尤桂爽,易興友,蔣美山,李中偉,譚和林,曹 池,舒 剛,田堯夫,朱 慶,趙小玲*
(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,成都 611130; 2.重慶市開州區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心,重慶 405499)
四川盆地由中國(guó)西部橫斷山脈、云貴高原、大巴山、武夷山環(huán)繞形成,盆地北部大巴山橫直在萬(wàn)源宣漢北部,明月山、銅鑼山、華釜山由北而南縱臥其間,自然分割形成盆地和丘陵地貌。海拔跨度極大的地勢(shì)造就了豐富的生物多樣性,形成了包括國(guó)家畜禽遺傳資源舊院黑雞、城口山地雞、大寧河雞等在內(nèi)的家禽品種[1]。在大巴山脈與長(zhǎng)江山峽的交界處,有1個(gè)新的家禽品種巖水雞,其體態(tài)輕盈,羽色為純黑或純白,目前處于地方畜牧部門保護(hù)開發(fā)的計(jì)劃中。南部地區(qū)武夷山和云貴高原的交匯點(diǎn)也有顯著的海拔變化,分布著沐川烏骨雞、豐巖烏骨雞等家禽品種[2]。
城口山地雞地處重慶市城口縣,為肉蛋兼用型品種,羽色純黑,黑膚、烏肉,肉質(zhì)細(xì)嫩,深受當(dāng)?shù)厝嗣竦南矏?ài)。舊院黑雞主產(chǎn)于四川省萬(wàn)源市舊院鎮(zhèn),是肉蛋兼用型品種,外觀與城口山地雞近似,羽色純黑,黑膚、烏肉,肉質(zhì)鮮美[3]。大寧河雞產(chǎn)于重慶市巫溪縣,屬兼用型地方品種,公雞紅羽,母雞黃麻羽。巖水雞白羽和黑羽群體產(chǎn)于重慶開州區(qū),北鄰城口東鄰巫溪,是出名的高寒山區(qū),該品種環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng),肉蛋兼用[4]。豐巖烏骨雞羽毛、皮、骨、肉俱黑,產(chǎn)于四川瀘州敘永縣,已有300年以上歷史,長(zhǎng)期以來(lái)當(dāng)?shù)孛?、漢農(nóng)民就養(yǎng)殖烏骨雞饋贈(zèng)親友,配以中草藥滋補(bǔ)療疾。
近年來(lái)隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,交通的便利,出現(xiàn)了相鄰地域品種混雜,毛色不純,膚色變淺等問(wèn)題,根據(jù)農(nóng)業(yè)部的報(bào)告,一些地方雞種的種群數(shù)量一直在迅速減少甚至瀕臨滅絕[5]。第三次全國(guó)畜禽遺傳資源普查品種鑒定工作正在開展,為說(shuō)明四川及其臨近區(qū)域品種間遺傳多樣性,便于后續(xù)的品種保護(hù)和開發(fā)利用[6],本研究采用簡(jiǎn)化基因組開展了6個(gè)地方雞群體的遺傳研究。簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)(genotyping-by-sequencing,GBS)是在二代測(cè)序基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的[7],通過(guò)酶切加標(biāo)簽的方法測(cè)序獲得酶切位點(diǎn)附近基因序列信息,進(jìn)而檢測(cè)大量高準(zhǔn)確性的SNP變異位點(diǎn)信息,可了解種質(zhì)資源的遺傳背景和系統(tǒng)演化,研究群體親緣關(guān)系及種群結(jié)構(gòu)[8]。Pértille等[9]用GBS法對(duì)462只雞進(jìn)行測(cè)序,鑒定出67 096個(gè)SNPs,全基因組覆蓋率為4.66%。豬群測(cè)序檢測(cè)到假定的SNPs,平均密度為每10 kb有0.33個(gè)SNPs[10]。此外,在一項(xiàng)牛研究中還鑒定出63 797個(gè)SNPs[11]。GBS是一種經(jīng)濟(jì)高效的方法,已成功地應(yīng)用于群體遺傳學(xué)研究[12-14]。
本研究使用了來(lái)自5個(gè)保種場(chǎng)的6個(gè)地方品種雞,每個(gè)品種選取20個(gè)個(gè)體(10公、10母)共120只,150~250日齡,分別為城口山地雞、大寧河雞、舊院黑雞、豐巖烏骨雞、巖水雞黑羽和巖水雞白羽,采樣信息見(jiàn)表1。將樣本進(jìn)行翅下靜脈采血,并保存于-20 ℃。使用標(biāo)準(zhǔn)的苯酚/氯仿方法從全血中提取基因組DNA。用分光光度計(jì)(德國(guó)埃普多夫公司)定量DNA濃度,并將樣品稀釋至最終濃度100 ng·μL-1[15]。
表1 地方雞群體采樣信息
