◎ 歐秋月，李瑞源，何麗芳,，胡孟姣，陸文燕

（1.衡陽師范學院南岳學院生命科學系，湖南 衡陽 421008；2.衡陽師范學院生命科學與環(huán)境學院，南岳山區(qū)生物資源保護與利用湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421008）

食品要長時間保存需要防腐劑，但如今使用的防腐劑以人工合成的占多數(shù)，長期攝入對人體不利[1-2]。近年來，國內(nèi)外學者對植物源天然食品防腐劑的研究較多，許多中草藥和植物提取物具有廣譜的抑菌活性，并作為天然防腐劑應用在某些食品中[3]。黃酮類化合物是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，其主要存在于能進行光合作用的植物細胞中，有良好的抗氧化、抗菌、抗癌等藥理活性[4-6]。闞玉紅等[7]分離純化了胭脂紅番石榴葉中的總黃酮，發(fā)現(xiàn)番石榴葉黃酮提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有較強的抑制作用。丘苑新等[8]提取了柚樹葉總黃酮，發(fā)現(xiàn)柚樹葉黃酮提取液總還原力比同等質(zhì)量濃度抗壞血酸的總還原力要高。此外，柚樹葉黃酮對大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均具有抑制作用。

龍須草又名野席草、馬棕根，為燈心草科多年生宿根草本植物，常生于溪渠、濕地、沼澤、河灘等地區(qū)，具有清熱安神、利尿通淋的效果，是一種民間傳統(tǒng)中藥材。目前，國內(nèi)外對龍須草的研究主要是其生境特點、栽培條件和水土維系效益等方面[9-11]，對其組成成分的探究則鮮有報導，有研究表明龍須草中含有香草醛、豆甾醇、菲類和黃酮類物質(zhì)，但未探討其抑菌效果[12-14]。

本實驗以龍須草為材料，采用微波法和酶法相結合提取龍須草根中的總黃酮，探究龍須草根部總黃酮對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的最低抑菌濃度，并探討pH值、紫外線和常見金屬離子對龍須草根部總黃酮抑菌效果的影響，以期為龍須草根部總黃酮作為天然防腐劑的研發(fā)運用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生龍須草（產(chǎn)自福建三明）；金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌（南岳山區(qū)生物資源保護與利用湖南省重點實驗室提供）；纖維素酶（10 000 U·g-1），購自上海藍季生物公司；無水乙醇、蛋白胨、氯化鈉、酵母浸粉、蒸餾水、檸檬酸、氫氧化鈉、瓊脂、鹽酸和葡萄糖，均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA1204B電子天平，上海精科天美科學儀器有限公司；SX500高溫滅菌鍋，Tomy Digital Biology；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DHG-9040A新型電熱恒溫鼓風干燥箱，寧波江南儀器廠；SPX智能生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；ZQWY-200N振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；DC801真空冷凍干燥機，Yamato Scientific；VS-840-2超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；DW-86L416超低溫冰箱，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；TDL-40B臺式離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 龍須草根部總黃酮提取液的制備及含量測定

20 g龍須草根部粉末用2%的纖維素酶處理后，與60%的乙醇按照料液比1∶20（g∶mL），在中低火下微波提取60 s，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)定容至50 mL。

采用文獻[14]的方法進行蘆丁標準曲線的繪制和龍須草根中總黃酮化合物含量檢測，得到標準曲線方程：y=28.843x+0.012 8（R2=0.999 0），按照標準曲線回歸方程計算龍須草根部黃酮含量為19.40 mg·mL-1。

1.3.2 LB培養(yǎng)基的配制

稱取3.5 g蛋白胨，3.5 g NaCl及1.75 g酵母浸粉，置于燒杯中，向燒杯中加入350 mL蒸餾水，用電爐加熱，同時用玻璃棒不斷攪拌至藥品全部溶解。再用10% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5，再次定容至350 mL。將配好的LB培養(yǎng)基分裝于150 mL錐形瓶中，蓋上棉塞，用報紙和棉線包扎好后放入高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。滅菌完后自然晾干，放入陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 細菌的活化與菌懸液制備

在無菌條件下，從含有菌種的斜面培養(yǎng)基或培養(yǎng)皿上用接種環(huán)刮取一小塊菌落，將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的菌種分別接種在新鮮的液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后，用滅菌生理鹽水將活化好的供試菌株稀釋成濃度為106～107CFU/mL的菌懸液，4 ℃保存?zhèn)溆肹15]。

1.3.4 抑菌圈測定與最低抑菌濃度

將培養(yǎng)皿滅菌后烘干，放入超凈臺，將備用的固體培養(yǎng)基取出，用微波爐加熱至沒有塊狀物，稍冷卻后在超凈臺中倒平板。待培養(yǎng)皿中的固體培養(yǎng)基再次凝固后，取活化后的二代菌分別均勻涂布于平板上，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌分別涂布三皿。

將1.3.1中龍須草根部總黃酮提取液采用二倍稀釋法依次稀釋，獲得濃度為9.700 0 mg·mL-1、4.850 0 mg·mL-1、2.425 0 mg·mL-1、1.212 5 mg·mL-1的龍須草根部總黃酮提取液。取2 mL 70%乙醇放入一個干凈的培養(yǎng)皿中作為對照[16-17]。

