董憲慧，李夢(mèng)竹，穆秋霞，類彥波，崔素萍

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心；4.大慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心）

不良的飲食習(xí)慣、環(huán)境污染以及藥物濫用，會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的自由基，引發(fā)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)[1]，人體需要額外補(bǔ)充抗氧化劑來(lái)維持體內(nèi)氧化/抗氧化平衡?？寡趸瘎┓譃楹铣煽寡趸瘎┖吞烊豢寡趸瘎2]。合成抗氧化劑由于存在健康風(fēng)險(xiǎn)而受到嚴(yán)格限制[3]。天然抗氧化劑來(lái)源廣泛，具有安全、無(wú)毒、高效的特點(diǎn)[4]，已成為抗氧化劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)?？寡趸淖鳛樘烊豢寡趸瘎寡趸愿?，易于人體消化吸收[5]，還具有治療癌癥、瘧疾、高血壓等疾病的潛力[6-7]。因此，抗氧化肽在食品添加劑、化妝品和保健品等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。

抗氧化肽主要有動(dòng)物來(lái)源和植物來(lái)源的[8]，植物蛋白抗氧化肽具有延長(zhǎng)食品保質(zhì)期[9-11]、增強(qiáng)記憶[12-13]及醒酒[14]等作用。由于抗氧化肽的粉劑不便于攜帶和食用，片劑可以彌補(bǔ)這一不足。陳安國(guó)[15]利用火麻活性肽制備的抗氧化產(chǎn)品口感飽滿，抗氧化活性高，具有降血壓、抗疲勞的功效；劉國(guó)飛[16]利用豌豆肽、玉米肽、黑豆肽制備的復(fù)合肽固體飲料和咀嚼片，抗氧化效果好、成本低、易于工業(yè)化生產(chǎn)；邵偉[17]利用大豆肽制作的咀嚼片便于保存攜帶、能緩解身體疲勞。咀嚼片具有易于保存運(yùn)輸，攜帶、食用方便等特點(diǎn)[18]，且嚼碎吞服后產(chǎn)品表面積增加，不需在胃中解崩，易于有效物質(zhì)消化吸收[19]，兼具粉劑和片劑的優(yōu)點(diǎn)，非常適宜承載抗氧化肽產(chǎn)品。

團(tuán)隊(duì)前期研究表明，英國(guó)紅蕓豆各抗氧化肽組分的DPPH自由基清除率均大于70%，抗氧化性最強(qiáng)的組分具與維生素C的抗氧化性相近[20]，國(guó)外暫無(wú)對(duì)于蕓豆蛋白抗氧化肽產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用，國(guó)內(nèi)僅有張景田[21]利用包括白蕓豆肽在內(nèi)的多種小分子肽制備具有益肌骨損傷愈合功效的固體飲料，研究較少，并未充分發(fā)揮蕓豆蛋白抗氧化肽的利用價(jià)值。擬以英國(guó)紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分為主料，研究咀嚼片的最佳配方及壓片條件，為英國(guó)紅蕓豆抗氧化肽產(chǎn)品的開發(fā)提供途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

英國(guó)紅蕓豆：購(gòu)于大慶市新瑪特超市；輔料（山楂粉：河北美威藥業(yè)股份有限公司；甘露醇、麥芽糊精、微晶纖維素、硬脂酸鎂：河南千志商貿(mào)有限公司）過(guò)80目篩子備用。

堿性蛋白酶：活性≥200000活力單位/克，北京鑫澤天佑生物科技有限公司；DPPH：北京博奧拓達(dá)科技有限公司；維生素C：天津金?；瘜?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、膽酸鈉：北京索萊寶科技有限公司；煌綠乳糖膽鹽肉湯、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-4A型粉末壓片機(jī)：天津市拓普儀器有限公司；CHRIST Alpha型冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Marin Christ公司；U-2910紫外可見分光光度計(jì)：上海斯邁歐分析儀器有限公司；ZBS-6E智能崩解試驗(yàn)儀：天津市天大天發(fā)科技有限公司；WB-98A型片劑脆碎度：北京國(guó)立和分析儀器技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 英國(guó)紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分的制備

英國(guó)紅蕓豆蛋白質(zhì)的提取及抗氧化肽組分的制備方法見參考文獻(xiàn)[22]，抗氧化肽組分真空冷凍干燥后低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抗氧化肽組分咀嚼片的研制

（1）單因素試驗(yàn)

