魏海軍 肖凡

[摘要] 目的 探討B(tài)DNF 受體酪氨酸蛋白激酶B（TrkB）通路對(duì)硫化氫（H2S）減輕同型半胱氨酸（Hcy）誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響。 方法 將雄性SD大鼠隨機(jī)分為六組，分別為對(duì)照組、損傷組（Hcy，0.6 μmol）、損傷+保護(hù)組[Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）]、對(duì)照+保護(hù)組[正常+NaHS（100 μmol/kg）]及抑制保護(hù)組[Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）+BDNF/TrkB的特異性抑制劑K252a（1 μg/d）]、對(duì)照+抑制組（正常+K252a 1 μg/d），每組8只;Tunel染色法分析大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡情況，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）分析Caspase-3、Bcl-2在海馬中的表達(dá)。 結(jié)果 與損傷組比較，損傷+保護(hù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元著色細(xì)胞數(shù)減少，著色變淺，凋亡百分率明顯降低（P<0.01），并且Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，而B(niǎo)cl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P<0.01）;與損傷+保護(hù)組比較，抑制保護(hù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增高（P<0.01），Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，而B(niǎo)cl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P<0.01）。 結(jié)論 BDNF/TrkB通路參與硫化氫減輕同型半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡。

[關(guān)鍵詞] BDNF/TrkB通路;硫化氫;同型半胱氨酸;海馬神經(jīng)元凋亡

[中圖分類(lèi)號(hào)] R743.3&nbsp; ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）02-0034-03

Effect of BDNF/TrkB pathway on hydrogen sulfide attenuating homocysteine-induced apoptosis of hippocampal neurons in rats

WEI Haijun1? ?XIAO Fan2

1.School of Medicine， Hunan Polytechnic of Environment and Biology， Hengyang? ?421005， China; 2.Clinical Research Institute， Affiliated Nanhua Hospital， University of South China， Hengyang? ?421001， China

[Abstract] Objective To explore the effect of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） receptor/tyrosine kinase receptor B （TrkB） pathway on hydrogen sulfide （H2S） attenuating homocysteine （Hcy）-induced apoptosis of hippocampal neurons in rats. Methods Male SD rats were randomly divided into 6 groups， namely， the control group， the injury group （Hcy， 0.6 μmol）， the injury+protection group （Hcy [0.6 μmol]+NaHS [100 μmol/kg]）， the control+protection group （normal+NaHS [100 μmol/kg]） and the inhibition+protection group （Hcy [0.6 μmol]+NaHS [100 μmol/kg]+specific inhibitor of BDNF/TrkB [K252a （1 μg/d]）， the control+inhibition group （normal+K252a [1 μg/d]）， with 8 rats in each group. Apoptosis of hippocampus neurons in CA1 region of rats was analyzed by Tunel staining， and the expressions of Caspase-3 and Bcl-2 in the hippocampus was analyzed by protein blotting （Western blot）. Results Compared with the injury group， the number of stained neurons in the CA1 region of hippocampus in the injury+protection group decreased with lighter coloration， and the apoptosis rate was significantly lower（P<0.01）. Meanwhile， the relative expression of Caspase-3 protein significantly decreased while that of Bcl-2 protein elevated（P<0.01）. Compared with the injury+protection group， the rate of apoptosis in the CA1 region of hippocampus in the inhibition+protection group was significantly higher（P<0.01）.Meanwhile，the relative expression of Caspase-3 protein elevated while that of Bcl-2 protein decreased（P<0.01）. Conclusion BDNF/TrkB pathway is involved in H2S attenuating homocysteine-induced apoptosis in rat hippocampal neurons.

[Key words] Brain-derived neurotrophic factor/tyrosine kinase receptor B pathway; Hydrogen sulfide; Homocysteine; Apoptosis of hippocampal neurons

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）在腦內(nèi)的累積會(huì)易化應(yīng)激認(rèn)知功能障礙，成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種危險(xiǎn)因素，尤其與老年癡呆的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。因此，有關(guān)Hcy損傷神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制及其預(yù)防、治療具有重要研究?jī)r(jià)值。而硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）在神經(jīng)保護(hù)方面發(fā)揮重要作用，尤其是在阿爾茨海默?。ˋzheimer′s disease，AD）中起到保護(hù)作用，其機(jī)制包括抗氧化、抗凋亡等[2]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)系統(tǒng)中的重要神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并且在硫化氫的神經(jīng)保護(hù)作用中發(fā)揮重要作用，本研究將從BDNF受體酪氨酸蛋白激酶B（TrkB）通路的新角度，采取Tunel染色法、Western blot的方法，分析H2S對(duì)Hcy損傷神經(jīng)元后引起的神經(jīng)元凋亡率、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，探討H2S減輕同型半胱氨酸導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元凋亡是否與BDNF/TrkB通路有關(guān)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? 雄性SD大鼠（260～300 g），由長(zhǎng)沙斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)過(guò)程都遵守國(guó)家頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的規(guī)定，且獲得本單位醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（湘）2015-0001，及試驗(yàn)場(chǎng)所為南華大學(xué)。