向裝有不同濃度的龍須草根部總黃酮提取液的培養(yǎng)皿中分別放入9片滅菌后干燥的直徑為6 mm的濾紙片，浸泡3 min，用鑷子夾取濾紙片，小心地甩干濾紙片上的液體，將其平鋪于涂布后的平板上。蓋好蓋子后再用保鮮膜封住開口處，減少雜菌污染的風險。將培養(yǎng)皿放入37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈，評價不同濃度的黃酮抑菌作用，確定最低抑菌濃度。

1.3.5 pH值對龍須草根部總黃酮提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

用檸檬酸和氫氧化鈉溶液將龍須草根部總黃酮提取液調(diào)至pH值為3.0、5.0、7.0和9.0，以未處理組（pH值為6.5）作為對照，分別對3種細菌進行抑菌試驗，測量抑菌圈，平行測定3次。

1.3.6 紫外線照射對龍須草根部總黃酮提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

將龍須草根部總黃酮提取液在紫外光下分別照射5 min、10 min、15 min、20 min和25 min，以未在紫外光下處理組為對照，分別對3種細菌進行抑菌試驗，測量抑菌圈，平行測定3次。

1.3.7 金屬離子對龍須草根部總黃酮提取物抑菌效果的影響

將龍須草根部總黃酮提取物加入濃度為1.0 mg·mL-1的NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、FeCl2和FeCl3的溶液中，以未處理組作為對照，分別對3種細菌進行抑菌試驗，測量抑菌圈，平行測定3次。

2 結果與分析

2.1 最低抑菌濃度測定

最低抑菌濃度是評價有效物質(zhì)抑菌作用強弱的重要指標，最低抑菌濃度越小，物質(zhì)抑菌活性越強。采用濾紙片法（濾紙片直徑為6 mm）測定抑菌圈直徑來評價提取物抑菌作用的強弱。

由表1可知，龍須草根部總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用強于其對大腸桿菌的抑制作用。對于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌而言，龍須草根部總黃酮提取物的最低抑菌濃度為2.425 mg·mL-1，對于大腸桿菌來說，龍須草根部總黃酮提取物的最低抑菌濃度則大于2.425 mg·mL-1。

表1 龍須草根部總黃酮提取物的最小抑菌濃度表

2.2 pH值對龍須草根部總黃酮提取物抑菌效果的影響

由圖1可知，龍須草根部總黃酮提取物的抑菌效果受pH值影響較為明顯。pH值為3.0時，根部總黃酮抑菌圈直徑減小，與未處理組（pH=6.5）相比，最高減幅達到43.77%，抑菌活性明顯降低。pH=5時，與未處理組相比，最高減幅為16.62%，抑菌活性稍有降低。在中性pH值條件下，與未處理組無明顯差異，抑菌效果較好；當pH值為9時，與對照組相比，最高減幅達到47.13%，抑菌效果較差。因此，龍須草根部總黃酮提取物在弱酸性及中性條件下的抑菌穩(wěn)定性很好，但是在強酸性、堿性環(huán)境下抑菌效果較差。

2.3 紫外線照射對龍須草根部總黃酮提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖2可知，經(jīng)過不同的紫外線照射時長處理后，龍須草根部提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑?jīng)]有明顯變化，變化幅度小于11.34%，抑菌活性基本保持穩(wěn)定。因此，龍須草根部提取物在紫外線照射條件下穩(wěn)定性良好。

2.4 金屬離子對龍須草根部總黃酮提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

如圖3所示，F(xiàn)e2+和Fe3+均能促進龍須草根部總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制作用，與對照組相比，最高增幅達到43.93%；此外，Na+、K+、Ca2+、Mg2+也能在一定程度上促進龍須草根部總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果，但其對提取物抑制大腸桿菌的效果則無明顯影響。這可能是由于許多金屬離子可以作為黃酮類物質(zhì)的配合物增強其抑菌活性[18]，F(xiàn)e2+和Fe3+與龍須草根部總黃酮的協(xié)同作用要強于其他金屬離子。

3 結論

本實驗以龍須草根為材料，利用酶解和微波輔助法提取龍須草根部的總黃酮，探究龍須草根部總黃酮對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果，結果表明，龍須草根部總黃酮提取物對所述的3種菌皆有一定的抑制作用，且龍須草根部總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用強于其對大腸桿菌的抑制作用。龍須草根部黃酮對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最低 抑菌濃度 分別為 2.425 mg·mL-1、2.425 mg·mL-1、4.850 mg·mL-1。實驗還探討了pH值、紫外線和常見金屬離子對龍須草根部總黃酮抑菌效果的影響，結果表明：龍須草根部總黃酮在pH值為5～7、紫外照射、金屬離子存在條件下均有較好的抑菌穩(wěn)定性，并且大多數(shù)金屬離子在一定程度上能夠提高根部總黃酮的抑菌效果，為龍須草根部總黃酮在天然防腐劑領域的研發(fā)運用提供基礎。