王 楠， 章涵鈺， 樓 博， 王 偉， 史學波

（1 浙江樹人學院生物與環(huán)境工程學院 杭州310015 2 浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準化研究所 杭州310021 3 浙江中得農(nóng)業(yè)集團有限公司 杭州310021）

非酶糖基化 （Non-enzymatic gluco-sylation，NEG）是一系列復雜的非酶促反應(yīng)，是蛋白質(zhì)-還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)的第1 步，形成席夫堿和Amadori 等可逆的產(chǎn)物，經(jīng)過氧化、重排、交聯(lián)等過程， 最終形成不可逆的晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced glycation end products， AGEs）。 AGEs 不僅在加工食品中廣泛存在， 在人體內(nèi)由于還原糖類羰基化合物和蛋白類氨基化合物的存在也進行非酶糖基化反應(yīng)。 國內(nèi)外研究證實AGEs 對人體有影響，能導致糖尿病并發(fā)癥視網(wǎng)膜病變（DR）[1]、動脈糊樣硬化[2]、組織老化[3]。 AGEs 形成機制的復雜性給AGEs 抑制劑的研究帶來很多困難。 AGEs在形成過程中經(jīng)歷氧化過程， 提示抗氧化劑可能對AGEs 的形成有抑制作用。 目前， 對食源性AGEs 抑制劑的研究尚處于起步階段。有研究證實天然酚類物質(zhì)具有顯著的抗糖基化能力， 能有效抑制AGEs 的生成，對許多AGEs 有關(guān)疾病起到一定預防和治療功效[4]。Ferchichi 等[5]研究證實：從金絲桃科和葉綠素科分級分離的多酚對AGEs 有抑制作用， 對預防微血管疾病及其并發(fā)癥有一定潛力。

近年來， 抗氧化肽成為國內(nèi)外研究最多的生物活性肽之一。 目前有大豆、玉米、乳清、魚、貽貝和蝦等多種抗氧化肽[6]。本研究在建立體外非酶糖基化模擬體系的基礎(chǔ)上， 在反應(yīng)體系中添加抗氧化肽，探究抗氧化肽對AGEs 的影響作用，為為拓展抗氧化肽的新用途提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甲魚，市售；D-葡萄糖、肌肽，上海滬試實驗室器材股份有限公司；標準牛血清白蛋白（BSA）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、硝基四氮唑藍（NBT）（100 mg 溶 于0.1 mol/L pH=10.8 的碳酸鹽緩沖液），SIGMA 公司； 注射用青霉素鈉、 硫酸鏈霉素（雙抗），Solarbio 公司；其它試劑均為分析純級；試驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-124 型紫外-可見分光光度計， 島津有限公司；F-7000 熒光分光光度計，日立高新技術(shù)公司；TENSOR27 型傅里葉變換紅外光譜儀，德國布魯克公司；PHS-3C pH 計， 杭州奧立龍儀器有限公司；Biofuge Prino R 型臺式高速冷凍離心機，德國賀利氏公司；FD-1D-50 型冷凍干燥機，北京醫(yī)康實驗儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 甲魚抗氧化肽的制備 甲魚抗氧化肽按以下流程制備： 甲魚宰殺→去脂→脫殼→蛋白酶酶解→滅酶（90 ℃，15 min）→離心過濾（4 000 r/min，10 min）→保存、備用。

1.3.2 甲魚抗氧化肽分子質(zhì)量的測定 參考國家標準GB/T 22492-2008《大豆肽粉》的方法測定肽的相對分子質(zhì)量分布[7]。

1.3.3 DPPH·清除能力的測定 DPPH·清除率測定參考Umayaparvathi 等[8]的研究方法，取0.1 mL蛋白酶解液， 加入2.8 mL 1×10-4mol/L DPPH·無水乙醇溶液，混勻后在室溫下避光反應(yīng)20 min，并在4 000 r/min 下離心10 min， 取上清液在波長517 nm 處測定吸光度，空白組以等體積無水乙醇溶液代替DPPH·溶液，對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液， 并以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液空白調(diào)零。 清除率（I）按下式計算：