1.2.1 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序和SNP 鑒定 DNA樣品送往廣州基迪奧生物科技有限公司利用Gallusgallus基因組(GenBank登錄號(hào):GCF_000002315.6)作為參考基因組,用GBS技術(shù)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù),采用限制性內(nèi)切酶CTGCAG(PstⅠ) + CATG(NlaⅢ)對(duì)DNA進(jìn)行酶切,連接回收后對(duì)片段使用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,測(cè)定PCR產(chǎn)物濃度后將混好的文庫(kù)上機(jī)測(cè)序(Illumina HiSeqTM 2500)。
高通量測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識(shí)別轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列,過(guò)濾后使用比對(duì)軟件BWA(0.7.12)采用mem算法后將過(guò)濾后的reads比對(duì)到參考基因組上,比對(duì)參數(shù)為-k 32 -M;比對(duì)完之后結(jié)果使用PICARD(版本1.129)軟件進(jìn)行標(biāo)記[16]。使用變異檢測(cè)軟件GATK(版本3.4-46)進(jìn)行群體SNP檢測(cè),然后使用ANNOVAR(版本2)對(duì)檢測(cè)出的突變位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋。
1.2.2 遺傳數(shù)據(jù)分析 用Perl編程計(jì)算觀測(cè)雜合度(observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)、多態(tài)信息含量(polymorphic information content,PIC)、觀測(cè)等位基因數(shù)(number of observed alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(number of effective alleles,Ne)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity,Pi)、遺傳分化系數(shù)(F-statistic,F(xiàn)st)、遺傳距離(genetic distance,DR)及基因流(gene flow,Nm)。利用軟件GCTA(Version 1.25.0)進(jìn)行主成分分析(principle component analysis,PCA),采用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,通過(guò)Treebest軟件計(jì)算距離矩陣,系統(tǒng)發(fā)生樹的可靠性通過(guò)Boot-strap法進(jìn)行檢驗(yàn)。使用Admixture軟件(v1.3)[17]進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)的推斷,分別假設(shè)樣品的分群數(shù)(K值)為1~9, 然后進(jìn)行聚類,根據(jù)交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率來(lái)確定最優(yōu)分群數(shù)。
2.1.1 測(cè)序質(zhì)量 120個(gè)地方雞樣本,剔除2個(gè)核酸質(zhì)量低的樣本,通過(guò)GBS測(cè)序,剩余118個(gè)樣本測(cè)序質(zhì)量較高(Q20≥97.58%、所有樣品的平均測(cè)序深度為20×,平均覆蓋度為6.48%)。經(jīng)過(guò)篩選過(guò)濾后,118個(gè)樣品共獲得291 359個(gè)高質(zhì)量的SNPs位點(diǎn)。Q30≥92.74%,GC分布正常,群體樣本與參考基因組的平均比對(duì)率為99.33%。
2.1.2 突變篩選 去除等位基因數(shù)大于2、缺失數(shù)據(jù)大于50%、次要等位基因頻率小于5%、雜合度大于80%的標(biāo)記(SNPs/Indels),保留271 672個(gè)SNPs和19 687個(gè)Indels,用于群體遺傳分析。
