張依玲，闞子斐，牛 錚，余秋寒，冉 玲，張淑娟，鄒 宏，徐沙沙，張靜怡，宋振輝

(西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460)

精密組織切片(precision-cut tissue slices，PCTS)是許多研究人員廣泛使用的器官體外模型，實(shí)質(zhì)上是可以進(jìn)行體外培養(yǎng)的組織的活性外植體。通過使用專門的設(shè)備(組織切片機(jī))，它們可以制備出可重現(xiàn)的、定義良好的厚度，可以在保持組織活力的條件下從絕大多數(shù)類型的固體組織中制備組織切片，并保證切片中包含自然環(huán)境中組織的所有細(xì)胞類型，細(xì)胞間和細(xì)胞-基質(zhì)之間的相互作用保持完好[1]，為疾病模型的建立提供了一個(gè)新的選擇。

各種方法制備的器官組織切片作為體外系統(tǒng)已經(jīng)使用了幾十年，但由于切片缺乏重復(fù)性和組織制劑的相對(duì)有限的生存能力阻礙了切片作為廣泛的試驗(yàn)?zāi)Ｐ捅皇褂谩?923年，由奧托·沃伯格(Otto Warburg)首次利用精密組織切片作為一種離體模型用于測(cè)量腫瘤組織中細(xì)胞代謝和耗氧量，漢斯·克雷布斯(Hans Krebs)進(jìn)一步探索，研究包括人類在內(nèi)的各種動(dòng)物器官的氨基酸代謝。但由于未優(yōu)化的孵育條件和使用刀片手工切割，使它們的活性迅速喪失，厚度不一。直至1980年，一種新的半自動(dòng)儀器-克魯姆迪克組織切片機(jī)(Krumdieck tissue slicer)被發(fā)明，通過半自動(dòng)切片實(shí)現(xiàn)了定義明確的尺寸，并優(yōu)化了孵育條件，以重復(fù)制備薄而精密切割的肝切片，這種方式優(yōu)化了組織的活力，保存了分化細(xì)胞的代謝功能，并提高了重復(fù)性[2]。后來，隨著能夠重復(fù)生產(chǎn)相對(duì)較薄的組織切片的自動(dòng)切片機(jī)的生產(chǎn)和優(yōu)化，以及動(dòng)態(tài)器官培養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)，使得這項(xiàng)技術(shù)被廣泛使用。此后，精密組織切片不僅在健康細(xì)胞和癌細(xì)胞的代謝領(lǐng)域，而且在藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和毒性、纖維化和病毒感染中的應(yīng)用得到了廣泛的探索，為疾病模型的建立提供了一個(gè)新的方案[3]。本文簡要綜述了精密組織切片的制備方法、培養(yǎng)體系和活性檢測(cè)指標(biāo)，以及精密組織切片應(yīng)用于各個(gè)器官進(jìn)行藥理、毒理、病理、致病機(jī)制等不同方面的研究，以期為后續(xù)研究人員使用精密組織切片作為新型生物學(xué)體外離體模型進(jìn)行研究提供借鑒和參考。

1 精密組織切片的制備與培養(yǎng)

1.1 精密組織切片的制備

目前,已成功制備精密組織切片的器官包括肝、腎、心、肺、腸、脾等。不同器官的切片制備方法大致相似，主要區(qū)別在于組織的固定方式和不同器官切片厚度的選擇。精密組織切片的大致制備過程如圖1所示。

首先，為了準(zhǔn)備切片，必須從活體內(nèi)切除組織，用冰冷的PBS或者簡單的生理緩沖液沖洗動(dòng)物器官中的血液。切除后盡快將器官浸入冰冷的器官保存液中降溫，以減少缺血損傷。沖洗過程容易對(duì)組織細(xì)胞造成損傷，所以動(dòng)作要輕柔緩慢，盡量少次便清洗干凈。對(duì)于腸道，須多次沖洗腸腔，以去除腸道內(nèi)容物，并且使用的抗生素要多于實(shí)質(zhì)性器官的使用量以降低污染[4]。

切片時(shí)，實(shí)質(zhì)器官，如肝、腎等，清洗后直接用組織取芯工具，輕輕旋轉(zhuǎn)切割圓柱形的核心，制作成適合切片機(jī)大小的形狀便可。非實(shí)質(zhì)器官，如腸和肺，需要包埋在低熔點(diǎn)的瓊脂或明膠中形成固體器官樣結(jié)構(gòu)，修飾成合適大小后使用取芯工具輕輕旋出組織塊再進(jìn)行切片。后續(xù)在37 ℃的培養(yǎng)基中孵育，瓊脂糖可脫落或溶解，使組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與培養(yǎng)基直接接觸[5]。

