楊詩珍

上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司食品部, 上海 200233

氟苯尼考(Florfenicol)，又稱氟甲砜霉素，屬于酰胺醇類抗生素，對革蘭氏陰陽性及支原體細(xì)菌均有效。安全性及藥性比氯霉素及甲砜霉素效果好，由于氯霉素禁用于畜禽動物，因此其在中國和國外養(yǎng)殖業(yè)迅速大規(guī)模使用。隨著研發(fā)深入，發(fā)現(xiàn)氟苯尼考對胚胎產(chǎn)生毒性，畜禽在用藥后，出現(xiàn)厭食、腹瀉等身體不健康反應(yīng)；如養(yǎng)殖者不規(guī)范使用氟苯尼考，未嚴(yán)格遵循休藥期，會導(dǎo)致畜禽食品中殘留過高，直接危害到人類健康[1]。氟苯尼考在動物體內(nèi)的主要代謝標(biāo)志物是氟苯尼考胺，歐盟在2010年之前，已規(guī)定動物源性食品中氟苯尼考最大殘留限量，用氟苯尼考及氟苯尼考胺作為檢出物。我國于2019年在GB 31650—2019獸殘殘留限量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了氟苯尼考的最大殘留限量，其殘留標(biāo)志物用氟苯尼考與氟苯尼考胺之和表示。其中家禽的最大殘留量為100 μg/kg ～2 500 μg/kg,產(chǎn)蛋期禁用。

關(guān)于動物性食品中氟苯尼考?xì)埩舻臋z測標(biāo)準(zhǔn)比較多，也比較成熟[2]；但是關(guān)于氟苯尼考及氟苯尼考胺同時測定，只有一個行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[3]；文獻(xiàn)中有測試魚肉中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留的HPLC-MS/MS方法[4]，還有文獻(xiàn)關(guān)于雞蛋中的殘留用液相色譜法測試[5]。動物組織特別是雞肉和雞蛋為高蛋白、高油脂動物組織，很難通過較有效前處理手段將上機(jī)溶液凈化干凈；在儀器端，液相色譜選擇性較差，也難將目標(biāo)物和基質(zhì)中雜質(zhì)有效分離。針對復(fù)雜基質(zhì)樣品分析，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜就有比較明顯的優(yōu)勢；雞肉和雞蛋都是人民大眾主要的食物來源之一，因此，研究建立雞肉和雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺測定的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有重要意義。本方法建立同時測定雞肉和雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，乙腈提取，C18分散固相萃取劑凈化，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

HPLC-MS/MS：Waters TQ-S；色譜柱(Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm))；分析天平(Melter/Ms204S)；攪拌機(jī)(飛利浦)；冷凍離心機(jī)(Eppendorf/5810R)；超聲提取儀(上?？茖?dǎo))；氮吹儀(O-EVAP TM 112，美國)；渦旋混合器(KA)；高速分散均質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)；固相萃取裝置(Supelco)。

1.2 試劑及耗材

超純水(Millipore超純水系統(tǒng))；乙腈(HPLC級，Aocs)；甲醇(HPLC級，Aocs)；正己烷(HPLC級，Aocs)；氨水(GR)；氯化鈉(AR，上海國藥)；無水硫酸鈉，馬弗爐 550 ℃灼燒 2 h后，冷卻后密封保存使用；C18分散固相萃取劑。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

氟苯尼考(Florfenicol)，CAS：73231-34-2，分子式：C12H14Cl2FNO4S，分子量：358.2。

氯霉素-D5(ChloraMphenicol-D5)，CAS：202480-68-0，分子式：C11H7Cl2D5N2O5，分子量：328.1。

氟苯尼考胺(Florfenicol amine)，CAS：108656-33-3，分子式：C10H14FNO3S，分子量：375.2。

氟苯尼考胺-D3(Florfenicol-d3 Amine)，CAS：76639-93-5，分子式：C10H11D3FNO3S，分子量：250.3。以上標(biāo)準(zhǔn)品均購自Dr. E.公司。

1.4 試劑的配置

10%乙腈水溶液：量取 10 mL 乙腈，用水稀釋至 100 mL。

0.01%氨水溶液：量取 100 μL 氨水加入 1 L 超純水中，充分混勻。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

1.5.1儲備液(1 000 mg/L)：

分別準(zhǔn)確稱取氟苯尼考、氟苯尼考胺、氟苯尼考胺-D3 和氯霉素-D5 標(biāo)準(zhǔn)品 10.0 mg(按純度示值折算)，用甲醇溶解并定容至 10 mL，標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液質(zhì)量濃度均為 1 000 μg/mL。-20 ℃ 以下避光貯存，保存期為12個月。

1.5.2中間液(氟苯尼考10 μg/mL，氟苯尼考胺 100 μg/mL)：

分別準(zhǔn)確量取 100 μL 氟苯尼考和 1 000 μL氟苯尼考胺儲備液，用甲醇定容至10 mL，標(biāo)準(zhǔn)中間液濃度分別為氟苯尼考10 μg/mL，氟苯尼考胺 100 μg/mL，-20 ℃ 以下避光貯存，保存期為 6 個月。

