賀鑫梅，王媛，馮耀元，毛瑩瑩，邢曉婭，向虹怡，郭曉宇，韓英浩，金美華

（黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，大慶 163319）

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）是一類含氧物質，化學性質十分活潑，并且具有很強的氧化能力，是細胞代謝中的一種不可避免的產(chǎn)物[1]，包括超氧陰離子自由基、羥基自由基以及過氧化氫等[2]。細胞內ROS的產(chǎn)生以及清除處在一種動態(tài)平衡，當一些外界的因素以及自身原因打破這一平衡時，大量的ROS積累，造成DNA的損傷、蛋白質的氧化和脂質過氧化，破壞細胞的結構和功能[3]。根據(jù)ROS的來源、細胞類型以及組織環(huán)境不同，ROS信號可能導致代謝功能障礙和炎癥反應的發(fā)生，進而導致相關疾病，如酒精性肝病、動脈粥樣硬化、糖尿病和中風等的發(fā)生[4-8]。

肝臟是人體重要的解毒器官，是各種藥物、化學物質代謝的場所，肝臟在代謝物質時產(chǎn)生的過量ROS，損害肝細胞的結構和功能，造成肝內脂肪積累和炎癥反應的發(fā)生，嚴重危害人體健康。為了抵抗代謝過程中產(chǎn)生的過量ROS，肝臟內有超氧化物歧化酶，過氧化氫酶和谷胱甘肽等酶及維生素A和維生素C等抗氧化劑清除ROS[9]。除了以上經(jīng)典的抗氧化酶和抗氧化劑外，Peroxiredoxins（Prxs）蛋白是一類具有抗氧化作用的蛋白家族，廣泛存在于抗氧化防御和氧化還原信號通路中，此外在真核生物以及原核生物中普遍存在[10]。根據(jù)Cys殘基的位置和數(shù)目可分為2-Cys（Prx I-Prx IV）、非典型2-Cys（Prx V）和1-Cys（Prx VI）[11]。Prxs蛋白家族含有的活性半胱氨基位點能夠氧化H2O2，以此將細胞中多余的ROS清除，使細胞受到保護，不被損傷[12]。而PrxⅡ作為Prxs家族的一員，可將H2O2還原成水，并在氧化應激的條件下表達上調以清除細胞內多余的ROS[13-15]。

慢病毒載體是由人類免疫缺陷病毒改造而成，是一種高效的基因轉導工具，它能夠將外源基因序列穩(wěn)定導入分裂期細胞和非分裂期細胞，并可在宿主體內長期表達，不易誘發(fā)宿主免疫反應，是基因功能研究和基因治療中一種不可多得的優(yōu)良的載體[16-18]。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。它本身是生物進化過程中細胞的一種保護性機制，機體可因此避免外源性基因（如病毒、轉座子）在宿主細胞內表達，清除一些生命發(fā)育過程中出現(xiàn)的異常mRNA。如今，已經(jīng)把它作為沉默目的基因表達的一種有效手段。慢病毒介導的RNAi技術與傳統(tǒng)基因敲除技術相比，能夠獲得更加穩(wěn)定的基因敲降效果，是用于研究某個特定基因功能的理想方法[16-20]。

利用慢病毒載體將Prx II基因特異性ShRNA轉入人肝細胞系QSG-7701，利用嘌呤霉素進行篩選獲得Prx II敲降的穩(wěn)定細胞系，并對細胞處理不同濃度的H2O2，以研究缺失Prx II后對肝臟細胞抗氧化性的影響。同時，Prx II敲降的穩(wěn)定細胞系的建立也為進一步研究該蛋白的生物學功能提供了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

人肝細胞系QSG-7701（由黑龍江八一農(nóng)墾大學分子病理與藥效學實驗室提供）。

1.1.2 藥品與試劑

DMEM（Hyclone公司），F(xiàn)BS（Gibico公司），P/S（Gibico公司），TE（北京Solarbio），Hank’s洗液（Hyclone公司），Prx II空白慢病毒載體（上海吉瑪基因），Prx II敲降慢病毒載體（上海吉瑪基因），puromycin dihydrochloride（Gene Operation），MTT（Amreso），DMSO（天津市富宇試劑），H2O2（西格瑪公司），PBS（Hyclone公司），Prx II抗體（Abfrontier），βactin抗體（博奧森生物）。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒質粒的構建

