產(chǎn)物1.0 μL混合后95 ℃變性3 min， ABI3730毛細(xì)管電泳檢測(cè)。將檢測(cè)得到的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入到分析軟件GeneMapper 3.2中分析試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

1.2.4.1 微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳參數(shù)的計(jì)算：12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因數(shù)(N)、觀測(cè)雜合度(HO)、期望雜合度(HE)、多態(tài)信息含量(PIC)等參數(shù)和標(biāo)記的哈代溫伯格平衡情況采用Cervus2.0 軟件計(jì)算。

1.2.4.2 親緣關(guān)系分析及系譜構(gòu)建：采用Cervus2.0軟件中的Parentage Analysis模塊分別對(duì)每頭子代的最似父親和最似母親進(jìn)行分析，并與保種場(chǎng)提供的原始系譜記錄進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算系譜錯(cuò)誤率。采用Pedigraph軟件對(duì)保種場(chǎng)各家系進(jìn)行分子系譜的構(gòu)建。

1.2.4.3 遺傳距離及聚類(lèi)分析：采用STRUCTURE軟件(版本：2.3)和R語(yǔ)言中hclust函數(shù)對(duì)各公驢家系進(jìn)行Nei’s遺傳距離(DA和DS)的計(jì)算，聚類(lèi)分析以及NJ樹(shù)的構(gòu)建，結(jié)合紙質(zhì)系譜，判斷家系數(shù)目和親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。

1.2.4.4 群體F統(tǒng)計(jì)量的計(jì)算：采用Fstat軟件計(jì)算不同公驢家系內(nèi)和家系間遺傳變異(FIS、FIT和FST)和近交情況。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性

對(duì)廣靈縣優(yōu)種驢場(chǎng)107頭種驢(公驢13頭，母驢94頭)在12個(gè)微衛(wèi)星座位上的多態(tài)性進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)出12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中等位基因數(shù)最多的為11個(gè)，最少為2個(gè)。

2.2 各微衛(wèi)星標(biāo)記的群體遺傳學(xué)參數(shù)

利用微衛(wèi)星標(biāo)記圖形分析軟件Genemapper 3.2對(duì)每個(gè)采樣個(gè)體的熒光PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因型判讀，并通過(guò)軟件導(dǎo)出測(cè)序峰圖后進(jìn)行各等位基因片段的統(tǒng)計(jì)，并統(tǒng)計(jì)出標(biāo)記的等位基因數(shù)(N)、觀測(cè)雜合度(HO)、期望雜合度(HE)和多態(tài)信息含量(PIC)，對(duì)每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行哈代-溫伯格平衡(H-W)檢測(cè)(表2)。

根據(jù)表2，上述12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因數(shù)在2～11個(gè)之間，多態(tài)信息含量(PIC)從大到小依次為：HTG7(0.780 3)、TKY297(0.770 4)、ASB23(0.739 1)、HMS18(0.733 6)、AHT4(0.715 2)、HMS2(0.664 4)、HMS3(0.540 7)、TKY343(0.537 7)、TKY312(0.520 2)、TKY337(0.472 7)、HMS6(0.363 6)、HMS7(0.289 4)。除HMS7外，標(biāo)記雜合度較高，適于做親緣關(guān)系鑒定。對(duì)不同微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行哈代-溫伯格平衡檢測(cè)結(jié)果可知，10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記均處于平衡狀態(tài)，說(shuō)明群體處于隨機(jī)交配狀態(tài)，基本未經(jīng)過(guò)選育。

表2 廣靈驢群體在12個(gè)微衛(wèi)星座位上的群體遺傳學(xué)參數(shù)

2.3 群體中個(gè)體的親緣關(guān)系分析

采用Cervus2.0軟件中的Simulation模塊模擬10 000個(gè)后代在寬松閾值條件(0.90)下和嚴(yán)格閾值(0.99)條件下的閾值(LOD值)分別為2.81和6.65。然后采用該軟件中的Parentage Analysis模塊分別對(duì)每頭子代的最似父親和最似母親進(jìn)行分析，算法采用最大似然法。