1.5.3內(nèi)標(biāo)混合中間液(10 μg/mL)：

分別準(zhǔn)確量取 100 μL 氟苯尼考胺-D3 和氯霉素-D5 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇定容至10 mL，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液質(zhì)量濃度為 10 μg/mL，-20 ℃以下避光貯存，保存期為 6 個月。

1.5.4標(biāo)準(zhǔn)混合使用液(氟苯尼考 10 ng/mL，氟苯尼考胺100 ng/mL)：

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)混合中間液 100 μL，用 10%乙腈-水溶液定容至 100 mL，標(biāo)準(zhǔn)混合使用液濃度為氟苯尼考 10 ng/mL，氟苯尼考胺100 ng/mL，4 ℃貯存，保存期為一周。

1.5.5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)混合使用液(100 ng/mL)：

準(zhǔn)確吸取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)混合中間液 100 μL，用 10%乙腈-水溶液定容至 10 mL，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)混合使用液濃度為 100 ng/mL，4 ℃貯存，保存期為一周。

1.5.6標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制，見表1：

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

1.6 試樣的前處理

1.6.1提取

稱取經(jīng)過均質(zhì)的試樣 2.0 g(精確到 0.01 g)到50 mL聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入50 μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液，加1 mL水漩渦混勻，再加10 mL乙腈， 漩渦混合30 s，超聲提取10 min。10 000 r/min 離心 10 min(溫度低于5 ℃)。 上清液待轉(zhuǎn)移。

1.6.2凈化

再取一個15 mL 離心管，加入 250 mg,C18分散固相萃取劑和 2 g 無水硫酸鈉，移入1.6.1上清液 7 mL，振搖1 min，以12 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心 5 min，取上清液 5 mL 轉(zhuǎn)移至另一離心管中，在低流速氮氣下吹干，加入 0.5 mL 10%乙腈水溶液溶解殘渣，渦旋混合 1 min，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中， 加入 0.5 mL 正己烷，充分震蕩1 min，以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速 離心 5 min，棄去正己烷層。 吸取下層用于HPLC-MS-MS 測定。

1.7 HPLC-MS-MS分析條件

1.7.1HPLC條件

(a) 色譜柱： Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)； (b) 流動相：A相為0.01%氨水溶液，B相為乙腈； (c) 流速：0.35 mL/min； (d) 進(jìn)樣量：5 μL。

流動相梯度見表2。

表2 流動相

1.7.2質(zhì)譜條件

(a) 離子源：電噴霧ESI離子源； (b) 掃描方式：正離子和負(fù)模式掃描； (c) 檢測方式： SRM； (d) 電噴霧電壓：3 500 v； (e) 鞘氣：高純氮氣，5 psi； (f) 輔助氣：高純氬氣，5 psi； (g) 監(jiān)測離子對情況。

質(zhì)譜采集參數(shù)見表3。

表3 質(zhì)譜采集參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑及凈化方法的選擇

氟苯尼考極性極弱，不易溶于水，在有機(jī)溶劑中溶解性較強(qiáng)；氟苯尼考胺具有堿性，極易溶于水，水溶解后，可再溶于有機(jī)溶劑；在已有的國標(biāo)[2,3]中，使用乙酸乙酯提取氟苯尼考；用堿性乙酸乙酯提取氟苯尼考胺?？紤]到雞蛋的蛋白質(zhì)含量比較高，乙腈是一種比較好的沉淀蛋白的有機(jī)溶劑，并結(jié)合國標(biāo)中提取劑，本方法比較了乙酸乙酯、堿性乙酸乙酯及乙腈三種不同溶劑提取目標(biāo)物；實驗發(fā)現(xiàn)，雞蛋中加入乙腈提取，起到沉淀蛋白質(zhì)的作用，提高了凈化效果，減小基質(zhì)干擾，確保測試結(jié)果更準(zhǔn)確，回收率比較見表4。分析原因是雞肉和雞蛋中水分含量高，水和乙腈為互溶溶劑，可以保證了氟苯尼考胺的提取效率。本方法凈化方法區(qū)別于傳統(tǒng)獸殘檢測方法，現(xiàn)有的國標(biāo)或文獻(xiàn)中，獸殘檢測均采樣SPE柱凈化方式，但隨著農(nóng)殘Quechers方法的成熟應(yīng)用，大大節(jié)省凈化過程時間，同樣可以得到很好準(zhǔn)確度；所以，本方法嘗試了C18分散固相萃取劑凈化，實驗發(fā)現(xiàn)，分散固相萃取劑凈化效果好，基質(zhì)干擾小，前處理操作過程從4 h降至2 h，回收率和重現(xiàn)性同樣滿足GB/T 27404—2005的要求。

