亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        臨床克雷伯菌屬碳青霉烯酶三種檢測方法的實驗比較研究

        2022-03-08 05:42:56陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西咸陽7046西安市第一醫(yī)院檢驗科西安7000
        關(guān)鍵詞:烯酶克雷伯青霉

        白 倩,趙 雅,,王 林(.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西咸陽 7046;.西安市第一醫(yī)院檢驗科,西安 7000)

        克雷伯菌屬屬于腸桿菌科,是導(dǎo)致肺炎、菌血癥、尿路感染以及創(chuàng)口感染的常見醫(yī)療相關(guān)感染病原菌,其多重耐藥現(xiàn)象是世界公眾衛(wèi)生健康面臨的緊迫挑戰(zhàn)。碳青霉烯類抗生素是治療多重耐藥克雷伯菌屬感染的首選用藥,但隨著臨床上此類抗生素的不合理使用,碳青霉烯耐藥克雷伯菌屬所致感染不斷增多[1]。我國碳青霉烯耐藥機制最常見為產(chǎn)碳青霉烯酶,主要流行類型為KPC 型(肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶)、NDM 型(新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶)、IMP 型(亞胺培南水解β-內(nèi)酰胺酶)以及VIM 型(維羅納整合子編碼β-內(nèi)酰胺酶),第一種屬于絲氨酸酶,后三種屬于金屬酶,分別由blaKPC,blaNDM,blaIMP和blaVIM基因編碼[2]。碳青霉烯酶遺傳和表型檢測的相關(guān)研究有助于全球監(jiān)測碳青霉烯耐藥菌的多樣性和流行性,且快速準確地檢測碳青霉烯酶,能夠幫助臨床及時地制定有效的治療方案以及實現(xiàn)對醫(yī)院內(nèi)感染的監(jiān)控[3]。至今尚無一種方法能夠快速、準確、簡便、經(jīng)濟、全面地檢測碳青霉烯酶,本文選取了實驗室常見的三種檢測方法,以聚合式酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)法為金標準,采用改良碳青霉烯酶滅活試驗(modified carbapenem inactivation method,mCIM)+ EDTA 碳青霉烯酶滅活試驗(EDTA-carbapenem inactivation method,eCIM)和GeneXpert法檢測克雷伯菌屬碳青霉烯酶或碳青霉烯酶基因,對這三種測試進行方法學(xué)比較,為臨床和實驗室選擇適合的方法提供參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 菌株來源 收集2019年1月~2021年5月西安市第一醫(yī)院及西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床分離出的克雷伯菌屬細菌,共計80 株,碳青霉烯類耐藥菌株43 株,碳青霉烯類敏感菌株37 株,剔除同一病人重復(fù)菌株,菌株分離鑒定按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》要求執(zhí)行。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(Escherichia Coli)ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705,肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706。所有菌株均使用菌株保存管于-80℃保存。

        1.2 儀器與試劑 GeneXpert?Carba-R 全自動病原體快速檢測系統(tǒng)及試劑盒(美國賽沛公司),基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(德國布魯克公司),Vitek 2 Compact 全自動細菌藥敏分析儀(法國生物梅里埃公司),PCR 擴增儀(美國Bio-Rad公司),電泳儀(北京六一儀器廠);胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tryptic soy broth,TSB,海博生物有限公司),MH 培養(yǎng)基(康泰生物有限公司),EDTA,細菌DNA 提取試劑盒及Taq PCR Mix 預(yù)混液(上海生工生物有限公司)。

        1.3 方法

        1.3.1 菌株鑒定及藥敏實驗:將凍存于-80℃冰箱菌株恢復(fù)至室溫,使用接種環(huán)接種于血瓊脂平板上,過夜孵育。使用質(zhì)譜儀進行細菌菌種鑒定,Vitek 2 Compact 全自動細菌藥敏分析儀進行藥敏試驗。

        1.3.2 PCR 法檢測耐藥基因:采用細菌DNA 提取試劑盒提取受試菌全基因組DNA,引物參照文獻[4]設(shè)計,交由生工生物有限公司合成,見表1。PCR 反應(yīng)體系共25μl:DNA 模板1μl,上、下游引物各1μl,Taq PCR Mix 12.5μl,ddH2O 9.5μl。擴增產(chǎn)物通過1.5ml/dl 瓊脂糖凝膠60V 電泳60min,最終在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。PCR 擴增陽性產(chǎn)物交由奧科生物有限公司進行雙向測序,在NCBI數(shù)據(jù)網(wǎng)上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)進行blast 序列比對。

