井敏敏　黃炳鈺　戴小紅　李棟梁　陳晶晶

摘? 要：澳洲堅(jiān)果原產(chǎn)于澳大利亞亞熱帶雨林，是我國(guó)新興的重要經(jīng)濟(jì)作物，其種質(zhì)資源豐富，但遺傳背景復(fù)雜，親緣關(guān)系混亂。開(kāi)展澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，可拓展澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源創(chuàng)新利用途徑，有效加快澳洲堅(jiān)果育種進(jìn)程。形態(tài)表型分析是最早用于種質(zhì)鑒定和管理的標(biāo)記之一，但易受環(huán)境因素影響。DNA分子標(biāo)記技術(shù)在種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析中克服了傳統(tǒng)表型分析易受環(huán)境影響的缺點(diǎn)。本研究采用9對(duì)高多態(tài)性SSR引物對(duì)91份國(guó)外引進(jìn)以及自主選育品種（品系）澳洲堅(jiān)果種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，共擴(kuò)增出73個(gè)等位基因位點(diǎn)，平均等位基因8個(gè)，平均基因多樣性為0.689，平均雜合度為0.578，多態(tài)性信息含量PIC為0.453～0.792，平均值為0.659，表明91份澳洲堅(jiān)果具有較高的多態(tài)性。UPGMA聚類分析表明，在遺傳距離為0.33處，將91份澳洲堅(jiān)果分為2大類，且其親緣關(guān)系與地理來(lái)源無(wú)顯著相關(guān)性，與主成分分析、Structure分析結(jié)果一致。本研究供試澳洲堅(jiān)果材料群體內(nèi)遺傳變異顯著高于群體間變異，且遺傳成分來(lái)源單一，遺傳結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單。本研究為澳洲堅(jiān)果種質(zhì)的有效利用以及核心種質(zhì)構(gòu)建提供理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步加速澳洲堅(jiān)果種質(zhì)遺傳改良以及分子輔助育種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：澳洲堅(jiān)果;種質(zhì)資源;SSR標(biāo)記;遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S664.9??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Genetic Diversity Analysis of Germplasm Resources by SSR Markers

JING Minmin HUANG Bingyu DAI Xiaohong ?LI Dongliang CHEN Jingjing

South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / National Field Genebank for Tropical Fruits / Key Laboratory of Tropical Fruit Tree Biology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

， derived from the Australian subtropical rainforest， is a recently domesticated nut crop in China. is rich in germplasm resources. However， the genetic background of is complex and the genetic relationship is unclear. The genetic diversity analysis of germplasm resources can expand the innovative utilization of and effectively improve the breeding process. Morphological traits are among the earliest markers used in germplasm characterization and management. However， phenotypic analysis is easily affected by environmental factors， resulting in deviation in the results. DNA molecular marker technology overcomes the shortcomings of traditional phenotypic analysis vulnerable to environmental impact in germplasm resource identification and genetic diversity analysis. The genetic diversity of 91 germplasm introduced from abroad and self-breeding varieties （lines） was analyzed by 9 simple sequence repeat （SSR） loci in this study. The results showed that a total of 73 alleles were amplified by 9 pairs of SSR primers， with average of 8 per marker. The average genetic diversity was 0.689. The average heterozygosity was 0.578. The polymorphic information content （PIC） of each locus varied from 0.453 to 0.792 with an average of 0.659， indicating that germplasm had high genetic diversity. UPGMA cluster analysis showed that the tested resources could be divided into two groups at the genetic distance of 0.33. The first category includes all tetraphylla species， Nelmak1-1， Nelmak1-2 and HAMC14， with a total of 19 germplasms. The second category contains 72 germplasms， mainly the cultivated varieties in Australia and Hawaii and self-breeding varieties （lines） in China. There was no significant correlation between genetic relationship and geographical origin. The results were consistent with population genetic structure analysis and principal component analysis. For population genetic structure analysis， Bayesian clustering modelling was executed in the Structure software using data generated by SSR marker-based profiling and diversity analysis of 91 accessions. The highest log-likelihood was performed which provided the maximum peak at =2， indicating that all genotypes represent two distinct clusters. In addition， the results showed that the genetic components of germplasm were single and the genetic structure was relatively simple. AMOVA analysis showed that the genetic variation within populations was 90% and that among populations was 10%， indicating that the genetic variation of used in this research within population was significantly higher than that among population. This study provides a theoretical basis for the effective utilization of germplasm and the construction of core germplasm. In addition， we therefore aimed to use the SSR markers to accelerate genetic improvement in breeding program. These results lay a foundation for molecular marker-assisted breeding in .