在硬脂酸鎂添加量1%、微晶纖維素添加量適當(dāng)調(diào)整的條件下，分別考察主料（40%、50%、60%、70%、80%）、麥芽糊精（3%、4%、5%、6%、7%）、甘露醇（10%、15%、20%、25%、30%）、山楂粉（1%、2%、3%、4%、5%）等添加量對(duì)咀嚼片感官品質(zhì)的影響，每個(gè)處理做3次重復(fù)。

（2）正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)咀嚼片配方進(jìn)行正交優(yōu)化，采取L9（33）正交設(shè)計(jì)，進(jìn)一步確定咀嚼片的配方。

（3）驗(yàn)證試驗(yàn)

按照正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)組合制作咀嚼片并進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.3 咀嚼片評(píng)價(jià)

（1）感官品質(zhì)評(píng)價(jià)

選擇10位身體健康的食品科學(xué)與工程專業(yè)在讀研究生，對(duì)咀嚼片進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[23]見表1。

表1 英國(guó)紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分咀嚼片感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory scoring criteria for British red kidney bean protein antioxidant peptide component chewable tablets

（2）片重差異、脆碎度的分析

由大慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心按照《中國(guó)藥典》（2015版）[24]方法測(cè)定咀嚼片的重量差異和脆碎度。

（3）微生物指標(biāo)分析

依據(jù)GB/T 4879.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-菌落總數(shù)測(cè)定》和GB/T 4879.3-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)—大腸菌群計(jì)數(shù)》分別對(duì)咀嚼片進(jìn)行微生物指標(biāo)分析。

（4）人體每日服用劑量的確定

將維生素C和英國(guó)紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分按質(zhì)量濃度分別為1、2、4、5、10、20、40、50 mg·mL-1進(jìn)行羥基自由基清除率的測(cè)定，通過(guò)維生素C每日的攝入量確定咀嚼片的攝入量。

1.3.4 抗氧化性分析

參照參考文獻(xiàn)[25]的方法對(duì)英國(guó)紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分、咀嚼片及咀嚼片中肽組分的DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率和還原力進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

利用IBM SPSSStatistics 23軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化肽組分咀嚼片的制備

2.1.1 抗氧化肽組分添加量對(duì)咀嚼片感官質(zhì)量的影響

固定混合料中其它輔料的添加比例，抗氧化肽組分添加量對(duì)咀嚼片感官品質(zhì)的影響見表2。

表2 抗氧化肽組分及麥芽糊精添加量對(duì)咀嚼片感官品質(zhì)的影響Table 2 Effects of antioxidant peptide content and maltodextrin content on sensory quality of chewable tablets

當(dāng)添加量為60%時(shí)，感官評(píng)分最高，且差異顯著（P＜0.05）。因此，在咀嚼片的配方中，確定肽組分的添加量為60%。抗氧化肽組分顏色為淺棕色，味苦澀并有特殊的味道。隨著抗氧化肽組分添加量的增加，咀嚼片顏色逐漸變深，苦味和肽特有的味道逐漸增加。由于肽具有吸濕性，吸濕后的肽會(huì)表現(xiàn)出流動(dòng)性差、黏性強(qiáng)等不良特點(diǎn)，影響片劑的可壓性[26]。當(dāng)肽含量逐漸增大時(shí)，肽吸收的水分受擠壓到顆粒表面將可溶物質(zhì)溶解，待壓力撤除后溶解物析出，相鄰顆粒間產(chǎn)生“固體橋”，使顆粒間牢固結(jié)合，咀嚼片表面因而固結(jié)成塊[27]，導(dǎo)致表面粗糙度增加，硬度逐漸增大。

2.1.2 麥芽糊精添加量對(duì)咀嚼片感官質(zhì)量的影響

麥芽糊精口感滑膩、具有特殊的糊味，易被人體消化吸收。因其具有溶解性、穩(wěn)定性和填充效果較佳、吸濕性低、粘結(jié)性較強(qiáng)等特點(diǎn)，常被用作粉末壓片中的填充劑和粘合劑[28]。當(dāng)主料添加量為60%，山楂粉、甘露醇、硬脂酸鎂添加量分別為3%、21%、1%，麥芽糊精添加量為3%～7%時(shí)，麥芽糊精添加量對(duì)咀嚼片感官質(zhì)量的影響見表2。隨著麥芽糊精添加量的增加，咀嚼片的外觀色澤無(wú)明顯變化，表面逐漸細(xì)膩，硬度逐漸增大。這是由于麥芽糊精的添加降低了粉劑的吸濕性，使咀嚼片表面固結(jié)的程度降低而變得細(xì)膩；由于麥芽糊精的黏性使粉劑顆粒間結(jié)合更緊密，導(dǎo)致硬度增大。麥芽糊精量增加，咀嚼片苦味有所減弱，但隨著麥芽糊精量繼續(xù)增加，其本身的糊味逐漸顯現(xiàn)，與苦味相疊加造成口感更苦。因此，麥芽糊精添加量為5%時(shí)，顏色乳白、硬度適中、口感最佳，且差異顯著（P＜0.05）。