        表1 碳青霉烯酶耐藥基因PCR 引物序列

        1.3.3 mCIM+ eCIM 試驗檢測耐藥表型:將凍存的菌株復(fù)蘇接種于血瓊脂平板上,過夜孵育。每個樣本取1μl 純菌落分別加入裝有2ml TSB 肉湯(mCIM試驗)和含20μl 0.5mol/L EDTA 的2ml TSB 肉湯(eCIM 試驗)的試管中,漩渦震蕩混勻。每個試管加入10μg 美羅培南藥敏紙片,確保肉湯浸沒紙片,37℃空氣孵育4h。使用大腸埃希菌ATCC 25922 與生理鹽水配置0.5 麥氏濃度單位(1×108CFU/ml)的菌懸液,將菌懸液均勻涂布于MH 平板上。將TSB 肉湯中的美羅培南紙片用無菌棉簽擠出多余水分,貼于已涂布有大腸埃希菌ATCC 25922 的MH平板上。倒置平板,37℃空氣孵育18~24h。結(jié)果判斷:mCIM 試驗陽性:美羅培南抑菌圈直徑6~15mm 或直徑16~18mm,但抑菌圈內(nèi)有散在菌落。mCIM陰性:抑菌圈直徑≥19mm。eCIM 試驗陽性:與mCIM 結(jié)果相比,抑菌圈直徑之差≥5mm,則判定為產(chǎn)金屬酶類碳青霉烯酶。eCIM 試驗陰性:與mCIM 結(jié)果相比,抑菌圈直徑之差≤4mm,則判定為產(chǎn)絲氨酸類碳青霉烯酶(mCIM 試驗陰性則不對eCIM 試驗結(jié)果進行解釋)。

        1.3.4 GeneXpert 檢測耐藥基因:使用一次性接種環(huán)挑取受試菌單個菌落,用生理鹽水配置成0.5 麥氏濃度單位菌懸液,取10μl 菌懸液加入樣本試劑內(nèi),漩渦震蕩混勻后取1.7ml 混合液加入GeneXpert?Carba-R 檢測試劑盒,使用GeneXpert?Carba-R 檢測系統(tǒng)對blaKPC,blaNDM,blaIMP,blaVIM,blaOXA-48 耐藥基因進行檢測。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用WHONET5.6 軟件對受試菌分布及耐藥情況進行統(tǒng)計分析。采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。以PCR 檢測耐藥基因為金標準,計算mCIM+eCIM試驗和GeneXpert 的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。Kappa 值>0.75(P<0.05)說明一致性較好。

        2 結(jié)果

        2.1 PCR 耐碳青霉烯酶基因檢出結(jié)果 經(jīng)PCR 擴增測序后,43 株碳青霉烯耐藥克雷伯菌屬中,40株攜帶耐藥基因,3 株未檢出耐藥基因。在NCBI數(shù)據(jù)庫進行blast 比對,blaKPC-2 有30 株,blaNDM-5有4 株,blaNDM-1 有4 株,blaIMP-4 有2 株。主要檢出為blaKPC-2。部分PCR 碳青霉烯酶基因擴增陽性結(jié)果見圖1。37 株碳青霉烯類敏感克雷伯菌屬均未檢出耐藥基因。

        圖1 耐碳青霉烯類克雷伯菌屬細菌blaKPC,blaNDM,blaIMP基因PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖

        2.2 mCIM 和eCIM 試驗結(jié)果 見表2。40 株碳青霉烯酶基因陽性受試菌中mCIM 試驗陽性40株,eCIM 試驗陰性(絲氨酸酶陽性)30 株,eCIM 試驗陽性(金屬酶陽性)10 株。3 株未檢出碳青霉烯酶基因的耐碳青霉烯克雷伯菌屬mCIM試驗均為陰性。37 株碳青霉烯酶敏感克雷伯菌屬mCIM 試驗均為陰性。

        2.3 GeneXpert 檢測結(jié)果 見表2。40 株碳青霉烯酶耐藥基因陽性受試菌中GeneXpert 共計檢出38 株攜帶碳青霉烯酶基因,分別為27 株攜帶blaKPC,8 株攜帶blaNDM,2 株攜帶blaIMP,1 株攜帶blaKPC+blaNDM。3 株未檢出碳青霉烯酶基因的耐碳青霉烯克雷伯菌屬GeneXpert 檢測結(jié)果均為陰性。37株碳青霉烯酶敏感克雷伯菌屬GeneXpert 檢測均為陰性。

        表2 三種檢測方法結(jié)果比較

        2.4 三種方法檢測碳青霉烯酶差異及方法學(xué)比較 以PCR 法為金標準,mCIM+eCIM 試驗檢測絲氨酸酶及金屬酶表型結(jié)果靈敏度、特異度以及陰、陽性預(yù)測值均為100%,一致率100%,Kapaa 值為1。GeneXpert 檢測敏感度為94.9%,特異度為97.6%,陽性預(yù)測值為97.4%,陰性預(yù)測值為95.2%,一致率96.3% Kappa 值為0.925。三種方法檢測碳青霉烯酶差異及各自優(yōu)缺點見表3。