式中，A0——對照組吸光度；Ai——樣品組吸光度；A——空白組吸光度。

1.3.4 體外蛋白質(zhì)-還原糖糖基化體系建立 參考張麗娜等[9]、李軍等[10]和吳光杰等[11]的研究方法建立蛋白質(zhì)-還原糖體系。 無菌條件下，在稀釋后的PBS 溶液中加入BSA、D-葡萄糖、EDTA、 青霉素鈉、 硫酸鏈霉素， 使各組分終含量為EDTA 8 μmol/L、雙抗100 U/mL、BSA 20 mg/mL、D-葡萄糖80 μmol/L。 在上述配置好的溶液中加入甲魚抗氧化肽，配置成質(zhì)量濃度為0.25，0.50，0.75，1.00 mg/mL 的溶液。 同時以肌肽作為陽性對照。 保鮮膜覆蓋，在37 ℃生化培養(yǎng)箱中避光溫孵，溫孵時間分別為3，7，14，21，28 d。 分別設(shè)不加樣品組a；不加D-葡萄糖、不加樣品組b；不加BSA、不加樣品組c； 不加BSA 組d； 不加D-葡萄糖組e，5 組對照組。 試驗設(shè)3 個平行。

分別取NEG 反應(yīng)體系反應(yīng)的第3，7，14，21，28 天時各組的反應(yīng)液0.1 mL，加入4 mL NBT，37℃溫孵15 min 后， 立即加入15%乙酸0.1 mL，并于冰水浴中終止反應(yīng)，于波長530 nm 處測定其吸光值A(chǔ)， 甲魚抗氧化肽對NEG 反應(yīng)的抑制率（IRNEG）按式（2）計算：

分別取AGEs 生成反應(yīng)體系反應(yīng)的第3，7，14，21，28 天時各組的反應(yīng)液1 mL，檢測其熒光值F，檢測條件為：激發(fā)波長370 nm、發(fā)射波長440 nm、狹縫5 mm。 甲魚抗氧化肽對AGEs 生成的抑制率（IRAGEs）按式（3）計算：

1.3.5 紅外光譜分析 樣品冷凍干燥后將樣品與干燥的KBr（質(zhì)量比1∶100）混合置于瑪瑙研缽中，研磨均勻后的粉末壓制成片，光譜范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)32 次。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 本試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示（±s），用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件分析。 單因素方差分析檢驗，以P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶制備甲魚抗氧化肽的DPPH·清除率

由表1 可知，4 種蛋白酶分別以最佳的酶解條件酶解甲魚蛋白4 h 時， 中性蛋白酶酶解后的酶解液DPPH·清除率最高，達（76.45±3.16）%，明顯優(yōu)于其它3 種酶， 故選用中性蛋白酶酶解甲魚蛋白制備甲魚抗氧化肽。

表1 不同蛋白酶制備甲魚抗氧化肽的DPPH·清除率Table 1 DPPH·clearance of turtle antioxidant peptides prepared by different proteases

2.2 甲魚抗氧化肽分子質(zhì)量分布

由圖1 可知， 甲魚抗氧化肽的相對分子質(zhì)量在1 000 u 以上的占總組分的30.32%； 相對分子質(zhì)量在1 000～200 u 范圍占總組分的63.23%；相對分子質(zhì)量在200～128 u 范圍占總組分的4.24%；相對分子質(zhì)量在128 u 以下的占總組分的2.21%，甲魚抗氧化肽分子質(zhì)量主要分布在1 000～200 u。Zhong 等[12]報道分子質(zhì)量＜1 ku 的鰱魚加工副產(chǎn)品蛋白質(zhì)肽SCPH-V 具有較高的DPPH·清除率。 張東杰等[13]的研究表明，分子質(zhì)量在156～1 439 u 范圍的小分子肽具有較高的抗氧化活性。 李桂峰等[14]的研究表明，用木瓜蛋白酶水解雙孢菇蛋白質(zhì)制得的600～2 600 u 之間的肽具有很好的·OH清除率以及較好的O2-·清除率。 Mendis 等[15]和莊永亮等[16]認為肽類物質(zhì)的相對分子質(zhì)量低于3 000 u 時具有良好的抗氧化性。 Alemán 等[17]的研究表明分子質(zhì)量在500～1 400 u 范圍的魷魚膠原蛋白酶解物具有較好的抗氧化活性。 本試驗研究結(jié)果與以上文獻報道結(jié)果一致， 即具有較高抗氧化活性的肽的相對分子質(zhì)量相對較小。