影響切片存活的一個(gè)關(guān)鍵因素便是切片厚度，切片過厚容易缺乏氧氣和營養(yǎng)，過薄又會(huì)在切片過程中造成組織細(xì)胞的機(jī)械性損傷，致使切片活力喪失。切片厚度一般在100～500 μm變化，根據(jù)試驗(yàn)需求調(diào)整。肝和腎的制片厚度在200～250 μm 變化，心的制片厚度為200～300 μm， 肺的制片厚度在250～500 μm變化，腸切片在200～350 μm厚度處切割最佳。對(duì)于其他組織，厚度的描述并不一致，但250 μm通常被認(rèn)為是最有利的，該厚度允許足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣進(jìn)入切片，防止切片內(nèi)細(xì)胞層的壞死。切片厚度可以通過多種手段確定，包括機(jī)械測(cè)定和光學(xué)測(cè)微計(jì)以及計(jì)算切片濕重[5]。

最后，根據(jù)外觀選擇切片，好的切片具有相同的厚度，均勻的顏色和光滑的邊緣。使用彎曲的和切片大小等同的勺子小心轉(zhuǎn)移切片，以避免損壞切片。選好后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)[5-6]。

1.2 精密組織切片的培養(yǎng)

精密組織切片的成功制備的另一個(gè)關(guān)鍵因素是切片的培養(yǎng)體系，要求孵育切片時(shí)允許氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)能擴(kuò)散到切片內(nèi)部細(xì)胞層，并且避免切片中心內(nèi)壞死或活力不足。培養(yǎng)系統(tǒng)可分為3種系統(tǒng)：1)浸沒系統(tǒng)，使切片一直浸入培養(yǎng)基中，在錐形瓶或培養(yǎng)板中培養(yǎng)；2)動(dòng)態(tài)器官培養(yǎng)系統(tǒng)，通過滾動(dòng)培養(yǎng)容器讓切片間歇地暴露在培養(yǎng)基和氣相中；3)新改進(jìn)的灌注培養(yǎng)系統(tǒng)，其中切片被培養(yǎng)在梯度培養(yǎng)容器中，并使切片的頂面和底面暴露于流動(dòng)的培養(yǎng)基中[5,7-8]。

當(dāng)將切片短時(shí)間(小于48 h)孵育時(shí)，浸沒培養(yǎng)系統(tǒng)是合適的。器官切片通常置于6、12、24孔板，或50、125 mL錐形瓶中，2 mL培養(yǎng)基·片-1，然后將孔板或燒瓶置于搖床上，緩慢搖動(dòng)切片(70 r·min-1)。這種類型的孵育允許切片恒定地暴露于化合物，并允許人們?cè)诜浅６痰臅r(shí)間點(diǎn)移除培養(yǎng)基或切片而不結(jié)束孵育[5]；缺點(diǎn)是無法避免組織在切片-介質(zhì)界面處發(fā)生崩解，而且切片另一側(cè)容易壞死。對(duì)于長期培養(yǎng)，動(dòng)態(tài)器官培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)于其他孵育系統(tǒng)。將切片放在孵化搖籃的網(wǎng)狀面過濾器上，然后將這個(gè)搖籃放入一個(gè)裝有1.7 mL培養(yǎng)基的小瓶中，瓶子在培養(yǎng)箱中旋轉(zhuǎn)，在整個(gè)培養(yǎng)過程中不斷地將切片的兩個(gè)表面暴露在氣體和液體中[7,9]。該系統(tǒng)已被證明可以防止單側(cè)切片的壞死。然而，動(dòng)態(tài)器官培養(yǎng)系統(tǒng)的缺點(diǎn)是由于與網(wǎng)狀物接觸可能導(dǎo)致切片的機(jī)械損傷，而這在浸沒系統(tǒng)中是完全避免的。在保持蛋白質(zhì)表達(dá)和組織結(jié)構(gòu)方面，能夠持續(xù)交換培養(yǎng)基的灌注培養(yǎng)系統(tǒng)似乎優(yōu)于浸沒或動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。該容器的頂部和底部各有一個(gè)入口和一個(gè)出口，切片的頂面和底面連續(xù)暴露在流動(dòng)培養(yǎng)基中，使用流動(dòng)泵以100 mL·min-1的流速輸送培養(yǎng)基，可以允許培養(yǎng)基持續(xù)交換[8]。這也表明了培養(yǎng)基不僅要流動(dòng)，并且需要定期更新。然而該系統(tǒng)由于制備相對(duì)復(fù)雜，且成本高昂，所以使用率相對(duì)較低。

a、A.取出器官，沖洗干凈；b.切割組織塊；c、B．灌注低熔點(diǎn)瓊脂糖；d．置于冰盒中凝固；e．取芯；f、C．切片；g．篩選切片；h、D．培養(yǎng)a.A. Take out the organs and rinse it; b. Cut tissues; c, B．Infuse low-melting agarose; d．Place in ice box to freeze; e. Cut with tissue core knife; f, C. Cut with tissue slicer; g. Select precision-cut tissue slices; h, D. Incubation slices圖1 精密組織切片制作流程圖Fig.1 Piglet precision-cut lung slices making process