1.1.2 試劑? NaHS和Hcy由Sigma公司提供;兔抗Caspae-3、鼠抗Bcl-2由單抗武漢博士德公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組? 將雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組，分別是對(duì)照組、損傷組（Hcy，0.6 μmol）、損傷+保護(hù)組[（Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）]、對(duì)照+保護(hù)組[（正常+NaHS（100 μmol/kg）]及抑制保護(hù)組[Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）+BDNF受體酪氨酸蛋白激酶B（TrkB）的特異性抑制劑K252a（1 μg/d）]、對(duì)照+抑制組[正常+K252a（1 μg/d）]，每組各8只。

1.2.2 給藥方法? 對(duì)照組側(cè)腦室注射等體積生理鹽水7 d;損傷組側(cè)腦室注射0.6 μmol的Hcy 7 d;損傷+保護(hù)組進(jìn)行腹腔注射N(xiāo)aHS[100 μmol/（kg·d）]2 d后，再同時(shí)進(jìn)行側(cè)腦室注射Hcy（0.6 μmol/d）7 d;對(duì)照+保護(hù)組進(jìn)行腹腔注射N(xiāo)aHS[100 μmol/（kg·d）]2 d后，再同時(shí)進(jìn)行側(cè)腦室注射等體積的生理鹽水7 d;抑制保護(hù)組進(jìn)行側(cè)腦室注射K252a（1 μg/d）2 d后及腹腔注射N(xiāo)aHS[100 μmol/（kg·d）]2 d后，再同時(shí)進(jìn)行側(cè)腦室注射 Hcy（0.6 μmol/d）7 d。

1.2.3 Western blot測(cè)定海馬Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平? 在冰上將RIPA裂解液加入海馬組織中進(jìn)行研磨及高速離心10 min后，收集海馬組織勻漿上清液進(jìn)行測(cè)定各樣本蛋白濃度（BCA法），再進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印后將PVDF膜放入TTBS緩沖液中（搖動(dòng)5 min），再將其取出放入脫脂奶粉中（搖動(dòng)1 h）后，加入一抗孵育（4℃封閉過(guò)夜），再加入二抗孵育（37℃震蕩1 h），最后進(jìn)行顯影成像并采用AlphEase FC軟件分析Caspase-3、Bcl-2條帶灰度值。

1.2.4 石蠟切片Tunel染色分析大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡? 將大鼠海馬組織進(jìn)行切片脫蠟、水合、蛋白酶K消化（30 min），加入Tunel反應(yīng)液（60 min），DAB顯色（10 min），蘇木素復(fù)染（3 s），溫水返藍(lán)（10 min）后，進(jìn)行脫水、透明、封片，綠光源熒光顯微鏡分析并拍照。首先鏡下定位海馬CA1區(qū)（100×），再觀察取圖（200×），Tunel陽(yáng)性細(xì)胞核為棕黃色，Tunel陰性細(xì)胞核為藍(lán)色，采用Image ProPlus 6.0對(duì)Tunel陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

通過(guò)檢測(cè)各組大鼠海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元的凋亡陽(yáng)性率（細(xì)胞內(nèi)有棕黃色細(xì)膩顆粒彌漫或棕黃色粗顆粒分布者為陽(yáng)性細(xì)胞）及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2的表達(dá)。神經(jīng)元的凋亡陽(yáng)性率越高，Caspase-3表達(dá)上調(diào)及Bcl-2表達(dá)下調(diào)代表神經(jīng)元凋亡程度越嚴(yán)重[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用LSD-t檢驗(yàn)分析進(jìn)行兩兩比較，而隨機(jī)成組設(shè)計(jì)使用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2S可拮抗Hcy導(dǎo)致的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡

實(shí)驗(yàn)表明，與損傷組比較，損傷+保護(hù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元著色細(xì)胞數(shù)減少，著色變淺，凋亡百分率明顯降低（P<0.01）。見(jiàn)表1、封三圖5。并且Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，而B(niǎo)cl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P<0.01）。見(jiàn)表1。提示H2S 可拮抗 Hcy 導(dǎo)致的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡。

2.2 K252a 可抑制 H2S 對(duì) Hcy導(dǎo)致的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的拮抗作用

實(shí)驗(yàn)表明，與損傷+保護(hù)組比較，抑制保護(hù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增高（P<0.01）。見(jiàn)表2、封三圖6。Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高而B(niǎo)cl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P<0.01）。見(jiàn)表2。提示硫化氫減輕同型半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡與BDNF/TrkB通路有關(guān)。