; germplasm resources; SSR marker; genetic diversity

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.02.005

澳洲堅(jiān)果（ F. Muell），別名夏威夷果、昆士蘭栗、澳洲核桃，屬山龍眼科澳洲堅(jiān)果屬，常綠喬木，原產(chǎn)于澳大利亞昆士蘭州東南部和新南威爾州北部、南緯25°～31°的沿海亞熱帶雨林。澳洲堅(jiān)果果仁含油率達(dá)60%～80%，含蛋白質(zhì)、糖類約9%，并包含人體所必需的氨基酸以及豐富的鈣、磷、鐵和維生素，被譽(yù)為“堅(jiān)果之王”，成為熱帶地區(qū)新興的經(jīng)濟(jì)作物。澳洲堅(jiān)果屬包含4個(gè)種，其中 Maiden & Betche、 L.A.S. Johnson及其雜交種廣泛用于商業(yè)種植。我國(guó)澳洲堅(jiān)果種植起步較晚，近年來(lái)，我國(guó)云南、廣西、貴州等?。▍^(qū)）進(jìn)行了大規(guī)模引種種植，2019年種植面積達(dá)24.5萬(wàn)hm，全年總產(chǎn)量（未去殼果）0.494萬(wàn)t，全年總產(chǎn)值152 278.6萬(wàn)元（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)墾局統(tǒng)計(jì)）。澳洲堅(jiān)果市場(chǎng)容量大，在我國(guó)具有很好的發(fā)展前景。

澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源豐富，但由于交叉引種、雜交、自然變異等因素，遺傳背景復(fù)雜，親緣關(guān)系混亂。因此，開(kāi)展澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，可有效提升澳洲堅(jiān)果育種進(jìn)程。種質(zhì)遺傳多樣性主要通過(guò)表型性狀和分子標(biāo)記等方式進(jìn)行評(píng)價(jià)。20世紀(jì)90年代起，國(guó)外研究學(xué)者借助表型性狀和同工酶開(kāi)展了澳洲堅(jiān)果遺傳多樣性分析。國(guó)內(nèi)李文華對(duì)15個(gè)澳洲堅(jiān)果品種幼齡期植物學(xué)形態(tài)進(jìn)行觀察，陳業(yè)淵編制了澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源描述規(guī)范，王維對(duì)21份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源的主要生物學(xué)特性進(jìn)行了觀測(cè)研究，曾輝等主編出版了《澳洲堅(jiān)果品種圖譜》，涵蓋‘H2’‘O.C’‘344’‘695’等主要栽培品種。

但是，表型性狀受外界環(huán)境影響較大，且要求種植者具有較高的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，其分析結(jié)果缺乏穩(wěn)定性。近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展迅速，AFLP、RAPD、RAF、ISSR、SSR、SNP等分子標(biāo)記逐漸應(yīng)用于澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源鑒定。

SSR又稱微衛(wèi)星序列，1～6個(gè)堿基單元重復(fù)序列，為共顯性標(biāo)記，具有多態(tài)性高、分布廣泛、遺傳穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便以及引物通用等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于作物遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定以及育種工作中。然而國(guó)內(nèi)對(duì)澳洲堅(jiān)果SSR分子標(biāo)記的報(bào)道很少，僅報(bào)道了澳洲堅(jiān)果SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化，以及雜交F1代SSR鑒定，未對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)性分析以及鑒定。本研究對(duì)國(guó)外引進(jìn)以及自主選育品種（品系）的91份澳洲堅(jiān)果材料，通過(guò)SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為澳洲堅(jiān)果種質(zhì)的有效利用以及核心種質(zhì)構(gòu)建提供理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步為加速澳洲堅(jiān)果種質(zhì)遺傳改良以及分子輔助育種奠定基礎(chǔ)。

?材料與方法

材料

參試澳洲堅(jiān)果材料共91份（表1），新鮮幼嫩葉片材料均采集于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，采用75%酒精擦拭干凈，保存于–80℃?zhèn)溆谩?/p>