為了使組織切片具有良好的生存能力，培養(yǎng)基應(yīng)該是營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，如WME培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、Waymouth培養(yǎng)基等，并且含有葡萄糖和抗生素[10]。這種培養(yǎng)基可以用于所有組織的切片，但使用不同種類抗生素時(shí)需考慮是否會(huì)引起器官特異性毒性，有時(shí)還會(huì)在培養(yǎng)基中加入地塞米松、胰島素或表皮生長因子等加強(qiáng)切片活性。此外，還需要高氧濃度(>70%)，一般會(huì)選擇將培養(yǎng)系統(tǒng)置于5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[9]，并且在37 ℃的培養(yǎng)基中孵育后，灌注了低熔點(diǎn)瓊脂糖的組織切片中的瓊脂糖會(huì)脫落或溶解，利于組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與培養(yǎng)基直接接觸。對(duì)于超過48 h的孵化，需要考慮添加胎牛血清以維持切片活性[10]。最后，需要定期監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基的pH，及時(shí)更換新的培養(yǎng)基，一般每24 h更換一次新的培養(yǎng)基[8-9]。

2 精密組織切片的活性檢測(cè)指標(biāo)

精密組織切片的成功制備以及后續(xù)的活力和功能正常維持是試驗(yàn)數(shù)據(jù)可用且準(zhǔn)確的依據(jù)，因此監(jiān)測(cè)組織切片的活性對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性是很有必要的。

切片的組織形態(tài)、ATP水平的含量、活/死細(xì)胞染色(Calcein-AM/PI)是最常用于檢測(cè)精密組織切片活性變化的指標(biāo)[6,11]。切片的組織形態(tài)是否完整是將PCTS用于試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷幕A(chǔ)，通常直接使用電子顯微鏡觀察或隨機(jī)選取切片進(jìn)行HE染色來評(píng)估切片的完整性。ATP作為活體細(xì)胞最基本的能量來源，當(dāng)細(xì)胞凋亡、壞死或處于毒性狀態(tài)下時(shí)ATP水平會(huì)下降，因此測(cè)定切片的ATP含量可反映切片的活性，ATP含量代表了PCTS的活性[6]?；?死細(xì)胞染色試劑盒通過分析細(xì)胞質(zhì)膜完整性與細(xì)胞內(nèi)酯酶活性反映細(xì)胞活力[11]，其中Calcein-AM能穿透活細(xì)胞膜，將細(xì)胞染成綠色；PI則不能穿透活細(xì)胞膜，能將死細(xì)胞染成紅色，可用熒光顯微鏡在同一波長下同時(shí)觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞，也可在不同波長下分別觀察活/死細(xì)胞，其中，紅、綠熒光的比例便代表了切片的活力。此外，還有通過檢測(cè)組織特異性酶(如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或乳酸脫氫酶等)，功能酶(如不同類型的細(xì)胞色素)，I期和II期底物的恒定代謝率，MTT還原，K+保留等參數(shù)作為精密組織切片活性變化的指標(biāo)[11-12]。

3 精密組織切片在各個(gè)器官的應(yīng)用

3.1 肺切片(precision-cut lung slices，PCLS)

精密切割的肺切片在動(dòng)態(tài)器官培養(yǎng)下保持與體內(nèi)肺器官相似的高度分化功能是一種非常有效的工具。它被成功地用于肺基因轉(zhuǎn)移效率的評(píng)估、肺病毒感染效率的評(píng)估、組織保存介質(zhì)的研究和移植前優(yōu)化肺組織活力的組織后處理的研究。肺切片已經(jīng)成為研究炎癥刺激、感染和新型藥物化合物的呼吸反應(yīng)的有用體外工具。