2.1.3 山楂粉添加量對(duì)咀嚼片感官品質(zhì)的影響

山楂粉添加量對(duì)咀嚼片感官品質(zhì)的影響見3。

山楂粉的顏色偏紅，口味酸甜、具有山楂特有的濃香，其中含有的大量膳食纖維，能提高產(chǎn)品的咀嚼性，又因其具有吸濕性，使其黏性增加[29]。當(dāng)主料添加量為60%，麥芽糊精、甘露醇、硬脂酸鎂添加量分別為5%、21%、1%，山楂粉添加量為1%～5%時(shí)，隨著山楂粉添加量的增加，顏色略微加深，苦味得到改善，由于黏性和吸濕性增加導(dǎo)致硬度變大，當(dāng)山楂粉添加量為3%時(shí)，顏色乳白、硬度適中、口感最佳，且差異顯著（P<0.05）。

2.1.4 甘露醇添加量對(duì)咀嚼片感官品質(zhì)的影響

甘露醇入口即溶，有清涼感，且無(wú)吸濕性，常作為填充劑[30]和矯味劑。甘露醇添加量對(duì)咀嚼片感官品質(zhì)的影響結(jié)果如表3。當(dāng)主料添加量為60%，麥芽糊精、山楂粉、硬脂酸鎂添加量分別為5%、3%、1%，甘露醇添加量為10%～30%時(shí)，隨著甘露醇添加量的增加，咀嚼片的外觀無(wú)明顯變化，苦味逐漸減小，表面逐漸細(xì)膩，硬度逐漸減小，當(dāng)甘露醇添加量為30%時(shí)，硬度適中，且差異顯著（P＜0.05）。

表3 山楂粉及甘露醇添加量對(duì)咀嚼片感官品質(zhì)的影響Table 3 Effects of hawthorn powder and mannitol content on sensory quality of chewable tablets

2.1.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化咀嚼片的配方

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)（表4），在抗氧化肽組分添加量為60%條件下，選取麥芽糊精（因素A）、山楂粉（因素B）、甘露醇（因素C）3因素做正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表5、6和7。

表4 咀嚼片配方L 9（33）因素水平表Table 4 L9（33）factors and levels of chewable tablets formulation

表5 咀嚼片配方正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal experimental results of chewable tablet formulations

續(xù)表5 咀嚼片配方正交試驗(yàn)結(jié)果Continued table 5 Orthogonal experimental results of chewable tablet formulations

表6 咀嚼片配方的正交試驗(yàn)Table 6 Influences of orthogonal test on the formula of chewable tablets

表7 咀嚼片配方方差分析表Table 7 Analysis of variance of chewable tablet formula

由正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析可知，因素A（麥芽糊精）、B（山楂粉）和C（甘露醇）的影響均未達(dá)到顯著水平。因此，正交試驗(yàn)中的得到的較優(yōu)壓片方案A1B1C3為最優(yōu)方案，配方中的添加量分別為：抗氧化肽組分60%，麥芽糊精4%、山楂粉2%、甘露醇30%、硬脂酸鎂1%、微晶纖維素3%時(shí)，壓片的效果較好，形成的咀嚼片顆粒光滑、圓整，口感最佳。

2.1.6驗(yàn)證試驗(yàn)

采用粉末直接壓片方法在26 MPa下，對(duì)最優(yōu)配方A1B1C3進(jìn)行驗(yàn)證性壓片，產(chǎn)品的感官評(píng)分為87.5±1.02，高于正交試驗(yàn)中各組的感官評(píng)分，且顏色乳白、口感適中、硬度適中。

2.2 性能分析

2.2.1 重量差異

英國(guó)紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分咀嚼片的片重差異見表8。

表8 片重差異檢查結(jié)果Table 8 Weight variation test results

根據(jù)《中國(guó)藥典》（2015版），平均片重在0.30 g及以上的片劑，片重差異限度為±5%。表10中的最大片重差異為-1.8%，符合藥典規(guī)定。