提取與擴(kuò)增

樣品DNA采用QIAGEN DNeasy Plant Kit（QIAGEN， Valencia， California， USA）提取，以0.8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA質(zhì)量，并采用Nanodrop 1000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific， Wilmington， DE， USA）測(cè)定其濃度與純度，稀釋至20?ng/μL置于–20℃保存?zhèn)溆?。本研究所用SSR引物參考NOCK等以及SCHMIDT等的文獻(xiàn)，篩選出9對(duì)穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的引物（表2），均由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為20?μL，含20?ng DNA模板、0.5?U DNA聚合酶、10?μL PCR?buffer、0.1?mmol/L dNTPs、2?mmol/L MgCl、0.2?μmol/L引物。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4?min，94℃變性30?s，退火30?s，72℃延伸40?s，28個(gè)循環(huán);72℃延伸5?min;4℃保存。

PCR產(chǎn)物稀釋20倍，按照HT DNA Extended Range LABCHIP（PerkinElmer， USA）以及HT DNA 1k Reagent kit， Dual protocol（PerkinElmer， USA）使用說(shuō)明，使用LabChip GX touch HT 24生物大分子儀（PerkinElmer， USA）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，并在電腦上讀取條帶大小數(shù)據(jù)。

?數(shù)據(jù)處理

采用PowerMarker v3.25軟件計(jì)算每對(duì)SSR引物等位基因數(shù)（allele number）、最大等位基因頻率（major allele frequency）、基因多樣性（gene diversity）、雜合度（heterozygosity）、多態(tài)性信息量（polymorphism information content， PIC），并計(jì)算樣本間Nei’s遺傳距離，采用非加權(quán)分組算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，使用MEGA5.2軟件進(jìn)行聚類樹(shù)繪制。

使用GenALEx 6.4.1計(jì)算群體間分化系數(shù)（between-population differentiation， ）、群體內(nèi)近交系數(shù)（inbreeding coefficients of individuals relative to the sub-population， ）和群體間近交系數(shù)（inbreeding coefficients of individuals relative to the total population， ），以及主成分分析、AMOVA分析。

采用Structure v2.3.4軟件對(duì)91份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，采用混合祖先模型（admixture model）和等位變異發(fā)生頻率相關(guān)模型（allele frequency correlated model），設(shè)置Length of Burn-in Period和Number of MCMC rers after buin in參數(shù)值分別為10?000和100?000，值設(shè)置為1～10，重復(fù)5次，將Structure運(yùn)行結(jié)果打包上傳至Structure Harvester獲得最佳值，并采用CLUMPP軟件進(jìn)行重復(fù)抽樣分析，最后采用Distruct1.1繪制遺傳結(jié)構(gòu)圖。

?結(jié)果與分析

引物多態(tài)性分析

通過(guò)9對(duì)SSR引物對(duì)91份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共檢測(cè)到73個(gè)等位基因位點(diǎn)（表3），各引物等位基因數(shù)量為5～11個(gè)，平均等位基因8個(gè)，最大基因頻率在0.313～0.703之間，平均基因多樣性為0.689，平均雜合度為0.578，多態(tài)信息

含量為0.453～0.792，平均值為0.659。其中Minμs04引物等位基因?yàn)?1，基因多樣性為0.811，雜合度為0.824，多態(tài)信息含量PIC為0.792，各參數(shù)值相對(duì)較大，說(shuō)明Minμs04具有較高的多態(tài)性，且雜合度較高，而多態(tài)性最小的MAC014基因多樣性為0.483，雜合度為0.374，PIC為0.453。表明9對(duì)引物具有較高的多態(tài)性，可用于進(jìn)一步研究澳洲堅(jiān)果遺傳多樣性。

?澳洲堅(jiān)果種質(zhì)聚類分析

將91份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)由9對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶用PowerMarker 3.25軟件以UPGMA法進(jìn)行聚類分析（圖1）。在遺傳距離為0.33處，可將91份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)分為2大類，第一大類包含所有粗殼種以及Nelmak1-1、Nelmak1-2、HAMC14，共19份種質(zhì)。其中粗殼種12與粗殼種14親緣關(guān)系很近，Nelmak1為南非選育的雜交品種，由于在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)種植園內(nèi)有2種不同基因型的種質(zhì)均命名為Nelmak1，所以本研究以Nelmak1- 1、Nelmak1-2標(biāo)記來(lái)區(qū)分，且HAMC14、Nelmak1-1、Nelmak1-2聚為一類，說(shuō)明三者親緣關(guān)系較近。第二大類包含72份種質(zhì)，主要為澳大利亞、夏威夷主要栽培品種以及國(guó)內(nèi)選育品種（品系），其中由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所選育的南亞系列和實(shí)選系列可明確其親緣關(guān)系較近的栽培種，可由此推斷其可能父母本。從聚類圖中可發(fā)現(xiàn)澳洲堅(jiān)果種質(zhì)并不是嚴(yán)格按照地理來(lái)源進(jìn)行分類，這說(shuō)明其親緣關(guān)系與地理來(lái)源可能無(wú)顯著相關(guān)性。