由于保存了完整的顯微解剖結(jié)構(gòu)，細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中的重要作用已在肺精密組織切片中成功研究，從而可以在顯微鏡下監(jiān)測(cè)支氣管收縮。該模型允許在精密控制的暴露條件下和沒有血源性白細(xì)胞的情況下研究細(xì)胞因子對(duì)氣道張力和反應(yīng)性的直接影響[13]。而且肺切片可以同時(shí)測(cè)量收縮和細(xì)胞內(nèi)游離鈣，對(duì)于發(fā)展連接生化途徑和力產(chǎn)生的定量模型非常有用[14]。將單個(gè)精密切割的肺片安裝在聚二甲基硅氧烷的薄而靈活的支撐膜上，在生物反應(yīng)器中通過在靜態(tài)條件下施加不同的壓力，可以模擬與完整肺中描述的肺泡擴(kuò)張類似的情況[15]。

精密肺切片在應(yīng)用于評(píng)估藥物化合物在肺內(nèi)的代謝與反應(yīng)方面也表現(xiàn)優(yōu)異，Vickers等[16]證明了人和大鼠肺切片對(duì)環(huán)孢素衍生物具有代謝活性，表現(xiàn)出氧化和酯酶途徑。暴露于苯并[a]-芘(benzo[a]-pyrene)的精密切割肺切片證實(shí)了化合物的攝取和代謝先于誘導(dǎo)代謝物與DNA結(jié)合和加合物的形成[17]。肺組織可能在這種新陳代謝和化合物清除中發(fā)揮重要作用，特別是在吸入給藥之后，該模型可能有助于肺組織致癌物代謝和與DNA結(jié)合的種間研究。

精密切割的肺切片也可作為評(píng)估細(xì)菌或病毒等病原體感染肺部的平臺(tái)，可以評(píng)估宿主與病原體之間相互作用以及感染機(jī)制等。Banerjee等[18]建立了人類精密切割肺切片作為模擬肺炎鼠疫期間早期宿主/病原體相互作用的平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)纖溶酶原激活物蛋白酶Pla是肺鼠疫的早期宿主/病原體相互作用中的關(guān)鍵角色。Delgado-Ortega等[19]利用精密切割肺片作為離體模型研究了新生豬氣管細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞和精密切割肺片對(duì)H3N2亞型豬流感病毒的先天免疫反應(yīng)。Punyadarsaniya等[20]在精密豬肺切片上進(jìn)行了流感病毒感染效率的試驗(yàn)研究，證明肺切片對(duì)病毒感染的敏感性是常規(guī)肺組織培養(yǎng)的100倍。病毒感染誘導(dǎo)纖毛滯留的動(dòng)態(tài)變化與感染過程中產(chǎn)生的病毒量有一定的相關(guān)性，這種方法使研究肺細(xì)胞類型對(duì)病毒感染的相對(duì)易感性成為可能，這也為新型冠狀病毒肺炎感染機(jī)制的研究提供了一種新的思路。

同時(shí)，精密肺切片可能是一個(gè)評(píng)估基因輸送到肺組織上皮細(xì)胞非常有用的模型。McBride等[21]在將表達(dá)LacZ的腺病毒注入肺切片培養(yǎng)4 d后，可在細(xì)支氣管和肺泡細(xì)胞中觀察到LacZ的表達(dá)。

精密肺切片最近被用來建立肺組織缺血/再灌注損傷評(píng)估模型。心臟驟停誘導(dǎo)缺血，在心臟驟停后不同時(shí)間進(jìn)行瓊脂糖肺組織充氣，將精密肺切片培養(yǎng)24 h，檢測(cè)肺組織活力、氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，初步結(jié)果顯示，熱缺血4 h后肺組織活力仍能保持24 h[22]。最終，這種模式可能會(huì)在延長使用非心臟跳動(dòng)捐贈(zèng)者的肺進(jìn)行肺移植的時(shí)間延遲方面開辟新的領(lǐng)域。

3.2 腸切片(precision-cut intestinal slices，PCIS)

最初，精密組織切片技術(shù)并不適用于腸道。由于腸道是一個(gè)柔軟非實(shí)質(zhì)的器官，難以切片和孵育。后來由De Kanter等[23]改善，使用低熔點(diǎn)瓊脂糖填充腸腔，并垂直切開腸段，形成組織環(huán)。改進(jìn)的精密組織腸切片的制備和使用變得相對(duì)簡單和方便，并且擁有更好的重復(fù)性和組織活性。目前，精密切割腸切片已成功地應(yīng)用于藥物和其他外源物質(zhì)的運(yùn)輸、代謝、誘導(dǎo)、抑制和生理、毒理等方面的研究。