        表3 三種檢測方法特點比較

        2.5 碳青霉烯耐藥克雷伯菌屬細菌藥敏結(jié)果分析43 株耐碳青霉烯克雷伯菌屬細菌中檢出攜帶碳青霉烯酶基因的有40 株,其余三株為非產(chǎn)碳青霉烯酶機制導(dǎo)致的碳青霉烯耐藥。43 株耐藥菌對亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別為97.7%(42/43)和100%(43/43),呈現(xiàn)高度耐藥現(xiàn)象,未有對多黏菌素耐藥菌株檢出。三種不同基因型藥敏實驗結(jié)果見表4,對blaKPC及blaNDM兩種基因型進行耐藥率比較分析,結(jié)果顯示blaKPC對阿米卡星的耐藥率高于blaNDM(P<0.05),blaNDM對米諾環(huán)素耐藥率明顯高于blaKPC(P<0.05)。

        表4 43 株碳青霉烯耐藥克雷伯菌屬常用抗生素耐藥率(%)

        3 討論

        1985年以來,碳青霉烯類抗生素一直是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌感染的首選治療藥物。但隨著耐碳青霉烯腸桿菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae,CRE)出現(xiàn)及全球傳播,其多重耐藥趨勢以及血流感染期間高死亡率特征,已經(jīng)成為一個日益嚴重的公共衛(wèi)生問題[5-6]。在碳青霉烯耐藥機制中,產(chǎn)碳青霉烯酶最為重要,編碼碳青霉烯酶的基因通過可移動遺傳元件實現(xiàn)耐藥基因在菌株或菌種之間的水平傳播,含碳青霉烯酶基因的質(zhì)??梢酝ㄟ^recA基因在細菌細胞內(nèi)形成質(zhì)粒多聚體,導(dǎo)致碳青霉烯耐藥性的增加[7-8]。研究表明產(chǎn)碳青霉烯酶耐藥菌比非產(chǎn)酶耐藥菌毒性和傳播力更強,且需要實施更多的感染控制干預(yù)措施[9-10]。因此,探究更快更準確地檢測碳青霉烯酶方法對指導(dǎo)臨床用藥以及控制耐藥菌株的產(chǎn)生與傳播至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)mCIM+ eCIM 試驗與GeneXpert 檢測碳青霉烯酶與PCR 法結(jié)果高度一致。

        傳統(tǒng)PCR 方法作為檢測碳青霉烯耐藥基因的金標準,需要設(shè)計特定引物。若待測基因與靶基因不符、待測基因拷貝數(shù)太低以及引物突變會導(dǎo)致假陰性結(jié)果,本研究有三株臨床藥敏實驗結(jié)果顯示碳青霉烯耐藥,但未檢測到碳青霉烯酶基因,可能是其他耐藥機制引起的耐藥或者本研究選擇擴增的基因有限所導(dǎo)致。PCR 法對實驗條件、設(shè)備及操作人員的要求較高,臨床實驗室難以常規(guī)開展,因此需要一種能夠快速準確的檢出碳青霉烯酶的方法[11]。

        美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的mCIM和eCIM 試驗通過碳青霉烯酶水解美羅培南以及EDTA 能夠抑制金屬β-內(nèi)酰胺酶活性的特點,即使待測菌株低水平表達碳青霉烯酶,mCIM 試驗也能準確地檢測出[12]。但目前mCIM 試驗僅被推薦用于腸桿菌科細菌碳青霉烯酶的檢測,在HOWARD等[13]人的研究中,mCIM 被用于檢測不同革蘭陰性桿菌是否產(chǎn)生碳青霉烯酶,結(jié)果顯示mCIM 對產(chǎn)碳青霉烯酶銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌敏感度分別為74.1%和10.0%,對腸桿菌細菌的敏感度為96.2%。本研究與2018年CLSI 評價mCIM+ eCIM試驗檢測腸桿菌科細菌產(chǎn)絲氨酸酶和金屬酶的敏感度、特異度結(jié)果相似。但有學(xué)者表明絲氨酸酶與金屬酶共表達會導(dǎo)致eCIM 試驗篩選金屬酶的靈敏度降低,并且EDTA 對絲氨酸酶的抑制作用會導(dǎo)致結(jié)果僅表現(xiàn)金屬酶陽性,因此當臨床分離到高MIC值的腸桿菌科細菌時應(yīng)注意是否為絲氨酸酶與金屬酶共表達菌株[14]。mCIM 和eCIM 試驗檢測碳青霉烯酶以及區(qū)分表型具有較高的敏感度和特異度,經(jīng)濟學(xué)價值高、操作簡單且結(jié)果易于判斷[15]。但其檢測周期長不能達到快速檢測的目的,適用于基層實驗室開展,不建議臨床微生物實驗室將其作為常規(guī)檢查項目開展。

