鄭 烈 聞新麗 段盛蕾

（陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003）

內質網（ER）作為細胞內最大的膜網絡結構，具有完成蛋白質的合成及新生肽鏈的折疊、組裝和運輸?shù)墓δ?。腸上皮細胞受到病原微生物、炎性因子、缺血缺氧等多種應激因素后可引發(fā)內質網應激（ERS）［1-2］。有研究表明，ERS是潰瘍性結腸炎（UC）發(fā)病的主要原因，過度ERS會損傷腸黏膜屏障，釋放大量炎癥因子［3-4］。黃芪多糖是從中藥黃芪中分離提純的大分子化合物，具有抗氧化應激、增強免疫功能等藥理作用，可通過抑制腸上皮細胞發(fā)生ERS，減輕UC大鼠結腸黏膜的炎癥反應［5-6］。人結腸癌細胞系HT29細胞與IECs具有相類似的生物學特征且較為容易培養(yǎng)獲得，是國際公認的UC炎癥細胞模型［7-8］。目前，關于UC通過毒胡蘿卜素內酯（Tg）誘導人結腸癌系HT29細胞發(fā)生內質網應激引起細胞凋亡的報道較少。PERK/eIF2α通路是內質網應激途徑中最常見的細胞凋亡途徑［9］，是否通過PERK/eIF2α內質網應激在UC腸上皮細胞損害中發(fā)揮關鍵作用是值得研究的重要方向。因此，本研究探討黃芪多糖對Tg誘導HT29細胞蛋白激酶R樣內質網激酶（PERK）蛋白及p-eIF2α蛋白表達的影響，從而進一步為黃芪多糖治療UC提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 耗材與儀器 細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、凍存盒、凍存管（德國Eppendorf公司，產品貨號：3102S，11865S），Millipore過濾器（瑞典Medicago公司），精密分析天平儀器，TC20TM全自動細胞計數(shù)儀（美國BIO-RAD公司），OLYMPUS顯微鏡（IX71、BX53型）等。

1.2 主要試劑 McCoys 5A培養(yǎng)基（美國GIBCO公司，貨號：A1010）、DMSO（美國GIBCO公司，貨號：D7126）、胰蛋白酶（美國GIBCO公司，貨號：Y8925），引物合成（上海閃晶生物技術有限公司），BCA蛋白濃度試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，批號：P0015L）、RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0013B）等。黃芪多糖（批號：151209，純度＞75%，購買于上海融合生物科技有限公司），PBS tablets（瑞典Medicago公司），PERK、p-eIF2α抗體、二抗（抗兔）（美國Cell Signaling Technology，產品貨號：3709S ，11888S），CHOP mRNA表達檢測［天根生化科技（北京）有限公司］。

1.3 HT29細胞株培養(yǎng) 使用McCoys 5A完全培養(yǎng)液將HT29細胞培養(yǎng)在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)液中含有10%胎牛血清、100 U/L青-鏈霉素和2.5 mg/mL兩性霉素B，及時更換培養(yǎng)液和細胞傳代。

1.4 黃芪多糖溶液配制 稱取黃芪多糖干粉劑（天津賽諾制藥有限公司，國藥準字Z20040085）。DMSO溶解，過濾除菌器除菌，配制成1 mmol/L黃芪多糖溶液，然后稀釋為終質量濃度分別為1、10 μg/mL的黃芪多糖溶液。

1.5 HT29細胞處理與分組 細胞分組為1）空白細胞組：采用McCoys 5A完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，不用任何藥物干預。2）模型組：采用1 μmol/L Tg誘導HT29細胞建立內質網應激模型［2］。3）黃芪多糖低劑量組（1 μmol/L+Tg 1 μg/mL）。4）黃芪多糖高劑量組（1 μmol/L+Tg 10 μg/mL）。

1.6 Western blotting法檢測 HT29細胞 PERK、peIF2α、Caspase-3蛋白表達情況 HT-29通過1 μmol/L Tg誘導，給予不同劑量的黃芪多糖誘導24 h后，提取蛋白并定量分析。

1.7 Real-time PCR檢測CHOP mRNA表達 提取細胞總RNA，采用2-ΔΔCt法計算目的基因CHOP mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 6.0軟件作圖，數(shù)據(jù)分析采用SPSS23.0軟件。對符合正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗的數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。P＞0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Tg誘導HT29細胞在不同時間PERK及p-eIF2α蛋白的表達 見圖1，表2。HT29細胞采用McCoys 5A完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后用 Tg誘導，在 0、12、24、48 h時PERK及p-eIF2α蛋白質水平隨時間的延長呈依賴性增加（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 Tg誘導HT29細胞在不同時間PERK及p-eIF2α蛋白的表達比較（±s）

表2 Tg誘導HT29細胞在不同時間PERK及p-eIF2α蛋白的表達比較（±s）

注：與0 h比較，*P＜0.05；與12 h比較，**P＜0.05。下同。

時間0 h 12 h 24 h 48 h n 6 6 6 6 PERK/β-actin 0.03±0.01 0.07±0.02*1.01±0.13**1.34±0.36**p-eIF2α/β-actin 0.06±0.02 0.08±0.03*1.15±0.35**1.56±0.47**

2.2 各組HT29細胞CHOP mRNA表達比較 見表3。以β-actin為參照，與空白組比較，模型組CHOP mRNA表達明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪多糖低劑量組和黃芪多糖高劑量組CHOP mRNA表達均減少（P＜0.05）；與黃芪多糖低劑量組比較，黃芪多糖高劑量組CHOP mRNA表達減少（P＜0.05）。