由表3可知，在107頭參與親子關(guān)系鑒定的個(gè)體中，最終通過(guò)微衛(wèi)星標(biāo)記分析確定父子關(guān)系的子代個(gè)體為30頭，確定母子關(guān)系的子代個(gè)體為7頭，準(zhǔn)確度均達(dá)到90%(表3)。進(jìn)一步將確認(rèn)親子關(guān)系個(gè)體進(jìn)行紙質(zhì)系譜的比對(duì)，在30個(gè)個(gè)體中，原系譜記錄中親本缺失個(gè)體為17個(gè)，占57%；原系譜記錄錯(cuò)誤的個(gè)體為7個(gè)，占23%。說(shuō)明原始系譜記錄存在較多缺失和錯(cuò)記情況。

表3 通過(guò)Cervus2.0軟件確認(rèn)子代的父母

2.4 分子系譜構(gòu)建

采用Pedigraph2.4軟件繪制已經(jīng)確定親緣關(guān)系個(gè)體的系譜圖，共檢測(cè)到7個(gè)公驢家系，分別為：201109010013、201109010009、201204040019、201307050021、201301060031、201504070035、201506040043，確定了30頭子代的父親和7頭子代的母親(表3)，占采樣總數(shù)的40%左右。由圖1可知，201307050021是最大的一個(gè)公驢家系，包括1頭雄性子代和9頭雌性子代。而201301060031以及201504070035是最小的公驢家系，均檢測(cè)出1個(gè)后代。

圖中數(shù)字為確定親緣關(guān)系的親本及子代的電子耳號(hào)。菱形表示親本，橢圓表示子代雌性個(gè)體，長(zhǎng)方形表示子代雄性個(gè)體Numbers in the figure are electronic labels of parents and offspring with confirmed relationships. The diamonds represent the parents, the ellipses represent the female offspring, and the rectangles represent the male offspring圖1 廣靈驢群體的分子系譜Fig.1 Molecular pedigree of Guangling donkey population

2.5 各家系的Nei’s遺傳距離計(jì)算和系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹(shù)(NJ樹(shù))構(gòu)建

采用STRUCTURE軟件(版本2.3)計(jì)算各家系間的Nei’s遺傳距離，設(shè)定參數(shù)值K=7。采用R語(yǔ)言中的hclust函數(shù)構(gòu)建廣靈驢7個(gè)家系的系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹(shù)(NJ樹(shù))。結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知， 使用R語(yǔ)言hclust函數(shù)繪制7頭公驢及其后代的NJ樹(shù)，發(fā)現(xiàn)它們聚為兩大分支。其中1號(hào)(201109010013)、9號(hào)(201307050021)、21號(hào)(201109010009)、27號(hào)(201506040043)、31號(hào)(201204040019)、34號(hào)(201301060031)、36號(hào)(201504070035)為親本公驢，其余編號(hào)個(gè)體為子代。

2.6 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

采用Fstat軟件可通過(guò)共顯性遺傳標(biāo)記來(lái)估計(jì)和檢驗(yàn)基因多樣性和基因分化情況，表4是所有微衛(wèi)星基因座群體遺傳結(jié)構(gòu)參數(shù)的計(jì)算結(jié)果。其中，F(xiàn)IS表示個(gè)體(I)相對(duì)于亞群(S)的近交系數(shù)，即亞群的平均近交系數(shù)；FST表示亞群(S)相對(duì)于總?cè)后w(T)的近交系數(shù)，即有親緣關(guān)系亞群間的平均近交系數(shù);FIT值代表各亞群間近交系數(shù)的平均值，反映了保種群全群的近交程度[16]。

由表4可知，所采用標(biāo)記的平均觀測(cè)雜合度為0.648，說(shuō)明標(biāo)記具有較高多態(tài)性，具有較好的保種潛力。群體分化指數(shù)FST和群體近交系數(shù)FIS在群體遺傳學(xué)中均稱(chēng)為F-Statistics，其含義是衡量種群中基因型實(shí)際頻率是否偏離哈-溫平衡理論比例的指標(biāo)。F-Statistics也可以被認(rèn)為是在分層群體中不同亞群間基因相關(guān)性的度量。由于FST的取值在0 ～ 1之間，數(shù)值越大，說(shuō)明等位基因在各自亞群中越固定，群體分化程度越大[16]。上述群體FST平均值為0.184，說(shuō)明各亞群之間存在較大的遺傳分化，具有不同的來(lái)源。

圖中編號(hào)代表進(jìn)行NJ樹(shù)構(gòu)建的7個(gè)公驢家系公驢及其后代的順序號(hào)；縱坐標(biāo)為相對(duì)遺傳距離The numbers in the figure are sequential numbers of 7 male donkey families and their offspring for NJ tree construction; Y-axis is the relative genetic distance圖2 采用R語(yǔ)言構(gòu)建的子代及其父親(n=37)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 NJ tree for offspring and their fathers using R software(n=37)