        GeneXpert?Carba-R 試劑盒是由美國賽沛公司研發(fā)半巢式實時熒光定量PCR 技術(shù),是一種自動化的體外檢測試驗,可以直接采用直腸拭子和臨床分離株進行碳青霉烯耐藥基因檢測,試劑盒內(nèi)含有多對引物,涵蓋了在中國流行的主要碳青霉烯類耐藥基因(包括blaKPC,blaNDM,blaIMP,blaVIM以及blaOXA-48),最新版本的檢測試劑盒對blaOXA-48 的變異體blaOXA-181 和blaOXA-232 亦有著很好的檢出率[16-17]。本研究中采用臨床分離株進行檢測,主要涉及blaKPC,blaNDM,blaIMP三種基因型的檢測,與參考方法相比一致程度高。最近有人將GeneXpert技術(shù)直接用于深部痰標本中篩選腸桿菌科細菌基因,結(jié)果顯示其對blaKPC和blaNDM兩種基因型的靈敏度較高,有望成為直接在已知存在blaKPC和blaNDM型耐藥菌感染風險的痰標本中檢測和鑒定腸桿菌科細菌的潛在工具[19]。但這種檢測方法的局限性是不能檢測到新出現(xiàn)的或罕見的碳青霉烯酶基因,對于疑似產(chǎn)生碳青霉烯酶的菌株和陰性試驗結(jié)果,應(yīng)在參考實驗室進一步評估是否存在碳青霉烯酶基因[20]。與其他兩種方法相比,GeneXpert 這種分子方法具有更快地識別所涉及的耐藥基因、能夠允許迅速開始適當治療的優(yōu)勢[21]。

        綜上所述,快速準確地檢測出產(chǎn)碳青霉烯酶細菌對于優(yōu)化抗生素管理、控制感染、改善預(yù)后、減緩耐藥菌的發(fā)展至關(guān)重要。臨床實驗室可以將GeneXpert 技術(shù)作為快速檢測碳青霉烯耐藥基因的首要選擇,為危急患者爭取寶貴的時間。

        猜你喜歡
        烯酶克雷伯青霉
        變棲克雷伯菌感染患者的臨床特征
        膠體金免疫層析法快速檢測血培養(yǎng)腸桿菌目細菌碳青霉烯酶的對比研究
        侵襲性和非侵襲性肺炎克雷伯菌肝膿腫CT特征對比
        碳青霉烯類抗生素耐藥機制的研究進展
        三種方法聯(lián)合檢測在非HIV感染兒童馬爾尼菲青霉病的臨床應(yīng)用
        產(chǎn)IMP-1型碳青霉烯酶非脫羧勒克菌的分離與鑒定
        黏質(zhì)沙雷菌的耐藥率分析及碳青霉烯酶的檢測
        連翹等中草藥對肺炎克雷伯菌抑菌作用的實驗研究及臨床應(yīng)用
        拮抗擴展青霉菌株的篩選及其抗菌活性物質(zhì)分離
        影響肺炎克雷伯菌粘附上皮細胞作用的研究
        你懂的视频网站亚洲视频| 国产精品99久久精品爆乳| 亚洲欧美性另类春色| 亚洲处破女av一区二区| 国产人妻熟女呻吟在线观看| 妇女bbbb插插插视频| 欧美丰满熟妇bbbbbb百度| 国产精品亚洲综合色区丝瓜| 成人一区二区三区国产| 免费观看18禁无遮挡真人网站| 无码专区久久综合久中文字幕| 欧美亚洲另类自拍偷在线拍| 国产中文字幕亚洲国产| 久久婷婷五月综合色丁香| 一本久久a久久精品亚洲| 国产国拍亚洲精品福利| 亚洲综合中文日韩字幕| 亚洲一区二区三区影院| 亚洲丁香五月激情综合| 太大太粗太爽免费视频| 日本精品久久不卡一区二区| 成年女人免费视频播放体验区 | 国产精品高清一区二区三区不卡| 国内精品伊人久久久久影院对白| 日本一区二区三区中文字幕最新| 一区二区三区日本视频| 丝袜美腿一区二区三区| 国内精品久久久久久久久齐齐 | 久久精品国产亚洲av豆腐| 深夜福利啪啪片| 免费现黄频在线观看国产| 黑人巨大亚洲一区二区久| 91日韩东京热中文字幕 | 欧美成人网视频| 久久人妻一区二区三区免费| 香港三级精品三级在线专区| 国产高清吃奶成免费视频网站| 中文字幕亚洲中文第一| 久久久久国产精品| 国产黄页网站在线观看免费视频| 日本中文字幕一区二区在线观看|