?澳洲堅(jiān)果種質(zhì)主成分分析

澳洲堅(jiān)果種質(zhì)親緣關(guān)系可通過(guò)主成分分析直

觀表現(xiàn)，種質(zhì)間位置遠(yuǎn)近代表其遺傳相似性，位置越近，親緣性越近，位置越遠(yuǎn)，遺傳差異越大。采用GenALEx軟件對(duì)91份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)進(jìn)行主成分分析，從圖2可以看出，來(lái)源于夏威夷、澳大利亞、中國(guó)的澳洲堅(jiān)果種質(zhì)之間存在交叉，說(shuō)明部分種質(zhì)親緣性較近。

?基于貝葉斯聚類法的遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于9對(duì)SSR引物獲得的多態(tài)性數(shù)據(jù)，使用Structure軟件中的貝葉斯聚類方法分析澳洲堅(jiān)果群體遺傳結(jié)構(gòu)。根據(jù)Delta 折線圖（圖3）所示，值為2時(shí)，Delta 最大，為278，即=2為最佳值，表明91份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可分為2大類群（圖4中紅色代表類群1，綠色代表類群2）。類群1主要包含夏威夷的19份種質(zhì)，中國(guó)44份種質(zhì)，澳大利亞10份資源，以及南非1份資源。澳大利亞16份種質(zhì)以及1份南非種質(zhì)為類群2，并且此類群主要為粗殼種種質(zhì)。根據(jù)各類群中主要顏色比率（值），將>0.6視為材料血緣比較單一，而<0.6表示材料具有混合來(lái)源，說(shuō)明供試澳洲堅(jiān)果種質(zhì)遺傳成分來(lái)源單一，遺傳結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單。

? 群體遺傳分化

由表4 -統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，澳洲堅(jiān)果種質(zhì)遺傳分化系數(shù)（）變幅范圍為0.035～0.299，平均值為0.168，群體內(nèi)近交系數(shù)（）變幅范圍為–0.214～0.370，均值為0.075，群體間近交系數(shù)（）為–0.171～0.550，均值為0.220，基因流（）均值為1.941，說(shuō)明91份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)具有較高的遺傳分化，且存在一定的基因交流。AMOVA分析結(jié)果表明，供試澳洲堅(jiān)果群體內(nèi)遺傳變異為90%，群體間遺傳變異為10%，表明澳洲堅(jiān)果群體內(nèi)遺傳變異顯著高于群體間變異。

?討論

遺傳多樣性的研究對(duì)于種質(zhì)資源的遺傳改良、雜交育種以及創(chuàng)新利用具有重要意義，SSR標(biāo)記在澳洲堅(jiān)果上的應(yīng)用，有助于了解澳洲堅(jiān)果種質(zhì)的遺傳多樣性以及親緣關(guān)系，對(duì)澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源進(jìn)一步挖掘與育種工作具有參考價(jià)值。NOCK等基于二代測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)了12對(duì)澳洲堅(jiān)果SSR分子標(biāo)記引物，在22個(gè)品種中，12對(duì)引物均具有多態(tài)性，平均觀察雜合度和期望雜合度分別為0.571和0.626，共檢測(cè)到71個(gè)等位基因，并且能很好地區(qū)分4種澳洲堅(jiān)果種質(zhì)、、以及。LANGDON等采用11對(duì)SSR引物對(duì)‘741’以及其他8個(gè)品種開(kāi)放授粉后代進(jìn)行父母本鑒定，指出不同品種澳洲堅(jiān)果自交能力存在顯著差異，并且澳大利亞種植最廣泛的2個(gè)品種‘741’與‘344’之間存在一定親緣關(guān)系。本研究采用9對(duì)SSR引物對(duì)91份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測(cè)出73個(gè)等位基因位點(diǎn)，基因多樣性均值為0.689，PIC變化范圍為0.453～0.792，平均0.659，說(shuō)明9對(duì)引物可較好地鑒別澳洲堅(jiān)果種質(zhì)的遺傳差異性。