腸道廣泛參與藥物口服后的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和毒性，因此藥物的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)需要臨床前的研究。通過分析不同濃度底物孵育后和不同時(shí)間點(diǎn)后切片含量的增加，可以直接測(cè)量攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性。Li等[24]以大鼠和人的精密腸切片作為活體動(dòng)物模型，研究了根尖依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)活性以及功能的區(qū)域差異和種間差異。也有學(xué)者用膽酸、脫氧膽酸和?；悄懰嵫芯苛四懼嵩赑CIS中的攝取[25]。表明PCIS是可用于研究攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和外源性物質(zhì)與轉(zhuǎn)運(yùn)體相互作用的有效模型，并可作為一種潛在的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑的篩選工具。

隨著越來越多的藥物代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在腸道不同區(qū)域的識(shí)別，腸道作為決定藥物首過代謝的重要因素的作用得到了越來越多的認(rèn)識(shí)。CaCO-2單層培養(yǎng)被認(rèn)為是體外研究藥物腸道代謝的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而，由于不能反映組織的多細(xì)胞性和細(xì)胞去極化，限制了體內(nèi)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。而精密組織腸切片很好地解決了這一問題，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)腸切片的代謝活性比微粒體或從腸道制備的S9組分高得多，范圍從3倍～50倍不等[26]。表明PCIS是研究腸道代謝的一個(gè)有價(jià)值的模型。在使用誘導(dǎo)劑后，藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其核受體的mRNA表達(dá)梯度已被廣泛研究，但其對(duì)代謝活性的影響此前未見廣泛研究。在體內(nèi)口服給藥后，可以在切片上測(cè)量不同節(jié)段之間在大鼠腸道誘導(dǎo)方面的差異，體外試驗(yàn)允許所有片段平等地暴露于誘導(dǎo)劑[27]。因此，PCIS是研究腸道不同區(qū)域新陳代謝能力和誘導(dǎo)性的極好工具。

藥物所致的器官損傷是藥物開發(fā)和臨床治療中的一個(gè)重要的安全性問題，藥物毒性的關(guān)鍵靶器官通常是那些高度暴露于毒素的器官，包括肝、腎和腸道。腸道作為藥物首過代謝的器官，藥物對(duì)腸道的毒性的研究是非常有必要的。很多學(xué)者都以精密腸道組織為模型，研究過非甾體抗炎藥誘導(dǎo)的大鼠腸道毒性。在PCIS中觀察到典型的非甾體抗炎藥誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)改變，體內(nèi)外毒性排序與體外和體內(nèi)公布的數(shù)據(jù)有很好的相關(guān)性[28]。表明PCIS正確地反映了非甾體抗炎藥所致腸毒性的各種機(jī)制，可作為預(yù)測(cè)藥物所致腸道毒性的體內(nèi)外模型。

由于分化的腸上皮細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)不易獲得，分析腸道病原感染并不容易。Punyadarsaniya等[29]以精密腸組織切片為培養(yǎng)系統(tǒng)，分析禽流感病毒對(duì)分化腸上皮細(xì)胞的感染情況，從而解決了這一難題。證明了α2，3連接唾液酸是禽流感病毒的首選受體決定因子，存在于上皮細(xì)胞的頂端，并且絨毛上皮細(xì)胞(尖端)易受H9N2亞型禽流感病毒感染。表明了該培養(yǎng)系統(tǒng)可用于分析腸道上皮細(xì)胞的病毒感染，并且同樣適用于其他物種腸道病原感染的分析，為腸道病原感染研究提供了一種新的方法。

3.3 肝切片(precision-cut liver slices，PCLS)

精密切割的肝組織切片代表了一個(gè)健壯的、多功能的體外模型，它保留了肝環(huán)境的復(fù)雜和多細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)，包括肝臟浸潤的免疫細(xì)胞，是研究肝損傷、纖維化機(jī)制、病毒感染、細(xì)胞相互作用和識(shí)別新的治療靶點(diǎn)的理想模型。

目前，用于肝研究的體外細(xì)胞模型和體內(nèi)動(dòng)物模型不能完全模擬肝損傷和疾病進(jìn)展的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制，特別是在纖維化的發(fā)展過程中，精密切割的肝切片很好地彌補(bǔ)了其他模型的缺點(diǎn)。使用小鼠和人精密切割肝組織切片的體外模型評(píng)估奧帕利西布對(duì)纖維化形成的影響，發(fā)現(xiàn)奧米帕利西布對(duì)體外小鼠和人肝PCLS均有抗纖維化作用[30]。表明PCLS可作為探究治療肝纖維化的的靶點(diǎn)的有效模型。Coombes等[31]通過小鼠PCLS模型用瘦素誘導(dǎo)纖維化形成，并評(píng)估骨橋蛋白中和消除這一反應(yīng)的能力，證實(shí)了它作為抗纖維化治療的臨床前模型的實(shí)用性和優(yōu)勢(shì)。