2.2.2 脆碎度

2015年版《中國(guó)藥典》四部通則第0923號(hào)崩解時(shí)限測(cè)定法規(guī)定平均減失重量不得超過(guò)1%。咀嚼片平均減失重量在7%左右，不符合中國(guó)藥典的規(guī)定。甘露醇添加量增大會(huì)導(dǎo)致咀嚼片硬度減小、脆碎度變大[31]，當(dāng)甘露醇添加量為25%時(shí)，咀嚼片的脆碎度達(dá)到1.51%，不符合標(biāo)準(zhǔn)。來(lái)思彤[32]研究發(fā)現(xiàn)，隨著制片壓力增大，咀嚼片硬度增大、脆碎度降低。因此，在甘露醇添加量增大咀嚼片的口感變佳的情況下，需進(jìn)一步探索制片壓力對(duì)咀嚼片性能的影響。

2.2.3 微生物限度測(cè)定

《中國(guó)藥典》（2015版）中非無(wú)菌藥品微生物限度檢查指標(biāo)見表9，其中n為樣本數(shù)量、c為最大可允許超過(guò)m值的樣本數(shù)、m為微生物指標(biāo)可接受水平的限量值、M為微生物指標(biāo)的最高安全限量值。咀嚼片菌落總數(shù)為1 000 CFU·mL-1，大腸桿菌為5 CFU·mL-1，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

表9 微生物限量指標(biāo)Table 9 Microbial limit index

2.2.4 人體每日服用劑量的確定

維生素C與抗氧化肽組分羥基自由基的清除率變化見圖2。

當(dāng)維生素C質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 mg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到99%以上，而抗氧化肽組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為31.4 mg·mL-1時(shí)，具有與維生素C相同的清除率，因此人體攝入抗氧化肽組分的量應(yīng)為維生素C的15.7倍。人體每日需額外攝入維生素C約100 mg[33]，因此推算，人體須攝入抗氧化肽組分1 570 mg，按每片咀嚼片含抗氧化肽組分180 mg計(jì)算，每天需服用約9片，建議每天3次每次服用3片。

2.2.5 抗氧化肽組分咀嚼片抗氧化性能分析

在抗氧化肽組分含量為2 mg·mL-1時(shí)，咀嚼片、咀嚼片中的抗氧化肽組分、單純抗氧化肽組分（對(duì)照）的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率及還原力結(jié)果見表10。

由表10可知，咀嚼片、咀嚼片中的抗氧化肽組分的DPPH自由基清除率與對(duì)照相比略有下降但不顯著（P＞0.05）；咀嚼片、咀嚼片中的抗氧化肽組分的羥基自由基清除率和還原力與對(duì)照相比顯著增加（P＜0.05），但DPPH自由基清除率變化并不顯著。研究表明，不同種類抗氧化肽的抗氧化性表現(xiàn)方式不盡相同，酪蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化性表現(xiàn)為自由基的清除能力[34]、酪蛋白磷酸肽的抗氧化性主要表現(xiàn)為金屬離子螯合能力[35]。肽抗氧化性的強(qiáng)弱不但與相對(duì)分子質(zhì)量以及氨基酸組成有關(guān)[36]，而且與其結(jié)構(gòu)特征尤其是肽鍵形式有關(guān)[37]，在壓片的過(guò)程中巨大的壓力可能會(huì)對(duì)抗氧化肽結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。此外，咀嚼片輔料中的其他成分也會(huì)與抗氧化肽相互作用影響抗氧化性[38]。因此，將肽組分制成咀嚼片后抗氧化性的變化原因較為復(fù)雜，具體原因有待后續(xù)研究。

圖1 相同濃度維生素C與抗氧化肽組分羥基自由基的清除率變化Fig.1 Changes in the scavenging rate of the same concentration of vitamin Cand antioxidant peptide hydroxyl free radicals

表10 咀嚼片的抗氧化性分析Table 10 Antioxidant analysis of chewable tablets

3 結(jié)論

采用粉末直接壓片方法在26 MPa下，英國(guó)紅蕓豆抗氧化肽組分咀嚼片的最佳配方中各種材料的添加量分別為：抗氧化肽組分60%、麥芽糊精4%、山楂粉2%、甘露醇30%、硬脂酸鎂1%、微晶纖維素3%。使用該配方制作的咀嚼片性狀穩(wěn)定、口感良好、易于吸收，具有一定的抗氧化能力，為有效的抗氧化產(chǎn)品。研究說(shuō)明將英國(guó)紅蕓豆抗氧化肽制成咀嚼片為其提供有效的產(chǎn)品開發(fā)途徑，可以更好發(fā)揮其價(jià)值。