本研究中91份澳洲堅(jiān)果材料的UPGMA聚類、PCA主成分分析、以及Structure遺傳結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果基本一致，且相互補(bǔ)充，采用的9對(duì)SSR引物將91份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)分為2個(gè)類群，聚類結(jié)果表明，不同來(lái)源地種質(zhì)聚集交錯(cuò)，與地理分布沒(méi)有顯著相關(guān)性，與譚秋錦等基于SNP分子標(biāo)記的澳洲堅(jiān)果種質(zhì)遺傳多樣性分析中具有相同結(jié)論。同時(shí)Structure結(jié)果表明，供試澳洲堅(jiān)果種質(zhì)遺傳成分來(lái)源單一，遺傳結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，在其他研究中具有相同報(bào)道。HARDNER等報(bào)道全球澳洲堅(jiān)果生產(chǎn)主要基于100年前夏威夷育種項(xiàng)目中優(yōu)良種質(zhì)的嫁接繁育，并且可能僅有一到三代來(lái)源于野生資源。NOCK等采用葉綠體基因組測(cè)序開(kāi)發(fā)了SNP，對(duì)37份野生資源以及26份主栽品種進(jìn)行親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)野生資源具有高水平的變異，但大部分夏威夷品種來(lái)源于位于昆士蘭東南部Moolo和Mt Bauple的2個(gè)野生地點(diǎn)，來(lái)源非常狹窄。

指數(shù)反映群體等位基因雜合性水平，用來(lái)衡量種群分化程度。本研究91份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)變化范圍為0.035～0.299，平均值為0.168，表明澳洲堅(jiān)果具有較高的遺傳分化。O’CONNOR等采用SNP對(duì)29個(gè)母本及295個(gè)子代進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性分析，在子代中檢測(cè)到高水平差異（=0.518）以及較大遺傳分化（= 0.401）。AMOVA分析結(jié)果表明澳洲堅(jiān)果群體間與群體內(nèi)均存在遺傳變異，但群體內(nèi)遺傳變異顯著高于群體間變異。

我國(guó)澳洲堅(jiān)果從20世紀(jì)80年代后期開(kāi)始商業(yè)性種植，經(jīng)過(guò)30多年發(fā)展，種植面積已居世界第一。目前我國(guó)已收集保存了較豐富的澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源，前期研究報(bào)道我國(guó)澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)較窄，大致分為夏威夷類群和澳大利亞類群，本研究中供試的我國(guó)澳洲堅(jiān)果種質(zhì)與夏威夷、澳大利亞主要栽培品種聚為一大類，除此之外，我國(guó)澳洲堅(jiān)果品種多由開(kāi)放授粉的實(shí)生后代選育，雜交育種進(jìn)展緩慢，對(duì)各種優(yōu)質(zhì)、高抗等優(yōu)良性狀種質(zhì)資源挖掘與利用、新種質(zhì)創(chuàng)制研究較弱。這說(shuō)明今后在澳洲堅(jiān)果選育中，應(yīng)該加大引進(jìn)優(yōu)異野生資源力度，增加種質(zhì)的遺傳多樣性，拓寬遺傳基礎(chǔ)。

本研究采用9對(duì)SSR引物對(duì)91份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析，初步明確了供試澳洲堅(jiān)果種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)，為澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源鑒定和創(chuàng)新利用提供數(shù)據(jù)支撐，并且對(duì)澳洲堅(jiān)果雜交育種以及優(yōu)良種質(zhì)創(chuàng)制具有重要的指導(dǎo)意義。

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18. 收稿日期 2021-05-10;修回日期 2021-07-06

    基金項(xiàng)目 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（No. 1630062020001）;農(nóng)業(yè)農(nóng)村部物種品種資源保護(hù)費(fèi)項(xiàng)目（No. 12516

    3006000160001）;國(guó)家熱帶果樹(shù)種質(zhì)資源圃平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)項(xiàng)目（No. 125163006000150007）。

    作者簡(jiǎn)介 井敏敏（1990—），女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：熱帶果樹(shù)種質(zhì)資源。*通信作者（Corresponding author）：

    陳晶晶（CHEN Jingjing），E-mail：chenjingjing0704@163.com。