6個(gè)群體的核酸多態(tài)性范圍為6.71×10-5(巖水雞黑羽)~8.58×10-5(大寧河雞);觀測(cè)雜合度范圍為0.133(巖水白羽雞)~0.168(城口山地雞);期望雜合度范圍為0.154(巖水黑羽雞) ~0.197(大寧河雞);多態(tài)信息含量范圍為0.125(巖水黑羽雞)~0.162(大寧河雞),屬低度多態(tài)性(PIC<0.25);觀測(cè)等位基因數(shù)范圍為1.534(巖水雞黑羽)~1.750(城口山地雞);有效等位基因數(shù)范圍為1.256(巖水雞黑羽)~1.318(大寧河雞)(表2)。整體上大寧河雞和城口山地雞的遺傳多樣性較高,巖水雞黑羽和巖水雞白羽的遺傳多樣性較低。
表2 6個(gè)雞群體遺傳多樣性參數(shù)
6個(gè)群體間兩兩遺傳分化系數(shù)(Fst)范圍為0.053~0.183,遺傳距離(DR)為0.087~0.119,基因流(Nm)為1.12~4.50。巖水雞黑羽與大寧河雞、舊院黑雞、豐巖烏骨雞,巖水雞白羽與豐巖烏骨雞的遺傳分化較大(0.15≤Fst≤0.25),其余品種之間的遺傳分化中等(0.05≤Fst≤0.15)。群體間遺傳分化最大的是豐巖烏骨雞和巖水雞黑羽群體(Fst=0.183),最小的是城口山地雞和大寧河雞(Fst=0.053)。群體間遺傳距離最近的是巖水雞黑羽和白羽群體(DR=0.087),遺傳距離最遠(yuǎn)的是大寧河雞和巖水雞白羽群體(DR=0.119)。群體間基因流動(dòng)最大的是大寧河雞和城口山地雞(Nm=4.05),流動(dòng)最小的是巖水雞黑羽和豐巖烏骨雞(Nm=1.12)(表3和表4)。
表3 6個(gè)群體間的遺傳分化系數(shù)(Fst)和遺傳距離(DR)
表4 6個(gè)群體的基因流
2.4.1 主成分分析 對(duì)獲得的SNPs標(biāo)記進(jìn)行主成分分析,結(jié)果表明3個(gè)主成分變異貢獻(xiàn)率分別為7.31%、4.31%和4.04%(圖1)。由圖1可以看出,城口山地雞、大寧河雞、舊院黑雞形成一個(gè)緊密的類群,豐巖烏骨雞、巖水雞白羽和黑羽相對(duì)獨(dú)立,并且豐巖烏骨雞和巖水雞黑羽群體相對(duì)集中,巖水雞白羽群體相對(duì)分散。
2.4.2 系統(tǒng)發(fā)生樹分析 根據(jù)地方雞6個(gè)群體的系統(tǒng)發(fā)生樹可以明顯看出(圖2),城口山地雞、大寧河雞、舊院黑雞和豐巖烏骨雞各自聚為一類,巖水雞白羽和黑羽聚為一類。
圖1 地方雞6個(gè)群體的主成分分析Fig.1 Principal components analysis of 6 local chicken populations
圖2 地方雞6個(gè)群體的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Phylogenetic tree of 6 local chicken populations
預(yù)設(shè)群體分群數(shù)從2到9,通過(guò)Admixture軟件分析地方雞的群體結(jié)構(gòu),根據(jù)交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率的谷值確定最優(yōu)分群數(shù)(K)。如圖3所示,當(dāng)K=5時(shí)交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率最低,說(shuō)明本研究分析的樣品最大概率來(lái)自于5個(gè)原始的祖先。圖4展示了6個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)。當(dāng)K=2和3時(shí),巖水雞黑羽和白羽明顯具有和其它品種不同的來(lái)源。在K=4時(shí),豐巖烏骨雞與巖水雞黑羽遺傳結(jié)構(gòu)差異大,而城口山地雞、大寧河雞、舊院黑雞遺傳結(jié)構(gòu)近似。在K=5時(shí),大寧河雞、舊院黑雞、豐巖烏骨雞和巖水雞黑羽遺傳差異明顯,城口山地雞和巖水雞白羽呈現(xiàn)出部分血液混雜,K=6~9呈現(xiàn)出更詳細(xì)的品種遺傳信息。
圖3 交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率Fig.3 Cross validation error rate
對(duì)品種內(nèi)多樣性和物種種群結(jié)構(gòu)的了解是改進(jìn)品種選擇計(jì)劃、了解群體環(huán)境適應(yīng)性和政府實(shí)施種群保護(hù)計(jì)劃的基礎(chǔ)[18-19]。雖然大多數(shù)群體遺傳結(jié)構(gòu)研究都針對(duì)世界性的商用品種,但人們對(duì)地方品種的遺傳學(xué)關(guān)系越來(lái)越感興趣,因?yàn)樗鼈兛梢詮母旧侠砬迤贩N的內(nèi)在關(guān)系[20]。