圖1 甲魚抗氧化肽高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of turtle antioxidant peptides

2.3 甲魚抗氧化肽對蛋白質(zhì)-還原糖糖基化體系的影響

2.3.1 甲魚抗氧化肽對NEG 反應(yīng)的影響 如圖2所示，在糖基化的開始階段，隨著甲魚抗氧化肽和肌肽質(zhì)量濃度的增加，NEG 的抑制率也增加，并呈正相關(guān)。隨著處理時間的延長，相同質(zhì)量濃度的肌肽和甲魚抗氧化肽對NEG 反應(yīng)的抑制率呈先升高后降低的趨勢，說明當反應(yīng)到28 d 時底物可能已基本消耗完。當肌肽質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL、溫孵7 d 時，對NEG 反應(yīng)的抑制率達76.17%，然而從第7 天開始， 肌肽對糖基化反應(yīng)體系產(chǎn)生的NEG 反應(yīng)的抑制率明顯降低，波動較大。

圖2 甲魚抗氧化肽和肌肽對NEG 反應(yīng)的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of turtle antioxidant peptides and carnosines on NEG

各質(zhì)量濃度的甲魚抗氧化肽對糖基化反應(yīng)的各個階段的NEG 反應(yīng)抑制率都維持在較高水平，波動較小。甲魚抗氧化肽質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL、溫孵時間為21 d 時， 對NEG 反應(yīng)的抑制率達到68.79%。

2.3.2 甲魚抗氧化肽對蛋白質(zhì)-還原糖糖基化終產(chǎn)物AGEs 的影響 如圖3 所示， 隨著甲魚抗氧化肽和陽性對照肌肽質(zhì)量濃度的增加， 二者對蛋白質(zhì)-還原糖糖基化終產(chǎn)物AGEs 生成的抑制率逐漸增加。隨著處理時間的延長，相同質(zhì)量濃度的甲魚抗氧化肽和肌肽對AGEs 的抑制率逐漸增加，說明甲魚抗氧化肽和肌肽對蛋白質(zhì)-還原糖糖基化終產(chǎn)物AGEs 的抑制率均具有時間和劑量依賴性，且均呈正相關(guān)。

圖3 甲魚抗氧化肽和肌肽對AGEs 生成的抑制率Fig.3 Turtle antioxidative peptides and carnosine inhibit the production of AGEs

在相同質(zhì)量濃度條件下， 甲魚抗氧化肽對AGEs 的抑制作用強于肌肽。 當溫孵28 d 時，1.00 mg/mL 的甲魚抗氧化肽， 對AGEs 的抑制率達89.35%。

2.3.3 抗氧化肽對蛋白質(zhì)-還原糖體系的影響為進一步探究甲魚抗氧化肽對AGEs 抑制的作用機理，采用紅外光譜分析甲魚抗氧化肽對蛋白質(zhì)-還原糖體系的影響。

如圖4 所示，535 cm-1左右的不飽和鍵的震動峰發(fā)生了藍移， 說明反應(yīng)體系生成了新的不飽和鍵，即產(chǎn)生了美拉德反應(yīng)初期產(chǎn)物——Amadori 產(chǎn)物。 1 000 cm-1處的峰是由糖的O-H 和C-C 鍵的伸縮振動產(chǎn)生的[18]，隨著反應(yīng)時間的延長，蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化作用越發(fā)明顯。 3 500～3 100 cm-1范圍的吸收峰強度的改變，是由O-H 伸縮振動和游離N-H 的伸縮振動所引起的，隨著反應(yīng)時間延長，峰的寬度明顯增強， 可能與糖基化反應(yīng)過程中席夫堿的形成有關(guān)。隨著反應(yīng)時間的進一步延長，峰值也有相應(yīng)減弱，說明美拉德反應(yīng)進入中后期。

