湯 偉， 李佳欣， 王 悅， 張 軍, 3， 何增國

1.中國海洋大學醫(yī)藥學院，青島 266000；2.青島海洋生物醫(yī)藥研究院海洋微生物工程研發(fā)中心，青島 266000；3.青島百奧安泰生物科技有限公司，青島 266000

紅酵母是一類抗逆性強，廣泛存在于自然界中的腐生菌，其最顯著的特征之一是能夠合成天然的類胡蘿卜素。與化學合成相比，紅酵母生物合成的類胡蘿卜素是天然的、有機的；與藻類和絲狀真菌發(fā)酵相比，利用紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素生產(chǎn)周期短、環(huán)境友好、易于通過發(fā)酵工程放大，具有極高的應用價值和開發(fā)前景[1]。另外紅酵母蛋白、脂肪含量高，可以作為優(yōu)質(zhì)的單細胞蛋白，作為極具價值的飼料添加劑應用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。

紅酵母能夠提高動物免疫力，增強抗應激能力，紅酵母作為天然的微生態(tài)抗氧化劑，在動物養(yǎng)殖中的良好應用已初見端倪。在寶石鱸基礎(chǔ)飼料中添加膠紅酵母可以促進個體生長，提高魚體的抗氧化能力、減少自由基的損害等[2]。飼料中添加Rhodotorulasp. H26可促進幼參生長、增強消化酶活性、增加營養(yǎng)價值，并刺激幼參先天免疫系統(tǒng)[3]。在基礎(chǔ)餌料中添加膠紅酵母可以顯著提高刺參抗氧化酶的活性，這可能與膠紅酵母中含有豐富的抗氧化和免疫增強組分有關(guān)[4]。將貝萊斯芽孢桿菌和膠紅酵母的復合菌劑應用于大西洋鮭幼魚養(yǎng)殖，能顯著提高鮭魚血清中抗氧化酶類、谷胱甘肽、總抗氧化能力和免疫球蛋白M的含量，同時復合菌的使用還能有效調(diào)控大西洋鮭魚的免疫應答[5]。

盡管許多紅酵母菌株在動物實驗中的功效已被證實，但目前仍然只有紅法夫酵母(Phaffiarhodozyma)被列入《飼料添加劑品種目錄(2013)》中，因此開發(fā)我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新紅酵母菌種，對動物養(yǎng)殖及微生物產(chǎn)品和產(chǎn)業(yè)化升級起到積極的助力作用。課題組前期從黃海北部海域分離得到一株膠紅酵母CYJ03，已完成該菌的全基因組測序[6]，同時該菌株表現(xiàn)出極高的抗逆性，如耐受高濃度NaCl、葡萄糖、耐低溫等特性(數(shù)據(jù)未公開)，以及本實驗所提到的過氧化氫耐受性。為進一步挖掘菌株的應用潛力，我們系統(tǒng)地評價了CYJ03體外及體內(nèi)抗氧化活性，這些數(shù)據(jù)可以為將來對菌株的進一步開發(fā)利用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)CYJ03由本課題組分離自海洋，并保存于中國微生物菌種保藏管理委員會，菌種保藏號為CGMCC No.16302。

YPD液體培養(yǎng)基： 葡萄糖20 g/L， 蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，蒸餾水定容至1 L，pH自然，115 ℃滅菌20 min。

1.2 主要試劑和儀器

三氯乙酸、過氧化氫、鐵氰化鉀、水楊酸、鄰菲羅啉、二甲基亞砜等化學試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司；二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)購自源葉生物科技有限公司；BCA法微量蛋白檢測試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

酶標儀，美國BioTek Instruments；單排四層養(yǎng)殖單元，上海海圣生物實驗設(shè)備有限公司；全自動樣品快速研磨儀-24 L，上海凈信；高速冷凍離心機，Hitachi CR21N。

1.3 魚苗及飼料

魚苗：紅羅非魚，購買自廣州粵強豐水產(chǎn)養(yǎng)殖場。

基礎(chǔ)飼料主要原料組成：魚粉、豆粕、小麥粉、酵母水解物、甘油、豆油、磷酸氫二鈣、維生素及礦物質(zhì)預混合添加劑等。飼料產(chǎn)品成分見表1。

表1 飼料產(chǎn)品成分

1.4 體外抗氧化作用的研究

1.4.1樣品的制備

將CYJ03在YPD液體培養(yǎng)基中28 ℃、 180 r/min搖床培養(yǎng)48 h， 4 000 r/min離心15 min，得到發(fā)酵上清液；離心后的菌體沉淀用無菌去離子水洗滌3次，調(diào)整細胞濃度為1.0×108CFU/mL，獲得完整細胞；將菌體烘干，用 DMSO 進行色素提取，最終得到色素提取物。