酒精性肝病與多種病理表現(xiàn)有關(guān)，包括酒精性脂肪性肝炎、炎癥、纖維化和肝硬化。然而反映酒精性肝病發(fā)病機(jī)制的模型很少，因?yàn)槌Ｓ玫膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠等對(duì)酒精并不敏感，即使持續(xù)灌服也并不能導(dǎo)致嚴(yán)重的纖維化。PCLS暴露于酒精中會(huì)導(dǎo)致肝損傷、脂肪變性和氧化應(yīng)激，而且乙醇代謝可保存數(shù)天[32]。同時(shí)，在非酒精性脂肪性肝病中，保留肝浸潤淋巴細(xì)胞的精密切割肝組織切片也是在不同階段觀察肝變化和檢驗(yàn)新藥療效的良好模型[33]。

精密切割肝組織切片在病毒性肝炎的研究中也被證明有相當(dāng)大的實(shí)用價(jià)值。肝切片是研究病毒感染和復(fù)制機(jī)制、病毒生命周期和病毒在天然組織中傳播動(dòng)力學(xué)以及評(píng)價(jià)新型抗病毒藥物療效的理想體外模型。PCLS可感染乙型和丙型肝炎病毒(HCV)，以及腺病毒和腺相關(guān)病毒，作為研究病毒感染和復(fù)制的模型。在Lagaye等[34]的研究中，對(duì)切片培養(yǎng)進(jìn)行了長達(dá)10 d的跟蹤，顯示了HCV RNA在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，病毒蛋白的表達(dá)，細(xì)胞外感染性顆粒的產(chǎn)生。此外，感染后培養(yǎng)的切片上清液也能進(jìn)一步感染其他肝切片。

肝切片也可以從病變的肝中制備，例如嚴(yán)重的纖維化和肝硬化患者。切除的惡性/轉(zhuǎn)移性肝組織也可用于獲得腫瘤切片。來自肝細(xì)胞癌的組織切片(HCC-hPCLS)保留了腫瘤的微環(huán)境，并已被證明是抗肝細(xì)胞癌藥物臨床前測(cè)試的一個(gè)有價(jià)值的系統(tǒng)[35]。來自肝癌的PCLS可以作為肝癌的模型，通過與相匹配的外周血白細(xì)胞共培養(yǎng)來評(píng)估腫瘤-免疫細(xì)胞的相互作用[36]，這也是PCLS系統(tǒng)目前研究的一個(gè)新領(lǐng)域。

3.4 腎切片(precision-cut kidney slices，PCKS)

腎切片為研究各種對(duì)象提供了有用的工具，包括腎對(duì)毒物的反應(yīng)以及內(nèi)源性和外源性的腎新陳代謝，有機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和腎素釋放，腎最重要的功能都已經(jīng)使用切片系統(tǒng)進(jìn)行了研究，建立了合適的研究模型。

腎皮質(zhì)切片保留了完整器官的許多特征，包括集合管、Henle上行粗支、腎小球和直而曲折的近端小管，允許對(duì)腎毒物進(jìn)行細(xì)胞特異性評(píng)估[37]。PCKS已被證明可用于藥物毒理學(xué)研究，特別是用于揭示腎毒性的機(jī)制。Branchflower等[38]對(duì)P-450誘導(dǎo)劑苯巴比妥在體外可增強(qiáng)氯仿所致的毒性反應(yīng)的研究證明，腎組織切片模型在獲取腎中氯仿的有毒代謝產(chǎn)物的數(shù)據(jù)方面起了重要作用。Vickers等[39]研究了順鉑對(duì)腎切片的影響，清楚地證明了該藥物具有部位特異性毒性，表現(xiàn)為廣泛的腎小管壞死，而腎小球似乎未受影響。因此，PCKS可以用來探究藥物誘導(dǎo)的腎毒性的復(fù)雜機(jī)制。腎素分泌在腎切片模型中也得到了廣泛的研究，有研究者在大鼠腎皮質(zhì)切片上觀察到鈣對(duì)腎素釋放的雙相改變。向缺鈣切片重新注入鈣，最初導(dǎo)致腎素釋放增加，隨后持續(xù)下降，證明了細(xì)胞內(nèi)鈣活性和腎素釋放之間的反向關(guān)系[40]。