紅外光譜中酰胺Ⅰ區(qū)、 酰胺Ⅱ區(qū)和酰胺Ⅲ區(qū)可以用于分析蛋白質(zhì)的特殊結(jié)構(gòu)， 酰胺Ⅰ區(qū)與蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。1 650 cm-1左右是酰胺Ⅰ區(qū)的特征吸收峰， 主要是由α-螺旋中肽鏈的C=O 伸縮振動所引起；1 550 cm-1左右是酰胺Ⅱ區(qū)，1 400～1 200 cm-1范圍是酰胺Ⅲ區(qū)， 由C-N 的伸縮振動和N-H 的彎曲振動產(chǎn)生[14]。 圖4 可以看出，隨著糖基化反應(yīng)時間的增強，酰胺Ⅰ區(qū)、酰胺Ⅱ區(qū)和酰胺Ⅲ區(qū)的峰有先變大再變小再變大的趨勢，表明周圍的基團聚合數(shù)量的改變。 蛋白質(zhì)-還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)的反應(yīng)初期， 氨基與羥基發(fā)生脫水縮合、分子重排生成果糖胺，導致酰胺吸收峰增強；反應(yīng)中期，糖胺烯醇化生成醛酮類物質(zhì)，酰胺吸收峰值減??；反應(yīng)后期，蛋白質(zhì)氨基酸與羰基化合物發(fā)生脫羧、脫氨，酰胺吸收帶峰值增強。

圖4 空白組糖基化反應(yīng)體系反應(yīng)不同時間的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectral diagram of glycosylation reaction system of blank group at different reaction times

圖5 為0.50 mg/mL 肌肽處理組不同反應(yīng)時間的糖基化產(chǎn)物紅外光譜圖，與空白對照組相比，相同溫孵時間的肌肽處理組1 000 cm-1處的峰有所減弱。 圖6 為0.50 mg/mL 甲魚抗氧化肽處理組不同反應(yīng)時間的糖基化產(chǎn)物紅外光譜圖， 與對空白照組和肌肽組相比， 相同溫孵時間的甲魚抗氧化肽處理組1 000 cm-1處的峰明顯減弱。圖6 中甲魚抗氧化肽處理28 d 的糖基化產(chǎn)物紅外光譜圖中，紅外光譜中酰胺Ⅰ區(qū)、酰胺Ⅱ區(qū)和酰胺Ⅲ區(qū)的振動產(chǎn)生明顯降低，進一步證明，甲魚抗氧化肽通過降低糖基化反應(yīng)程度，來抑制非酶糖基化反應(yīng)。

圖5 反應(yīng)不同時間肌肽處理組糖基化產(chǎn)物的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrum of glycosylation products in the group treated with carnosine at different reaction times

圖6 反應(yīng)不同時間甲魚抗氧化肽處理組糖基化產(chǎn)物的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of the glycosylation products in the turtle antioxidant peptide treatment group at different reaction times

3 結(jié)論

本試驗研究了甲魚抗氧化肽對蛋白質(zhì)-還原糖體系NEG 和AGEs 產(chǎn)生的抑制作用。 研究結(jié)果表明，隨著甲魚抗氧化肽質(zhì)量濃度的增加，對非酶糖基化反應(yīng)各個階段的抑制作用均呈正相關(guān)。 蛋白質(zhì)-還原糖體系反應(yīng)21 d 時，1.00 mg/mL 甲魚抗氧化肽對NEG 的抑制率達68.79%。 甲魚抗氧化肽對AGEs 的抑制作用， 與甲魚抗氧化肽的質(zhì)量濃度和體系反應(yīng)時間均呈正相關(guān)。 甲魚抗氧化肽對AGEs 的抑制作用優(yōu)于陽性對照肌肽。 當甲魚抗氧化肽質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL 時， 對AGEs的抑制率達89.35%。 紅外光譜結(jié)果表明，甲魚抗氧化肽通過降低糖基化反應(yīng)程度來抑制非酶糖基化反應(yīng)。 本研究為降低AGEs 的形成提供了理論依據(jù)和新思路， 研究結(jié)果為拓展甲魚抗氧化肽在食品加工領(lǐng)域的新用途提供了數(shù)據(jù)支持， 為控制AGEs 產(chǎn)生， 提高食品的安全品質(zhì)提供了科學依據(jù)。