1.4.2體外抗氧化指標的測定

過氧化氫耐受性試驗參照TANG W[7]的方法；還原力的測定參照茍體忠[8]的方法；DPPH·清除力測定參照LIN MY[9]的方法；·OH清除力測定參照GUTTERIDE CJM等[10]的方法；螯合亞鐵離子能力的測定參照張喬麗[11]的方法進行。

1.5 體內(nèi)抗氧化作用的研究

1.5.1羅非魚養(yǎng)殖及實驗分組

紅羅非魚先空腹放養(yǎng)1 d，基礎(chǔ)飼料飼喂適應環(huán)境7 d，隨后選擇體質(zhì)健康、規(guī)格大小一致、平均體重為5 g左右的紅羅非魚作為實驗對象，隨即將其分為4組，分別為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。每組三個重復，每缸10尾。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，低、中、高劑量組在基礎(chǔ)飼料中分別拌入0.5%、1%和2%的膠紅酵母CYJ03凍干粉(菌活為2.66×1010CFU/g)。投喂時間為8:30和16:30，每日投喂量以魚體重的2%～5%為準，每日2次。水溫控制在25 ℃～30 ℃左右，溶氧5 g/L以上，流水速度4 mL/s，共持續(xù)60 d。

1.5.2血清和肝臟樣品的制備

飼養(yǎng)周期結(jié)束后禁食1 d。將魚放在冰上冷卻數(shù)分鐘，使其麻痹，統(tǒng)計每缸魚的體重、數(shù)量。斷尾取血，血液靜置0.5 h，以4 000 r/min離心15 min，吸取上清液置于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。摘取肝臟，漂洗、除去雜質(zhì)、吸干水分、稱重，按1∶9加入緩沖液研磨，4 ℃、4 000 r/min 離心10 min，收集上清液置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3羅非魚生長性能的測定

飼養(yǎng)周期結(jié)束后計算羅非魚增重率(WG,%)=100×(Wt-W0)/W0；特定生長率 (SGR，%/d)=100×(lnWt-lnW0)/t；飼料系數(shù) (FCR)=FI/(Wt-W0)；肝體比 (HSI)=Wh/W。其中，W0為實驗開始時羅非魚平均體重(g)、Wt為實驗結(jié)束時羅非魚平均體重(g)、t為養(yǎng)殖時間(d) 、FI為實驗過程中攝食的飼料重量(g)、Wh為所取肝臟的重量(g)；W為所取肝臟的羅非魚體重(g)。

1.5.4體內(nèi)抗氧化指標的測定

T-AOC、CAT、SOD、GSH-Px 活性及 BCA 蛋白含量的測定參照南京建成試劑盒說明書操作。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 23(IBM公司，美國)進行單因素方差分析，利用鄧肯多重檢驗分析樣品間差異性，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠紅酵母CYJ03體外抗氧化活性

2.1.1過氧化氫耐受性

將膠紅酵母CYJ03在含有不同濃度H2O2條件下培養(yǎng)48 h，測定菌體的存活率，結(jié)果表明，在含有1 mmol/L和3 mmol/L H2O2時能夠促進菌體的生長。當H2O2濃度高于3 mmol/L時，菌體的相對存活率降低，菌體生長受到抑制；當H2O2濃度為11 mmol/L時仍有26.12%的存活率，13 mmol/L時存活率降至2.58%(圖1)，CYJ03對過氧化氫極強的耐受性在同類報道中極為少見。

圖1 膠紅酵母CYJ03在不同H2O2濃度下的存活特性

2.1.2CYJ03的還原力

樣品的還原力與抗氧化能力存在著一定的相關(guān)性，還原電位越高給出電子的能力就越強，其抗氧化活性可能就越強。本實驗利用鐵氰化鉀法研究了CYJ03三個組分的還原力(圖2-a)，其中以發(fā)酵上清液的還原力最高，色素提取物次之，完整細胞相對最弱，分別為0.26±0.02、0.22±0.01、0.13±0.01。

2.1.3CYJ03的DPPH·清除能力

DPPH·是一種人工合成的具有單電子的有機自由基，可以與具有還原性的自由基進行單電子配對，溶液的褪色程度與單電子配對數(shù)呈現(xiàn)一定關(guān)系，因而DPPH·清除能力的測定被廣泛應用于抗氧化劑的抗氧化能力評價。CYJ03的三個組分均有一定的DPPH·清除作用，以發(fā)酵上清液的清除力最強可達92.92%，完整細胞和色素提取物的分別為56.79%和9.29%(圖2-b)。