表4 不同溶劑提取，雞蛋和雞肉中氟苯尼考胺、氟苯尼考回收率比較

2.2 液相條件及質(zhì)譜條件的確定

2.2.1色譜條件的優(yōu)化

氟苯尼考為弱極性物質(zhì)，在C18柱上有較強(qiáng)的保留，色譜條件相對容易選擇；而氟苯尼考胺為堿性化合物，是極性比較強(qiáng)的化合物，在普通C18柱上基本沒有保留；對比不同品牌C18柱，基本是色譜柱死體積出峰，無保留，最終發(fā)現(xiàn)Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)對氟苯尼考胺有一定的保留，保留時間為2.26 min。選擇純水、乙腈作流動相時，發(fā)現(xiàn)氟苯尼考胺峰型不對稱，有拖尾現(xiàn)象，后在水相加入氨水，調(diào)整流動相的pH值，消除了氟苯尼考胺拖尾現(xiàn)象，得到比較對稱的峰型。為了更好地分離目標(biāo)物和樣品中的雜質(zhì)，此方法最終選擇0.01%氨水溶液和乙腈進(jìn)行梯度分析，樣品總的運行時間為8.5 min，讓雜質(zhì)能夠完全流出，避免對下一針樣品產(chǎn)生柱上污染。

2.2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

HPLC-MS-MS采樣的是電噴霧離子化(ESI)使化合物帶電，氟苯尼考為酸性化合物，采樣負(fù)模式電噴霧離子源；氟苯尼考胺含有氨基官能團(tuán)，選擇用正模式電噴霧離子源，進(jìn)行離子掃描。表3為確認(rèn)的質(zhì)譜采集參數(shù)；圖1為氟苯尼考胺、氟苯尼考及氟苯尼考胺-D3、氯霉素-D5的標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測模式離子描譜圖。

圖1 氟苯尼考胺、氟苯尼考及氟苯尼考胺-D3、氯霉素-D5的標(biāo)準(zhǔn)品MRM模式離子描譜圖

2.3 線性范圍

由于HPLC-MS/MS受基質(zhì)效應(yīng)，影響結(jié)果準(zhǔn)確定量，本文采樣氯霉素-D5和氟苯尼考胺-D3分別作為氟苯尼考和氟苯尼考胺內(nèi)標(biāo)物，分別配制氟苯尼考和氟苯尼考胺曲線濃度點，為0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL，和 1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL，利用MRM離子掃描方式，用定量離子的峰面積對質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸計算，氟苯尼考線在0.1μg/mL ～2.0 μg/mL 范圍，R2≥0.995，氟苯尼考胺線在1.0 μg/mL ～20.0 μg/mL范圍，R2≥0.995，線性關(guān)系均良好(見圖2)。

圖2 氟苯尼考胺、氟苯尼考的工作曲線

2.4 定量限、方法回收率和精密度

分別取雞肉、雞蛋空白基質(zhì)樣品，進(jìn)行添加回收率和精密度試驗，添加水平：氟苯尼考胺為0.5μg/kg、2.5 μg/kg和5.0 μg/kg，氟苯尼考為0.0 μg/kg、0.25μg/kg和0.5 μg/kg，添加后混合靜置，使標(biāo)準(zhǔn)溶液被樣品充分吸收，每個濃度水平進(jìn)行7次平行試驗，確定該方法的定量限、回收率和精密度。得氟苯尼考和氟苯尼考胺檢出限分別為0.05 μg/kg和 0.5 μg/kg；回收率在68.0%～90.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.6%～4.6%之間。雞肉和雞蛋加標(biāo)回收率和RSD見表5和表6，圖3為雞蛋空白樣品加標(biāo)的MRM模式離子描譜圖。

圖3 氟苯尼考胺、氟苯尼考及氟苯尼考胺-D3、氯霉素-D5雞蛋空白加標(biāo)多反應(yīng)監(jiān)測模式離子描譜圖

表5 雞蛋中氟苯尼考胺、氟苯尼考的標(biāo)樣添加量、加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

表6 雞肉中氟苯尼考胺、氟苯尼考的標(biāo)樣添加量、加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 方法的應(yīng)用

從市場分別采購雞肉和雞蛋樣本，20個雞肉樣本中有5個樣本氟苯尼考檢出，檢出含量在0.10 μg/kg～1.17 μg/kg之間，氟苯尼考胺均未檢出，均符合GB 31650—2019 食品中獸藥最大殘留限量。20個雞蛋樣本中，有1個樣本檢出氟苯尼考，檢出含量為0.08 μg/kg，不符合限量要求；雞蛋中氟苯尼考胺均未檢出。檢測結(jié)果見表7。

表7 20個雞肉和雞蛋樣本檢出結(jié)果統(tǒng)計表

3 結(jié)論

本方法采用乙腈溶液為目標(biāo)物提取劑，將C18分散固相萃取劑與LC/MS/MS技術(shù)相結(jié)合，建立了一種測定雞蛋和雞肉中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留同時測定的方法。該方法操作簡單有效，方法靈敏度滿足殘留限值要求，可適用于樣品的高通量測試。