慢病毒載體是以國際通用的第三代載體為基礎，通過上海吉瑪基因的改建，構成四質粒體系，如圖1，將其刪除了全部HIV-1的編碼基因，所以在介導目的基因的表達時，沒有任何HIV-1蛋白的表達，而且對5’和3’LTR分別進行了刪除改造，5’LTR缺失U3，換上RSV promoter，使載體的復制不再依賴Tat，3’LTR刪除U3，使其不再具有啟動活性，成為自滅活（self-inactivating，SIN）載體。

圖1 慢病毒質粒圖譜Fig.1 Lentivirus plasmid profile

1.2.2 病毒滴度測定

將處于對數(shù)生長期的293T細胞以3×104個細胞/孔的濃度接種于96孔板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取10μL待測定的病毒原液，用含10%FBS培養(yǎng)液十倍稀釋3～5個梯度。次日，吸棄96孔板的培養(yǎng)液，每孔加入100μL稀釋的病毒液，同時設立空白對照組，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后，吸棄96孔板中的病毒液，每孔加入100μL 10%FBS的DMEM培液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h。期間每隔24 h進行換液。通過熒光顯微鏡計數(shù)熒光細胞，結合稀釋倍數(shù)計算病毒滴度，用TU·ml-1（感染單位/毫升）表示。

1.2.3 慢病毒轉染細胞

將生長狀況良好的細胞，以每毫升3.5×105個的密度種到6孔板，分為3組（標記為Blank，Scramble，Sh-Prx II）。第二天，對三組細胞進行換液，并根據(jù)預先測定的MOI值（MOI值為4.6）向Scramble和Sh-Prx II里面分別加入適量的空白載體病毒液和慢病毒液，進行培養(yǎng)。第三天，觀察生長狀況，將三組細胞進行1∶2傳代，傳到六孔板，每組各種兩個孔板。第四天，棄去培養(yǎng)液，更換為新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。第五天，將種于六孔板中的三組細胞的兩個孔板合并，傳至6 cm培養(yǎng)皿。第六天，細胞量增多，將細胞傳到10 cm培養(yǎng)皿中，進行培養(yǎng)。第七天，更換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。第八天，將三組細胞1∶2傳代至兩個10 cm培養(yǎng)皿，進行培養(yǎng)。第九天，三組細胞更換新培養(yǎng)液，使用2μL（10 mg·mL-1）嘌呤霉素處理，篩選出轉染細胞，當Blank細胞全部死亡后，棄去培養(yǎng)液，更換為新的培養(yǎng)液。將細胞傳代至3.5 cm培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 流式細胞術檢測轉染效率

將生長狀態(tài)良好的細胞從培養(yǎng)皿中使用胰蛋白酶/EDTA溶液（Trypsin/EDTA，TE）處理后，將細胞從培養(yǎng)皿中轉移到1.5 mL的離心管中，3 000 r·min-1離心5 min，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗兩遍，3 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，每個離心管加1 ml PBS，吹打混勻后，在BD公司的FACScalibur上進行數(shù)據(jù)采集，進行數(shù)據(jù)分析，作出結果圖。

1.2.5 熒光照相檢測轉染效率

將生長狀況良好的三組細胞TE處理后，離心，培養(yǎng)液吹打混勻，進行細胞計數(shù)。取三個1.5 mL的離心管，標記為Blank、Scramble、Sh-Prx II，每個加入160 mL的培養(yǎng)液，20 mL 0.4%臺盼藍溶液，20 mL對應的細胞懸液，混勻后于顯微鏡下進行計數(shù)，Blank、Scramble、Sh-Prx II三組細胞分別為32個、21個、22個。每個3.5 cm培養(yǎng)皿中種3×105個細胞，根據(jù)公式：（細胞計數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)（此處稀釋倍數(shù)為10），計算出每個培養(yǎng)皿所需細胞懸液體積，將其均勻種于培養(yǎng)皿，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。第二天，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗一遍，熒光顯微鏡下檢測發(fā)熒光的細胞數(shù)量，計算轉染率。