2.1.4CYJ03的·OH清除能力

·OH是生物分子與過渡金屬離子參與芬頓反應造成的氧化損傷所產(chǎn)生的，抗氧化劑能夠螯合過渡金屬離子從而抑制·OH的生成，因此可以通過對·OH的清除率來反映抗氧化能力強弱。膠紅酵母CYJ03各組分都具有一定的·OH清除能力，清除力在30%～45%之間，·OH清除力大小依次為色素提取物>完整細胞>發(fā)酵上清液(圖2-c)。

2.1.5CYJ03對Fe2+的螯合能力

金屬離子的螯合能力被認為是研究抗氧化活性的指標之一，由于抗氧化物質(zhì)能夠降低脂質(zhì)過氧化反應中過渡金屬離子的濃度。在過渡金屬離子中，由于具有較高的活性，因此 Fe2+被認為是最重要的脂質(zhì)氧化助氧化劑。因此本試驗對CYJ03的Fe2+螯合能力進行了研究。發(fā)酵上清液的 Fe2+的螯合率最大，達到 83.81%，顯著高于完整細胞和色素提取物對Fe2+的螯合率(P<0.05)(圖2-d)。

(a)：還原力；(b)：DPPH·的清除率；(c)：·OH的清除率；(d)：Fe2+螯合率

除卻還原力，從各組分體外抗氧化數(shù)據(jù)中我們還可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵上清液和完整細胞對于DPPH·、·OH的清除力以及Fe2+的螯合能力表現(xiàn)出相同的規(guī)律，即DPPH·的清除率>Fe2+螯合率>·OH的清除率，而色素提取物則恰恰表現(xiàn)出相反的結(jié)果，即·OH的清除率>Fe2+螯合率>DPPH·的清除率。

2.2 膠紅酵母CYJ03體內(nèi)抗氧化活性

2.2.1CYJ03對羅非魚生長性能的影響

如表2所示，低、中、高3個實驗組在實驗結(jié)束后羅非魚的均重、增重率、特定生長率和肝體比均顯著高于對照組，其中以中劑量組最顯著(P<0.05)；三個實驗組的餌料系數(shù)均顯著低于對照組(P<0.05)，其中以中劑量組的飼料系數(shù)最低，達到1.67±0.17。從以上結(jié)果可以看出，飼料中添加1%的CYJ03可以有效提高羅非魚的體重、增重率、特定生長率及肝體比，降低其餌料系數(shù)。

表2 CYJ03不同添加量對羅非魚生長性能的影響

2.2.2CYJ03對羅非魚血清和肝臟組織中總抗氧化能力及抗氧化酶活性的影響

T-AOC反映了非酶作用的抗氧化防御能力，與對照組相比，中劑量組血清和肝臟組織中的T-AOC均顯著高于對照組(P<0.05)，見圖3-a。同時，在羅非魚血清和肝臟中的三種抗氧化酶(CAT、SOD和GSH-Px)活性也被檢測，添加膠紅酵母CYJ03能夠不同程度的提高羅非魚血清和肝臟中的抗氧化酶活性，且中劑量組最顯著；隨著添加量的增高，其抗氧化水平并非成上升趨勢，當添加量高于1%時，T-AOC及抗氧化酶活性都有所降低，這與生長性能的變化趨勢相一致(圖3-b、圖3-c和圖3-d)。

(a)：血清和肝臟中T-AOC活力；(b)：血清和肝臟中CAT活性；(c)：血清和肝臟中SOD活性；(d)：血清和肝臟中GSH-Px活性

3 討論

對過氧化氫的耐受性是衡量細胞抗氧化活性的重要指標。酵母細胞受H2O2刺激后，胞內(nèi)自由基含量上升，攻擊多種細胞組分導致細胞失活。高抗氧化活性酵母通過自身代謝調(diào)整胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，提高抗氧化性能，降低自由基積累量，避免細胞凋亡。李磊等[12]用不同濃度的H2O2處理啤酒酵母(Saccharomycespastorianus) Pilsner 1 h，當H2O2濃度達10 mmol/L、12 mmol/L時，致死率分別為98.90%和99.35%。通過本研究發(fā)現(xiàn)，膠紅酵母CYJ03具有極強的過氧化氫耐受性，在H2O2濃度為11 mmol/L時仍有26.12%的存活率，13 mmol/L時尚有2.58%存活率。