FIT由標(biāo)記計(jì)算結(jié)果為0.033，采用所有個(gè)體系譜計(jì)算結(jié)果為0.02，兩者計(jì)算的近交系數(shù)接近。當(dāng)FIT值大于0.375時(shí)，說(shuō)明群體為近交系[17]。上述計(jì)算結(jié)果說(shuō)明群體基本處于隨機(jī)交配狀態(tài)，群體內(nèi)存在很弱的近交。

由上述結(jié)果可知，大多數(shù)FIS為負(fù)值，平均值為-0.238。上述計(jì)算結(jié)果與FIT值評(píng)估結(jié)果較為一致，說(shuō)明群體內(nèi)個(gè)體間存在很弱的近交。

表4 微衛(wèi)星基因座群體遺傳參數(shù)

3 討 論

3.1 廣靈驢群體的遺傳多樣性

遺傳多樣性是生命進(jìn)化和物種分化的基礎(chǔ)，在一定程度上決定了物種在自然或人為條件下對(duì)環(huán)境改變的適應(yīng)能力[17]。本研究中所用的微衛(wèi)星標(biāo)記平均等位基因數(shù)(N)為6.25，平均觀測(cè)雜合度(HO)為0.676 5，平均多態(tài)含量(PIC)為0.593 9。其中，雜合度和PIC值反映了種群的遺傳多樣性程度，當(dāng)雜合度>0.5，則意味著該群體未受到高強(qiáng)度的選擇，具有較為豐富的遺傳多樣性；PIC值則代表了標(biāo)記位點(diǎn)變異程度的大小，PIC>0.5為高度多態(tài)性位點(diǎn)，可提供足夠的信息量。上述12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的PIC值除HMS7外均具有高多態(tài)含量，可用于親緣關(guān)系鑒定和遺傳多樣性評(píng)估。根據(jù)紀(jì)志賓等[18]在采用微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建嶗山奶山羊分子系譜中的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)標(biāo)記的平均PIC值在0.604～0.687時(shí)，需要11個(gè)和7個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記才能夠滿足系譜構(gòu)建的可靠性在0.99以上。本研究標(biāo)記的平均PIC值在0.594左右，采用12個(gè)標(biāo)記，符合可靠性要求。

王敏等[15]采用13個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)估了53頭德州驢的群體多樣性和親緣關(guān)系，13個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因數(shù)(N)、觀測(cè)雜合度(HO)、多態(tài)信息含量(PIC)分別為6.850, 0.689和0.625, 與本研究結(jié)果相似。劉艷艷等[19]采用13個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)39頭三粉驢和16頭烏頭驢進(jìn)行了遺傳多樣性分析，其中烏頭驢群體平均觀測(cè)雜合度為0.27，三粉驢群體平均觀測(cè)雜合度為0.33，低于本研究。楊虎等[20]則采用8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)估了3個(gè)新疆地方驢品種的多態(tài)性，并對(duì)其進(jìn)行了聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)品種平均雜合度為0.784 1，PIC值為0.756 8，均處于較高水平。Jordana等[21]研究了美國(guó)驢的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，他們采用14個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)350頭來(lái)源于13個(gè)國(guó)家的美國(guó)驢群體進(jìn)行分析，最終將其劃分為南方和北方兩個(gè)群體。Zeng等[22]采用12個(gè)熒光標(biāo)記的微衛(wèi)星對(duì)504頭12個(gè)中國(guó)地方驢品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其標(biāo)記的雜合度為0.631 5～0.699 9，多態(tài)信息含量為0.660 0，與本研究的標(biāo)記觀測(cè)雜合度相似，但此研究分析的12個(gè)地方品種未包括廣靈驢。相比上述研究，可得出廣靈驢群體內(nèi)遺傳變異程度高，具有較好的保種和品種開(kāi)發(fā)潛力。