慢性腎病與腎纖維化相關(guān)，腎纖維化是一種病理過程，其特征在于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過度積累導(dǎo)致器官結(jié)構(gòu)和功能的喪失。在過去的幾十年中，已經(jīng)建立了多種模型來研究腎纖維化，由于缺乏多細(xì)胞特征，這些模型可能會(huì)出現(xiàn)一些與機(jī)體情況不匹配的現(xiàn)象。有研究者以小鼠腎為材料制備了精密腎組織切片，成功研究了精密腎切片中的纖維化以及干擾素γ和干擾素γ結(jié)合物PPB-PEG-IFNγ的抗纖維化作用[41]。表明PKCS模型是一種在多細(xì)胞和親纖維化環(huán)境下檢測(cè)纖維化病理生理和體外篩選抗纖維化藥物的新工具。從腫瘤腎切除的人皮質(zhì)組織中制備PCKS可引起炎癥組織反應(yīng)，而長期孵育(96 h)可誘導(dǎo)纖維增生，并且PCKS的功能維持超過48 h[42]。這些研究表明PCKS在培養(yǎng)過程中可保持其腎表型，是體外研究腎纖維化的一個(gè)很有前途的模型。

通過精密切割的倉鼠腎切片探究酚酸對(duì)腎切片中汞誘導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用中[43]，第1次將彗星檢測(cè)技術(shù)結(jié)合精密組織切片技術(shù)，以清晰和簡單的方式從腎組織切片中可視化彗星，表明精密組織切片是生物醫(yī)學(xué)研究中一種有機(jī)的三維體外研究模型。

3.5 心切片(precision-cut heart slices，PCHS)

雖然心切片不能保持培養(yǎng)心肌細(xì)胞的收縮反應(yīng)，但心切片對(duì)于某些研究來說是一個(gè)較好的選擇。它可以維持正常的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，并且分離過程不選擇特定的細(xì)胞群體，對(duì)不可移植的人體組織的適用性也是一個(gè)潛在的優(yōu)勢(shì)。心切片已成功地用于心肌損傷、體外毒理學(xué)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和探尋新的藥物靶點(diǎn)的研究。

精密切割的心切片適用于毒理學(xué)研究，肝/心切片共培養(yǎng)系統(tǒng)可用于研究肝代謝介導(dǎo)的心毒性[44]。在這些研究中，肝和心切片的共培養(yǎng)增強(qiáng)了心切片中烯丙醇的毒性，但不能增強(qiáng)烯丙胺的毒性。由于這些化合物對(duì)丙烯醛的代謝分別是由肝和血管特異性酶介導(dǎo)的，這些結(jié)果表明了共培養(yǎng)系統(tǒng)的潛力。雖然心切片不能保持在培養(yǎng)心肌細(xì)胞中看到的收縮反應(yīng)，但切片為許多體外毒理學(xué)研究提供了一種替代系統(tǒng)。

抗腫瘤藥物很受關(guān)注，而劑量依賴性的心毒性可能是癌癥化療的嚴(yán)重副作用。在精密切割的心切片系統(tǒng)中，通過測(cè)定切片的攝氧量和ATP生成量來評(píng)估表阿霉素、阿霉素和米托蒽醌等物質(zhì)的毒性。已證實(shí)蒽環(huán)素衍生物表阿霉素和米托蒽醌對(duì)大鼠心切片攝氧量和ATP含量的影響。心切片的攝氧量也是評(píng)估一系列阿霉素類似物相對(duì)心毒性的活性參數(shù)。卡米丁衍生物和輔酶Q對(duì)阿霉素相關(guān)的心毒性的細(xì)胞保護(hù)作用也在心切片上得到證實(shí)[45]。表明精密心組織切片為評(píng)估毒物對(duì)心肌組織的損傷提供了一種替代系統(tǒng)

鈉泵在心臟中特別重要，因?yàn)殡x子梯度對(duì)于維持心作為生理泵的收縮特性是極其重要的。Fischer等[46]用心切片研究了飲食和年齡對(duì)鈉-鉀泵活性的影響，發(fā)現(xiàn)鎂缺乏似乎對(duì)鈉-鉀泵的數(shù)量沒有影響，但確實(shí)降低了泵的活性。Wanless等[47]使用通過泵介導(dǎo)的活性離子傳輸?shù)闹苯訙y(cè)量，確定去甲腎上腺素對(duì)泵的刺激可以穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)離子濃度和靜息膜電位。這些數(shù)據(jù)都表明了心組織切片在研究生理泵方面的可行性和有效性。

由于心切片部分保留了電緊張性和旁分泌細(xì)胞間的相互作用，它們構(gòu)成了研究心細(xì)胞生物學(xué)的一個(gè)新穎的模型。Stuckmann等[48]很好地證明了這一點(diǎn)，用培養(yǎng)的心組織切片來說明雞胚心的心外膜分泌促紅細(xì)胞生成素和維甲酸，這是心肌細(xì)胞增殖所必需的。