本試驗(yàn)利用簡(jiǎn)化基因組研究了四川盆地周邊山脈6個(gè)地方雞種的基因組多態(tài)性。期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)是衡量標(biāo)記多態(tài)性較好的指標(biāo)[21-22]。6個(gè)地方雞品種的He范圍為0.154~0.197,平均期望雜合度和Cendron等[23]用全基因組測(cè)序分析意大利地方品種雞的結(jié)果相似。6個(gè)地方雞品種的PIC范圍為0.125~ 0.162,為低度多態(tài)性(PIC<0.25低度多態(tài)性;0.25
圖4 6個(gè)地方雞品種的結(jié)構(gòu)聚類分析Fig.4 Structure clustering of 6 local chicken populations
為了解這6個(gè)地方品種之間的遺傳關(guān)系和群體結(jié)構(gòu),本研究計(jì)算了群體的遺傳分化指數(shù)(Fst)和遺傳距離(DR)的成對(duì)估計(jì),并進(jìn)行了主成分、系統(tǒng)發(fā)生樹和Structure分析。Fst揭示了種群間的遺傳分化程度,本試驗(yàn)中城口山地雞和大寧河雞間分化中等,舊院黑雞和豐巖烏骨雞間分化較大[29-30]。前人的研究表明,印度[31]、中國(guó)[32]和非洲本土雞群[33]的Fst值較高(0.15到0.26),而Rashid等[34]報(bào)告了孟加拉國(guó)5個(gè)地方雞種的Fst在0.084~0.154之間。Hassen等[35]報(bào)告了埃塞俄比亞西北部7個(gè)土生雞種群的地理距離從0.073到0.13。Seo等[36]發(fā)現(xiàn)5個(gè)韓國(guó)本土雞之間的成對(duì)遺傳距離為0.083~0.171。本研究結(jié)果與上述3個(gè)研究結(jié)果相似,遺傳距離值較小。此外,Yamamoto[37]的研究報(bào)告了孟加拉土雞不同群體之間的遺傳分化程度較低??傮w而言,四川盆地地方雞群體間的遺傳分化程度較低,這可能是由于它們之間以及構(gòu)建群體的共同祖先之間的基因流動(dòng)所致。本研究中Fst和基因流都顯示城口山地雞和大寧河雞群體間的分化程度最小,豐巖烏骨雞和巖水雞黑羽群體間的分化最大。系統(tǒng)發(fā)生樹顯示,巖水雞白羽和巖水雞黑羽聚為一類,與基因流結(jié)果一致。利用Structure程序?qū)χ袊?guó)地方6個(gè)雞群的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,當(dāng)K=5時(shí),交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率最低,說(shuō)明本研究分析的樣品應(yīng)該是來(lái)自于5個(gè)原始的祖先。結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)還表明,在每個(gè)群體中有一定比例的遺傳混合來(lái)自其他品種,鄰近地區(qū)或種群可能存在一定的基因流動(dòng)。同時(shí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表明,豐巖烏骨雞和舊院黑雞被明顯分離開,這與主成分分析和系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果一致。前人研究認(rèn)為,兩個(gè)品種間的遺傳相似系數(shù)為0.795,二者親緣關(guān)系較近[38]。檢測(cè)方法不同可能導(dǎo)致了結(jié)果差異[39]。本研究結(jié)果還表明,巖水雞白羽處于系統(tǒng)發(fā)生樹的最遠(yuǎn)分支,與本研究其他地方雞種相比存在明顯的遺傳差異。這在主成分、Fst和基于模型的聚類結(jié)果中均有體現(xiàn)。這個(gè)聚類結(jié)果與各品種在四川盆地的分布區(qū)域基本吻合, 說(shuō)明四川地方雞品種的形成與地理環(huán)境存在很大的關(guān)系[40]。
本研究應(yīng)用簡(jiǎn)化基因組對(duì)四川盆地的6個(gè)地方雞品種進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)巖水雞黑羽群體的遺傳多樣性較低,大寧河雞遺傳多樣性最為豐富。城口山地雞和大寧河雞之間的遺傳分化最低,基因流最高,豐巖烏骨雞和巖水雞黑羽群體之間的遺傳分化最高,對(duì)應(yīng)的基因流最低。巖水雞白羽群體和黑羽群體聚為一類,城口山地雞、大寧河雞和舊院黑雞聚為一類,豐巖烏骨雞單獨(dú)為一類。位于烏蒙山區(qū)的豐巖烏骨雞與大巴山脈的舊院黑雞、城口山地雞、大寧河雞、巖水雞黑羽和白羽具有較遠(yuǎn)的遺傳距離。