1.2.6 蛋白質免疫印跡檢測Prx II蛋白表達

①將Blank，Scramble，Sh-Prx II三組細胞用TE處理后，把細胞從培養(yǎng)皿中轉移到1.5 mL的離心管中，3 000 r·min-1離心5 min，棄去培養(yǎng)液后，PBS清洗一遍，3 000 r·min-1離心5 min后，棄去上清。②在細胞球中加入120μL蛋白質裂解液，將離心管置于冰上，每5 min敲打一次，30 min后將離心管轉移至離心機，12 000 r·min-1離心30 min。③離心結束后，將離心管轉移至冰上，用200μL的移液槍吸取上清液，并將上清液轉移至新的1.5 mL的離心管中。④取新的1.5 mL的離心管，向其中加入800μL的蒸餾水，200μL的考馬斯亮藍，1μL提取的總蛋白質樣品后在震蕩器上混勻，并用1 mL的移液槍將其轉移至比色皿中，將比色皿放入分光光度計中，調節(jié)分光光度計的波長為595 nm，檢測其OD值。⑤將檢測的OD值代入蛋白質濃度的函數(shù)公式，計算出總蛋白質樣品的蛋白質濃度。按照標準曲線計算出配制樣品所需的蛋白、5×buffer、DDW所需體積，配制跑膠樣品。配制完成后，在沸水中煮樣5 min，煮完立即放進4℃冰箱。⑥配制SDS-PAGE的下層分離膠，分離膠的濃度是12%，凝固后配置SDS-PAGE的上層濃縮膠，濃縮膠的濃度是5%，待凝固后將SDS-PAGE移入電泳槽中，并向其中加入電泳液。⑦從4℃中取出樣品，使用20μl的移液槍進行點樣，樣品每孔點15μL，蛋白maker每孔點2μL，電壓140 V，電泳80 min左右。⑧跑膠結束后，4℃條件下，電流110 A過夜轉膜，將分離后的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。轉膜結束后，取出硝酸纖維素膜，1%的麗春紅進行染色，蛋白條帶顯色后，剪下所需的條帶，TBST洗至液體沒有紅色。⑨5%的脫脂乳室溫封閉1 h，TBST洗5次，每次5 min，加入1∶1 000的一抗進行目的蛋白的特異性免疫印跡，室溫下2 h，再用TBST洗5次，每次5 min，加入5%的脫脂乳室溫封閉10 min，1∶5 000的HRP標記的二抗室溫孵育1 h。⑩ECL顯影，利用熒光成像系統(tǒng)獲得目的蛋白的條帶。

1.2.7 細胞毒性檢測

將生長狀況良好的Scramble和Sh-Prx II，進行細胞計數(shù)，以每孔104個的細胞密度接種于96孔板，一 共 設 置6個 濃 度 梯 度（0、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25 mmol·L-1），每個濃度設置6個平行對照。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。次日，吸棄培養(yǎng)液，加入含1%血清的培養(yǎng)液，饑餓處理2 h后，加入配置好的H2O2，1μL·孔-1，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。第二天，每孔加入10μLMTT溶液（5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL的DMSO，37℃下處理10 min，用酶標儀在490 nm處檢測其吸光度值。根據(jù)公式：細胞存活率＝（實驗組OD值－空白組OD值）/（對照組OD值－空白組OD值）×100%計算細胞的存活率。

1.2.8 統(tǒng)計學分析

2 結果與分析

2.1 流式細胞術檢測慢病毒轉染QSG-7701細胞的效率

為了確定慢病毒是否成功轉染了QSG-7701細胞，對細胞進行了流式細胞術分析，Scramble組細胞、shPrx II組細胞轉染率分別為98.80%、99.48%，如圖2所示。

圖2 流式細胞儀檢測慢病毒轉染QSG-7701細胞的效率Fig.2 FACSdetection of the efficiency of QSG-7701 cells transfected by the Prx II shRNA lentivirus

2.2 熒光照相檢測慢病毒轉染QSG-7701細胞的效率

為了進一步確定慢病毒對QSG-7701細胞的轉染情況，對三組細胞進行了熒光照相，結果顯示，在熒光視野下，Blank組的細胞無任何細胞發(fā)綠色熒光，Scramble組和Sh-Prx II組發(fā)綠色熒光的細胞數(shù)量占同一區(qū)域明亮視野下細胞量90%以上，如圖3所示，表明90%的細胞被成功轉染。

圖3 熒光顯微鏡檢測慢病毒轉染QSG-7701細胞的效率Fig.3 Fluorescence microscope detection of the efficiency of QSG-7701 cells transfected by the Prx IIshRNA lentivirus

2.3 Prx II基因敲降結果驗證

為了驗證Prx II基因的敲降情況，將慢病毒轉染后的QSG-7701細胞進行傳代，之后進行蛋白免疫印跡實驗，分別檢測Blank，Scramble，Sh-Prx II三組的Prx II蛋白的表達情況，選用β-actin做內參。結果圖4 A、B（**P＜0.01，*P＜0.05）顯示，Sh-Prx II組的Prx II蛋白水平明顯低于Blank組和Scramble組，表明成功構建了Prx II敲降的細胞系。