前期我們通過對膠紅酵母 CYJ03全基因組測序分析，發(fā)現(xiàn)菌株可代謝產(chǎn)生多種類胡蘿卜素，如八氫番茄紅素、鏈孢紅素、番茄紅素、γ-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和紅酵母烯等[6]。眾所周知，類胡蘿卜素具有優(yōu)良的抗氧化活性，能有效清除自由基。李慧翔[20]從法夫酵母中純化得到的蝦青素對DPPH·、·OH、ABTS+3種自由基都表現(xiàn)出極好的清除能力，EC50值分別為22.40 μg/mL、12.62 μg/mL、5.75 μg/mL。本課題組也研究了來源不同的6株紅酵母的色素提取物均有不同程度的還原力、DPPH·清除力、·OH清除力和Fe2+螯合力[21]。YOO AY等[22]利用甲醇法從膠紅酵母中提取的類胡蘿卜素，發(fā)現(xiàn)其對不同的自由基清除能力存在差異，這可能是由于類胡蘿卜素中所含的羧基、胺或磺酰的碳水化合物會靶向不同的自由基[23]。

此外，CYJ03完整細胞也具有較高的抗氧化活性，一方面可能是由于細胞表面的活性物質(zhì)對自由基的清除作用，從而阻止其進入到細胞內(nèi)部。如酵母細胞壁多糖的主要活性成分是β-葡聚糖和甘露聚糖，利用其結(jié)構(gòu)與Fe2+螯合，抑制·OH的產(chǎn)生以及防止脂質(zhì)過氧化連鎖反應等，提高抗氧化能力[24]。另一方面酵母胞內(nèi)的抗氧化酶類如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱苷肽還原酶及硫氧還蛋白還原酶等，和非酶物質(zhì)如谷胱甘肽、硫氧還蛋白、谷氧還蛋白、金屬硫蛋白、維生素C、維生素E等對進入到細胞內(nèi)部的自由基進行清除，從而起到抗氧化作用，阻止對酵母細胞進一步的氧化損傷[25]。綜上，膠紅酵母CYJ03無論是發(fā)酵上清液，還是細胞內(nèi)類胡蘿卜素，又或者是細胞本身，都具有良好的體外抗氧化活性，這充分顯示出CYJ03全細胞發(fā)酵物本身具有開發(fā)成抗氧化產(chǎn)品的潛力。

與此同時，我們在飼料中添加CYJ03飼喂羅非魚，研究菌株在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)的抗氧化作用。目前應用紅酵母改善水生生物的生長狀況、抗氧化活性及免疫活性的相關(guān)研究已有報道。紅酵母可以改善幼參及尼羅羅非魚的生長情況、消化酶活性及免疫活性[26,27]。WANG JH等[28]在刺身幼體飼料中添加105CFU/g、106CFU/g、107CFU/g的R.benthicaD30，結(jié)果發(fā)現(xiàn) D30 可顯著提高海參的生長速度 (P<0.05) 、降低海參的累積死亡率、提高免疫力。YANG SP等[29]為凡納濱對蝦飼喂三種日糧，包括對照日糧，添加1%干紅冬孢酵母的日糧和含108CFU/g活紅冬孢酵母的日糧，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加活酵母的試驗組其 T-AOC、CAT、SOD、GSH-PX 活性均高于添加干酵母的試驗組，說明活菌中可能存在某些物質(zhì)，可以增強抗氧化酶活性。董蘭芳等[30]研究了酵母水解物對吉富羅非魚生長、免疫力、抗氧化性及抗無乳鏈球菌感染的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吉富羅非魚的免疫酶和抗氧化酶(CAT和SOD)活性均隨飼料中酵母水解物添加量的增加而顯著提高，在添加量為1.5%時達到最大值，而后出現(xiàn)一定的降低，過量添加酵母水解物并不能強化已處于正常狀態(tài)的免疫系統(tǒng)。這與本研究的結(jié)果相一致。本研究中膠紅酵母CYJ03能顯著提高羅非魚的增重率、特定生長率和肝體比，顯著降低飼料系數(shù)；同時能夠顯著提高羅非魚血清和肝臟的總抗氧化能力以及抗氧化酶的活性，且以中劑量組最為顯著。

4 結(jié)論

海洋源膠紅酵母CYJ03具有極強的過氧化氫耐受性，并且其發(fā)酵上清液、完整細胞和色素提取物均具有一定程度的還原力、DPPH·清除力、·OH清除力和Fe2+螯合能力。在日糧中添加CYJ03能夠提高羅非魚的生長性能，降低飼料系數(shù)，并能提高血清和肝臟中T-AOC、SOD、CAT和 GSH-Px的活性，添加量為1%時效果最顯著。海洋源膠紅酵母CYJ03具有開發(fā)成產(chǎn)品的良好潛力。