陳海南 盧園 楊舟 孫夢(mèng)龍 王蘭蘭 薛惠天 彭亮

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18只3月齡的新西蘭大耳白兔，雌雄各半，體質(zhì)量范圍為252.41～320.67克，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(湘)2015-0008]。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度恒定在20～25℃，濕度保持50%～70%。

1.2 試劑與儀器

蛋白磷酸酶抑制劑(北京普利萊)，蛋白酶抑制劑(北京金泰宏達(dá))，標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置(北京六一)，ZTC-II按摩手法測(cè)試儀(上海騰蔭教學(xué)儀器有限公司)，石蠟切片機(jī)(浙江金華)，TGF-β1、IL-6試劑盒(武漢華美，批號(hào)：C0358190399、G19035853)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京永光明)，全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)與分析儀(深圳匯松科技)。

1.3 動(dòng)物分組與造模

根據(jù)文獻(xiàn)[10]中的改進(jìn)方法，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，使用自制重錘擊打家兔右后肢以建立股四頭肌損傷模型。模型具體制備過(guò)程：將兔腹部朝上固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，選取右后肢的股四頭肌肌腹中部為圓心，畫一直徑1 cm的圓圈標(biāo)記擊打處，并覆蓋一層紗布防止擊打過(guò)程中造成表皮損傷。專人使用特制重錘(質(zhì)量850 g，用于擊打的錘面為光滑木質(zhì)圓柱，直徑1.5 cm)從40 cm高處沿光滑不銹鋼管以自由落體方式下落擊打標(biāo)記的受擊處，連續(xù)擊打6次。測(cè)算求得每次擊打的動(dòng)能為3.33 J，沖量為2.38 Ns，擊打面積約為1.77 cm2。擊打過(guò)程中有專人以手固定兔腿部，防止因家兔掙扎移動(dòng)導(dǎo)致?lián)舸虿课黄苹蛟斐善渌鈧?。造模成功?biāo)準(zhǔn)為肉眼觀察受擊處有明顯的淤血腫脹，且無(wú)明顯皮膚損傷與骨折，以手輕觸時(shí)家兔有明顯的逃避反射。滿足上述條件認(rèn)定造模成功，將造模成功兔放回籠中正常飼養(yǎng)。

1.4 小魚(yú)際法治療

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 取材 造模后第8天，采用耳緣靜脈注射空氣處死動(dòng)物，保證取材過(guò)程中的無(wú)菌環(huán)境后暴露分離股四頭肌，切取損傷最為嚴(yán)重的骨骼肌組織用于后續(xù)檢測(cè)。

1.5.2 骨骼肌組織形態(tài)學(xué)觀察 切取適量受損最嚴(yán)重部位的骨骼肌組織，進(jìn)行常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片，隨后進(jìn)行蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，染色后以中性樹(shù)膠封片，置于顯微鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.5.3 Western Blot法檢測(cè)骨骼肌組織GDF-8與F-肌動(dòng)蛋白的表達(dá) 剪取0.03 g受損最嚴(yán)重部位的骨骼肌組織，用冰預(yù)冷PBS洗組織，剪碎后放入生物樣品均質(zhì)儀，并向其中加入400 μL RIPA裂解液，反復(fù)研磨直至肉眼無(wú)法觀測(cè)到組織塊，冰上裂解10分鐘后，置于已經(jīng)預(yù)冷的離心機(jī)上，在4℃下以12 000 r/min離心15分鐘，提取上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，后經(jīng)過(guò)制膠、蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、顯色曝光，檢測(cè)骨骼肌中GDF-8和F-肌動(dòng)蛋白表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，重復(fù)3次。

1.5.4 ELISA法檢測(cè)骨骼肌組織TGF-β1與IL-6的表達(dá) 剪取適量受損最嚴(yán)重部位的骨骼肌組織，用1×PBS洗去血污并置于組織研磨器中制成組織勻漿，-20℃保存一晚后經(jīng)2次凍融處理破壞細(xì)胞膜，后將組織勻漿置于2～8℃以5 000 g轉(zhuǎn)速離心5分鐘，提取上清液。試劑盒于低溫取出后置于室溫至少30分鐘，并通過(guò)離心、稀釋、溶解、吹打混勻等步驟配置。在反應(yīng)終止后5分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小魚(yú)際法對(duì)骨骼肌損傷家兔骨骼肌組織病理學(xué)的影響