圖4 蛋白免疫印跡檢測慢病毒敲降QSG-7701細胞中Prx II的效果Fig.4 Expression level of Prx II in QSG-7701 by western blot

2.4 Prx II敲降后細胞的抗氧化作用下降

為了探究Prx II敲降后對QSG-7701細胞抗氧化性的影響，利用MTT assay檢測不同濃度H2O2對Scramble組和Sh-Prx II組的細胞毒性。結果顯示，在H2O2濃度大于0.15 mmol·L-1后，Sh-Prx II組的細胞存活率低于Scramble，如圖5（**P＜0.01，*P＜0.05），表明在Prx II敲降后，細胞的抗氧化作用下降。

圖5 MTT assay檢測H 2O2對QSG-7701細胞中Prx II敲降后的存活率Fig.5 Detection of survival rate of H2O2 process QSG-7701 cells after Prx II knockout by MTT assay

3 討論

Prx II是Prxs家族中的一員，具有抗氧化及清除自由基作用，參與細胞的增生和分化，細胞凋亡和細胞信號轉導等功能。并且隨著研究的深入，該蛋白家族的生理生化功能不斷被發(fā)現(xiàn)，Prxs家族在多種腫瘤細胞中都高表達，與腫瘤之間的關系值得進一步探索[21-22]。近些年，Prxs家族在肝病中的保護作用被廣泛研究，肝病分為酒精性肝病和非酒精性肝病，初期表現(xiàn)為脂肪肝，進而發(fā)展為肝炎，肝纖維化，嚴重時可導致肝硬化或肝癌的發(fā)生，是威脅人類健康的一大隱患。肝細胞內異常脂質代謝和過量ROS的產(chǎn)生引起的脂肪過量堆積將造成非酒精性脂肪肝的形成，Prx V過表達顯著抑制了細胞質和線粒體ROS的產(chǎn)生，此外，Prx V調控AMP激活蛋白激酶通路和脂肪生成基因（固醇調控元件結合蛋白1和脂肪酸合成酶）的表達，抑制脂質積累，從而改善游離脂肪酸誘導的肝臟脂肪變性[23]。ROS被認為在酒精性脂肪性肝病中起重要作用，肝脂肪變性和隨后的脂肪性肝病是酒精攝入的反應[24]。有研究表明酒精飼喂的小鼠中Prx I對ROS清除作用更強，Prx I對酒精喂養(yǎng)小鼠肝臟具有保護作用[25]。酒精喂養(yǎng)的Prx II基因敲除的小鼠和野生型小鼠，Prx II基因敲除的小鼠肝脂肪變性更加嚴重，表明Prx II對小鼠肝臟也有保護作用[26]。另外也有研究表明，Prx III通過清除活性氧來調節(jié)10號染色體上缺失的張力同源物（PTEN）的氧化還原，對酒精暴露時的脂肪生成具有拮抗作用[24]。

利用慢病毒載體介導Prx II基因特異性shRNA侵染人肝細胞系QSG-7701，通過流式細胞術以及熒光顯微鏡檢測，結果顯示，Scramble組細胞、shPrx II組細胞轉染率分別為98.80%、99.48%，Scramble組和Sh-Prx II組發(fā)綠色熒光的細胞數(shù)量占同一區(qū)域明亮視野下細胞量90%以上，表明慢病毒成功轉染細胞。之后對轉染后的細胞進行蛋白免疫印跡檢測，結果顯示，與Scramble組對比，Sh-Prx II組Prx II蛋白的表達明顯降低，表明獲得了Prx II敲降的穩(wěn)定細胞系。隨后使用不同濃度的H2O2處理Scramble和Sh-Prx II兩組細胞，MTT assay檢測細胞毒性，結果顯示，隨著H2O2濃度增加，細胞的存活率顯著下降，表明Prx II敲降后，QSG-7701細胞對H2O2的清除能力下降，即細胞的抗氧化作用受到了抑制。實驗所采用的QSG-7701細胞系是目前與肝臟相關研究中運用較廣泛的一種細胞系，因此構建Prx II敲降的QSG-7701細胞系為肝臟疾病的治療提供技術支撐，并且初步探究Prx II對細胞抗氧化作用的影響，為后續(xù)闡明Prx II對肝細胞功能的調控作用提供新思路。