心切片還被廣泛用于其他研究，包括肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)、β-腎上腺素能刺激環(huán)磷酸腺苷代謝和再灌注損傷。該模型適用于藥物安全評(píng)價(jià)，通過對(duì)不應(yīng)期的重復(fù)評(píng)估，可以對(duì)多式HERG抑制劑戊脒引起的復(fù)極損傷進(jìn)行敏感性分析[49]。仿生組織培養(yǎng)為研究成人心肌的藥物靶點(diǎn)、基因功能和細(xì)胞可塑性提供了新的機(jī)會(huì)，在此背景下，一些研究使用了人、小鼠或大鼠心切片，研究了心肌與人胚胎干細(xì)胞或骨髓細(xì)胞之間的相互作用[50]。

4 小結(jié)與展望

近年來，人們對(duì)器官組織模型重新產(chǎn)生了興趣，越來越多的試驗(yàn)者使用器官組織作為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。精密組織切片作為一種介于器官與細(xì)胞水平間的組織器官體外離體模型，在天然環(huán)境中包含了組織的所有細(xì)胞類型，不僅能夠比較完整地保存正常組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間的聯(lián)系及細(xì)胞極性，而且也能保證切片的生存能力，使其能夠最大限度地模擬在體狀態(tài)，并能充分維持組織活性、功能活性以進(jìn)行毒性、誘導(dǎo)和感染研究[51-52]。由于培養(yǎng)和切片技術(shù)有了重大改進(jìn)，可有效利用稀缺的組織制備大量非常薄的精密組織切片，可以提供足夠的試驗(yàn)材料，以便每個(gè)樣本都是自己的內(nèi)部對(duì)照，模型顯示出很好的結(jié)果重復(fù)性，提高了試驗(yàn)的可信度與準(zhǔn)確性。并且與體內(nèi)簡化的模型相比，具有很高的生物學(xué)相關(guān)性。而且根據(jù)3R (replacement，reduction，refinement)概念，精密組織切片大大地減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用量，改善動(dòng)物福利，降低使用動(dòng)物數(shù)量時(shí)由于個(gè)體差異無法避免的試驗(yàn)質(zhì)量問題[1]。精密組織切片的材料除了來自健康的動(dòng)物，也可從患病動(dòng)物手術(shù)中切除的廢棄組織中獲取[33]，在人以及某些稀有動(dòng)物的研究中，精密組織切片有助于提供真實(shí)的數(shù)據(jù)，克服研究一些人類疾病時(shí)由于物種差異而導(dǎo)致的問題。以上這些優(yōu)點(diǎn)都支持精密組織切片作為體外離體模型的應(yīng)用與發(fā)展。

雖然精密組織切片制備比較簡單方便，但依然存在一些問題和缺點(diǎn)，例如，在保持切片無菌時(shí)，沖洗器官時(shí)如何用最佳的方式減少對(duì)組織細(xì)胞的損傷以及制備不同組織切片培養(yǎng)基中抗生素的選擇。在切片培養(yǎng)期間，需要考慮如何最大限度地保證切片的生存力和活力。雖然前人已經(jīng)對(duì)上述一些問題進(jìn)行了不同程度的優(yōu)化和改進(jìn)，但該技術(shù)在切片培養(yǎng)方面仍有改進(jìn)空間。

目前，國內(nèi)鮮有對(duì)精密組織切片的研究，主要用于精密肝切片上的損傷、代謝、藥理等方面[53-54]，和一例應(yīng)用于動(dòng)物感染模型的研究[6]。而國外則早已運(yùn)用此技術(shù)，研究熱點(diǎn)多集中于代謝、藥理、毒理、轉(zhuǎn)運(yùn)、藥物評(píng)估、免疫反應(yīng)和病毒感染等方面，而一例對(duì)肝、肺、腎、小腸、結(jié)腸切片的聯(lián)合應(yīng)用來預(yù)測(cè)藥物全身代謝清除率[55]，更是拓展了精密組織切片的應(yīng)用范圍，推進(jìn)它向多器官聯(lián)合培養(yǎng)體外模型的發(fā)展。這些精密組織切片模型的建立，表明它可作為哺乳動(dòng)物研究中廣泛使用的生物學(xué)離體模型，適用于各種致病機(jī)制、生理病理的研究。希望在不久的將來，越來越多的應(yīng)用以及精密組織切片的不斷優(yōu)化和改進(jìn)能使這項(xiàng)很有前途的技術(shù)成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的創(chuàng)新替代品。