骨骼肌組織HE染色結(jié)果可見(jiàn)，空白組肌細(xì)胞分布緊密，無(wú)明顯間隙；模型組大量肌細(xì)胞破損變形，細(xì)胞間隙相比空白組顯著增大，細(xì)胞間大量肌纖維、瘢痕形成；治療組細(xì)胞間隙相比于模型組更小，細(xì)胞間纖維組織較少，細(xì)胞形態(tài)更接近健康肌細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

注：A、B 空白組；C、D 模型組；E、F 治療組。

2.2 小魚(yú)際法對(duì)骨骼肌損傷家兔骨骼肌組織GDF-8、F-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組與治療組GDF-8表達(dá)量都出現(xiàn)顯著上升，同時(shí)治療組GDF-8表達(dá)水平顯著低于模型組。與空白組相比，模型組與治療組F-肌動(dòng)蛋白表達(dá)量都出現(xiàn)顯著上升，同時(shí)治療組F-肌動(dòng)蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組。上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表1。

注：1、4 空白組；2、5 模型組；3、6治療組。

表1 小魚(yú)際法對(duì)骨骼肌損傷家兔骨骼肌組織GDF-8、F-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響

2.3 小魚(yú)際法對(duì)骨骼肌損傷家兔骨骼肌組織TGF-β1、IL-6表達(dá)的影響

模型組TGF-β1表達(dá)量相比于空白組有明顯上升，治療組TGF-β1表達(dá)量相比于模型組又有進(jìn)一步提升。模型組、治療組IL-6的表達(dá)量相比于空白組均出現(xiàn)明顯上升，但治療組相比于模型組則出現(xiàn)了明顯的下降。上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 小魚(yú)際法對(duì)骨骼肌損傷家兔骨骼肌組織TGF-β1、IL-6表達(dá)的影響

3 討論

生理學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察證明，當(dāng)骨骼肌嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，需要先通過(guò)中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞引發(fā)的炎癥反應(yīng)清除壞死組織，而后周邊正常肌肉組織開(kāi)始分裂增生以修復(fù)損壞肌肉[12]。正常肌肉組織的增生依賴于肌膜的完整性與附著于其上肌核的存活，而當(dāng)損傷過(guò)于嚴(yán)重時(shí)，過(guò)多壞死組織會(huì)使得機(jī)體不得不依賴長(zhǎng)時(shí)間的炎癥反應(yīng)來(lái)清理患處。這會(huì)損傷周邊組織，造成肌肉組織的增生能力下降。此時(shí)結(jié)締組織修復(fù)會(huì)占據(jù)主導(dǎo)，損傷部位會(huì)被填充大量纖維化結(jié)締組織，從而形成瘢痕，造成肌肉彈性與收縮能力下降。因此加快正常肌肉組織的再生速度，減緩肌肉纖維化與損傷后的炎癥反應(yīng)是保障損傷后肌肉運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵[13-14]。

GDF-8是一種能夠抑制肌肉生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，最早由遺傳學(xué)家McPherron和Se-Jin Lee于1997年發(fā)現(xiàn)[15]。研究證實(shí)這一物質(zhì)能有效抑制肌肉的生長(zhǎng)與肌肉量，而缺乏GDF-8的動(dòng)物個(gè)體，在保證營(yíng)養(yǎng)的前提下即使不經(jīng)過(guò)鍛煉，肌肉生長(zhǎng)速度與肌肉量也顯著高于同類正常個(gè)體。F-肌動(dòng)蛋白則在早期已被證明是一種參與肌肉組織修復(fù)與肌肉運(yùn)動(dòng)功能的重要蛋白質(zhì)。在肌肉損傷恢復(fù)過(guò)程中，眾多研究表明TGF-β1是抑制炎癥反應(yīng)的一種重要生理因子[16-18]，而IL-6則是一種重要的促炎因子，在外傷、手術(shù)等情況時(shí)其表達(dá)水平往往會(huì)急劇升高，引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[19]。目前從GDF-8與F-肌動(dòng)蛋白這兩項(xiàng)指標(biāo)探討推拿治療骨骼肌損傷與抑制炎癥反應(yīng)的內(nèi)在機(jī)理研究較少，故而揭示推拿治療骨骼肌損傷、抑制炎癥反應(yīng)與GDF-8和F-肌動(dòng)蛋白這兩項(xiàng)指標(biāo)之間的關(guān)系，可以為推拿治療骨骼肌損傷提供多角度的生理學(xué)依據(jù)，也可以為后續(xù)的臨床改良與深入實(shí)驗(yàn)研究提供新思路與方向。