相比SNP標(biāo)記，微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)信息含量高，保守性好的特點(diǎn)，被廣泛使用在群體結(jié)構(gòu)多樣性分析中。但SNP標(biāo)記在家畜基因組上的分布更加廣泛、密集，且檢測(cè)方便，更適合現(xiàn)代高通量檢測(cè)平臺(tái)，也是群體遺傳多樣性分析的理想標(biāo)記。Dell等[23]采用15個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記研究了一個(gè)英國(guó)瀕危的馬品種—克利夫蘭灣馬(Cleveland Bay horse)的遺傳多樣性和系譜關(guān)系，在402匹馬中發(fā)現(xiàn)3個(gè)系祖，可以解釋70%的母系遺傳變異，群體近交系數(shù)為7.8%，標(biāo)記觀測(cè)雜合度為0.534 1。

目前，尚未有在驢中使用中高密度芯片進(jìn)行群體遺傳分析的報(bào)道。在馬中，已經(jīng)先后開(kāi)發(fā)出50K[24]、65K[25]和74K[26]芯片，最近又開(kāi)發(fā)出極高密度的670K[27-28]芯片，用于賽馬品種選育、種群分化和特定功能基因研究[29-30]。Nolte等[31]采用Illumina Equine50K芯片檢測(cè)了4個(gè)德國(guó)賽馬品種共942個(gè)個(gè)體的選擇信號(hào)，獲得了一系列影響賽馬肌肉功能(TPM1、TMOD2-3、MYO5A、MYO5C)，肌肉生長(zhǎng)和能量代謝(AEBP1、RALGAPA2、IGFBP1、IGFBP3-4)，胚胎發(fā)育和繁殖方面的基因。2013年，Petersen等[27]通過(guò)對(duì)33個(gè)品種的744匹馬采用50K SNP芯片檢測(cè)了其基因組的變異情況，發(fā)現(xiàn)MSTN受到強(qiáng)烈選擇，同時(shí)發(fā)現(xiàn)馬的體型大小與ECA11基因有關(guān)。Avila等[32]采用65K SNP芯片對(duì)夸特馬(Quarter horse)群體中經(jīng)歷強(qiáng)選擇的基因組區(qū)段和單倍型進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)與肌肉發(fā)育和代謝以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)的基因區(qū)段存在選擇印記。Gurgul等[33]采用Illumina芯片對(duì)波蘭6個(gè)馬品種共571個(gè)個(gè)體進(jìn)行選擇信號(hào)分析，發(fā)現(xiàn)了一系列與肌肉力量、心臟功能、疾病抗性、繁殖性能和協(xié)調(diào)性有關(guān)的基因。因此，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)家驢中高密度的基因芯片將對(duì)驢的起源進(jìn)化研究和特定品種功能基因挖掘起到極大的推動(dòng)作用。另外，也可利用基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行群體分化差異和位點(diǎn)的連鎖不平衡檢測(cè)，進(jìn)而尋找候選基因。

3.2 群體親緣關(guān)系

在親緣關(guān)系鑒定中，累計(jì)非父排除概率(CEP)可作為標(biāo)記是否可靠的衡量標(biāo)準(zhǔn)[34]。本研究所采用標(biāo)記的CEP平均值在97%以上，所鑒定獲得的親子關(guān)系可靠性約為95%，結(jié)合原始系譜，基本可以獲得準(zhǔn)確的親子關(guān)系。

從分子系譜分析結(jié)果可知，各公驢家系的后代數(shù)從1到10頭，存在較大的變異。從長(zhǎng)期保種的角度來(lái)看，各家系留種后代不一致會(huì)導(dǎo)致有效群體數(shù)量降低，遺傳漂變等不利情況，所以應(yīng)盡量采用各家系等量留種的方式。圖1和表3中，確定母子關(guān)系的親子對(duì)只有7對(duì)，這可能是由于場(chǎng)內(nèi)母驢轉(zhuǎn)出或售賣(mài)的情況較多，周轉(zhuǎn)較快，導(dǎo)致子代的真實(shí)母親不在采樣群體中。此次分子系譜構(gòu)建僅獲得了30個(gè)父子對(duì)和7個(gè)母子對(duì)的可靠親子關(guān)系，占到總采樣群體的約40%，說(shuō)明還有近一半個(gè)體未找到其親本。原紙質(zhì)系譜中包含了16頭公驢，而本次檢測(cè)僅檢測(cè)到7個(gè)公驢家系，說(shuō)明尚有一些公驢被淘汰或出售。