表3 各組HT29細胞CHOP mRNA表達水平比較（±s）

表3 各組HT29細胞CHOP mRNA表達水平比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與黃芪多糖低劑量組比較，▲P＜0.05。下同。

組別空白組模型組黃芪多糖低劑量組黃芪多糖高劑量組n 6 6 6 6 CHOP mRNA 1.00±0.15 7.64±0.38*5.36±0.47△2.39±0.32▲

2.3 各組HT29細胞PERK和p-eIF2α蛋白表達比較見圖2，表4。與空白組比較，模型組PERK、p-eIF2α蛋白質表達明顯增加（P＜0.01），通過不同濃度黃芪多糖干預后，PERK、p-eIF2α蛋白質表達呈下降趨勢（P＜0.05或P＜0.01），且高劑量的黃芪多糖能顯著抑制PERK、p-eIF2α蛋白質表達（P＜0.05）。

表4 各組HT29細胞PERK和p-eIF2α蛋白表達水平比較（±s）

表4 各組HT29細胞PERK和p-eIF2α蛋白表達水平比較（±s）

注：與0 h比較，*P＜0.05；與12 h比較，**P＜0.05。下同。

時間空白組模型組黃芪多糖低劑量組黃芪多糖高劑量組n 6 6 6 6 PERK/β-actin 0.05±0.01 0.09±0.02*0.08±0.02△1.34±0.36**p-eIF2α/β-actin 0.02±0.01 0.05±0.01*0.04±0.02△1.56±0.47**

2.4 各組HT29細胞凋亡蛋白Caspase-3表達比較見表5。Tg誘導HT29細胞后明顯增加Caspase-3的凋亡（P＜0.01），給予不同劑量黃芪多糖干預后HT29細胞Caspase-3的凋亡率較模型組下降（P＜0.05或P＜0.01），且高劑量黃芪多糖明顯優(yōu)于低劑量組（P＜0.05）。

表5 各組HT29細胞凋亡蛋白Caspase-3表達比較（±s）

表5 各組HT29細胞凋亡蛋白Caspase-3表達比較（±s）

組別n Caspase-3空白組模型組黃芪多糖低劑量組黃芪多糖高劑量組6 6 6 6 1.00±0.24 35.78±5.56*21.45±2.38**11.68±1.79***

3 討 論

腸上皮細胞損傷是UC發(fā)病的主要原因。然而，內質網應激導致的腸上皮細胞損傷的確切分子機制尚不清楚。近年有研究表明［10-11］，內質網應激與UC發(fā)病關系密切，過度的內質網應激最終激活了腸上皮細胞的凋亡信號通路。前期研究表明［12］，Tg誘導HT29細胞后內質網結構發(fā)生明顯異常，內質網大小、形態(tài)不同，多表現(xiàn)為空泡狀結構，部分呈簇狀改變。由此推測，ERS可引起細胞凋亡，但是通過何種機制發(fā)生凋亡目前尚未明確闡明。

國外學者研究表明［13-14］，ERS及其介導的信號通路，進而激發(fā)促炎因子級聯(lián)釋放、細胞凋亡途徑及腸黏膜屏障功能障礙等病理生理變化，使腸黏膜受損，最終導致UC的發(fā)生發(fā)展。內質網應激時內質網腔內協(xié)助新生蛋白正確折疊的重要伴侶分子GRP78表達增加，與未折疊或錯誤蛋白結合，形成穩(wěn)定的復合物，GRP78為內質網應激的標志蛋白。隨著ERS持續(xù)嚴重時，內質網功能受損，可啟動內質網相關凋亡程序，導致細胞死亡［15］。CHOP作為一種轉錄因子，在非應激情況下，為低水平表達，當ERS時，可通過誘導CHOP高轉錄，進而促進細胞凋亡［16］。Caspase在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，當細胞發(fā)生凋亡時Caspase可以被蛋白酶裂解，形成活化的Caspase，促進細胞凋亡，其中Caspase-3與凋亡關系密切［17-18］。內質網應激對于維持腸道平衡發(fā)揮重要作用，通過干預內質網應激來治療潰瘍性結腸炎，是中醫(yī)藥治療UC的作用機制和治療靶位的途徑之一。黃芪多糖可以用來治療UC，但其能否抑制Tg 誘導IECs的ERS目前報道較少［19-21］，因此具有重要研究價值和意義。

本課題以Tg誘導HT29細胞模擬UC時腸上皮細胞（IECs）發(fā)生ERS過程。結果發(fā)現(xiàn)：發(fā)生ERS時，HT29細胞內PERK及p-eIF2α蛋白質水平隨時間的延長呈依賴性增加；而且細胞內CHOP mRNA的轉錄水平明顯增加，對細胞凋亡有促進作用。通過黃芪多糖干預后，黃芪多糖隨著劑量的增加PERK、p-eIF2α蛋白質表達呈下降趨勢，且凋亡蛋白Caspase-3的凋亡率也明顯下降，從而介導保護HT29細胞免于RES損傷，這可能是黃芪多糖治療UC的IECs的潛在機制，并可能成為新的治療靶點。

綜上所述，這是一項全新的以Tg誘導HT29細胞模擬UC時IECs發(fā)生ERS過程的體外細胞研究，Tg可通過激活內質網應激PERK/e IF2α凋亡信號通路誘導IECs凋亡，這對Tg誘導的HT29細胞凋亡的分子生物學機制提出新的見解和開辟了新的研究思路，對臨床醫(yī)師探索尋找治療UC的新藥物提供依據(jù)。