固定指數(shù)FIS通常代表了群體內(nèi)個(gè)體間的近交系數(shù)[35]。當(dāng)群體內(nèi)HO小于HE，同時(shí)FIS為正值時(shí)，表明群體內(nèi)近交程度較嚴(yán)重; 而FIS為負(fù)值，群體內(nèi)HO大于HE，則表示群體內(nèi)存在遠(yuǎn)緣繁殖。本研究群體的HO(0.676 5)>HE(0.642 9)，且群體內(nèi)平均近交系數(shù)為-0.238，說(shuō)明群體基本不存在家系內(nèi)近交，為遠(yuǎn)緣繁殖。這也與標(biāo)記的哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)結(jié)果(表3)相一致，即群體處于隨機(jī)交配狀態(tài)。這一結(jié)果也與群體分化系數(shù)FST和群體平均近交系數(shù)FIT所得出的結(jié)果相吻合。

3.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)與分化情況

Wright建議，實(shí)際研究中FST為0～0.05，表明群體間遺傳分化很小，可以不考慮；FST為0.05～0.15，表明群體間存在中等程度的遺傳分化；FST為0.15～0.25，群體間遺傳分化較大；FST為0.25以上，表明群體間有很大的遺傳分化。本研究通過(guò)12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記所獲得的FST值為0.184，說(shuō)明各家系間具有較大的遺傳分化，可能具有不同來(lái)源[17]。通過(guò)查詢?cè)枷底V資料可知，圖1中的1號(hào)公驢購(gòu)自廣靈縣壺泉鎮(zhèn)，36號(hào)公驢購(gòu)自廣靈縣蕉山鄉(xiāng)，兩地相距8 km；21和34號(hào)公驢原始記錄丟失，不能判斷其來(lái)源；9號(hào)公驢則購(gòu)自龍虎巖村；21和37號(hào)公驢則都來(lái)自浮圖村，該地位于河北省蔚縣，距離廣靈縣26 km，蔚縣也是陽(yáng)原驢的產(chǎn)區(qū)，可能會(huì)出現(xiàn)品種混雜的情況，對(duì)其血統(tǒng)還需要進(jìn)行更進(jìn)一步的分析。

本研究采用基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，以期得到各家系間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離是根據(jù)基因頻率估算每個(gè)位點(diǎn)平均密碼子的差數(shù)，可用于推斷兩個(gè)家系的分化時(shí)間[36]。但此公式的基本假定是群體為恒定的大群體，每個(gè)基因每年的突變率恒定，且所有突變均為中性突變，不受選擇的影響[37]。在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的過(guò)程中，除采用鄰接法外(NJ法)，還可采用UPGMA法構(gòu)建無(wú)根樹(shù)，但此法假設(shè)各分支的進(jìn)化速率一致，在參考序列較短時(shí)，誤差較大，故采用NJ法，且得到了較為合理的結(jié)果。

一些學(xué)者對(duì)驢線粒體DNA D-loop區(qū)進(jìn)行測(cè)序，分析不同地方品種之間的親緣關(guān)系和家驢的起源進(jìn)化[38-39]。其中葛慶蘭等[40]證明，中國(guó)家驢的祖先為非洲野驢，這與王全喜等[41]的研究結(jié)果一致。Xia等[42]研究了南美地方驢品種的母系起源，采用D-loop區(qū)489 bp的序列分析了323頭來(lái)自南美4個(gè)國(guó)家的驢群體，結(jié)果證明4個(gè)群體聚為兩個(gè)大的分支，但它們之間的遺傳交流很少。?zkan ünal等[43]采用mtDNA D-loop區(qū)對(duì)16個(gè)土耳其地方驢品種的母系起源進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)這些品種聚為兩個(gè)分支，分別為索馬里分支和努比亞分支。Ma等[44]比較了世界范圍內(nèi)700余條不同驢品種的mt D-loop區(qū)序列，對(duì)兩個(gè)大分支的馴化史進(jìn)行了詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)撒哈拉以南地區(qū)的驢來(lái)源于分支I，而非洲以東和以北的驢來(lái)源于分支II。進(jìn)一步應(yīng)采用多種標(biāo)記對(duì)廣靈驢的起源和選擇進(jìn)化過(guò)程進(jìn)行研究。

4 結(jié) 論

本研究采用12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)廣靈縣優(yōu)種驢場(chǎng)保種群進(jìn)行了遺傳多樣性分析和分子系譜構(gòu)建，可靠性和準(zhǔn)確性較高。目前，該群體基本不存在嚴(yán)重近交的情況，具有較豐富的遺傳多態(tài)性，具有較好的保種潛力。