3 討論

同型半胱氨酸是甲硫氨酸代謝出現(xiàn)的一種含硫氨基酸，其生存和清除在人體內(nèi)會(huì)保持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程。同型半胱氨酸上升是心腦血管疾病發(fā)展的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素，也有數(shù)據(jù)認(rèn)為同型半胱氨酸的上升，可能造成患者認(rèn)知功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，老年癡呆患者同型半胱氨酸水平高于健康體檢人員，H2S水平低于健康人群，且與病情嚴(yán)重程度具有密切關(guān)聯(lián)[4]。本研究通過(guò)對(duì)SD雄性大鼠進(jìn)行側(cè)腦室注射Hcy以建立Hcy神經(jīng)毒性動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，損傷組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞核呈棕黃色，且著色細(xì)胞數(shù)多，著色深，凋亡率明顯升高，Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平增加而B(niǎo)cl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低;表明Hcy可引起大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，這也進(jìn)一步證實(shí)了Hcy的神經(jīng)危害。

在一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）、一氧化碳（carbon monoxide，CO）被發(fā)現(xiàn)之后，H2S也被發(fā)現(xiàn)是一種內(nèi)源性氣體分子，具備神經(jīng)保護(hù)的特性[5-7]，它在霍奇金?。℉odgkin disease，HD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）、肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）、帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）、腦缺血、熱性驚厥（febrileseizure，F(xiàn)S）等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起到重要作用[8]。細(xì)胞凋亡其實(shí)是一種細(xì)胞主動(dòng)自毀過(guò)程，它受到基因的調(diào)控。其中Caspase-3是一種加速凋亡的基因，它在正常大腦發(fā)育及細(xì)胞的凋亡中起著很大作用，生理?xiàng)l件下的Caspase-3是沒(méi)有活性的，但是當(dāng)它接收到凋亡信號(hào)刺激后就會(huì)被活化，進(jìn)一步導(dǎo)致DNA裂解，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡[9]。Bcl-2是阻礙凋亡的基因，Bcl-2蛋白水平增高時(shí)可抑制因氧自由基導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[10]。本研究結(jié)果顯示，與損傷組比較，損傷+保護(hù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元著色細(xì)胞數(shù)減少，著色變淺，凋亡百分率明顯降低，并且Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低而B(niǎo)cl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高;提示H2S可拮抗 Hcy導(dǎo)致的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡。李國(guó)風(fēng)等[3]研究指出，H2S可顯著抑制局灶性腦缺血損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡，表明H2S在抗神經(jīng)元凋亡方面起著重要作用，但是其機(jī)制需進(jìn)一步深入挖掘和研究。

BDNF是一種神經(jīng)保護(hù)因子[11-13]，它主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)中，其作用體現(xiàn)為具有神經(jīng)修復(fù)、神經(jīng)再生的特性[14]。BDNF及BDNF/TrkB通路在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中受到廣泛的關(guān)注。TrkB是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白酪氨酸激酶受體家族的一員，其在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮著重要作用[15]。本研究結(jié)果顯示，與損傷+保護(hù)組比較，抑制保護(hù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增高，Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高而B(niǎo)cl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低;提示硫化氫減輕同型半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡與BDNF/TrkB通路有關(guān)。

綜上所述，本文為H2S拮抗Hcy神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究提供了理論基礎(chǔ)，但是還需要在未來(lái)的研究中更加深入地進(jìn)行探索。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 薛聰，謝方，趙云.應(yīng)激性認(rèn)知障礙小鼠腦內(nèi)同型半胱氨酸的代謝變化研究[J].軍事醫(yī)學(xué)，2021，45（5）：348-353.

[2] 魏海軍，張慶麗，王玥.硫化氫對(duì)阿爾茨海默病的保護(hù)作用研究進(jìn)展[J].湖南生態(tài)科學(xué)學(xué)報(bào)，2021，8（1）：89-94.

[3] 李國(guó)風(fēng)，張勤增，解麗君.硫化氫對(duì)局灶性腦缺血損傷大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡的影響[J]. 河北醫(yī)藥，2020，42（8）：1135-1139.

[4] 段周芳，吳丹丹，趙丹.老年癡呆患者同型半胱氨酸、硫化氫水平及臨床意義[J].四川解剖學(xué)雜志，2020，28（3）：137-138.

[5] Kumar M，Sandhir R. Hydrogen sulfide attenuates hyperhomocysteinemia-induced mitochondrial dysfunctions in brain[J].Mitochondrion，2020，50：158-169.

[6] 賈強(qiáng)，李焱，劉小粉.硫化氫對(duì)糖尿病大鼠空間學(xué)習(xí)記憶和海馬組織氧化應(yīng)激的影響[J]. 蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2020，45（4）：447-451.

[7] Tabassum R，Jeong NY.Potential for therapeutic use of hydrogen sulfide in oxidative stress-induced neurodegenerative diseases[J].Int J Med Sci，2019，16（10）：1386-1396.

[8] 張書(shū)虎，李靜，馬蘭.硫化氫代謝與神經(jīng)保護(hù)作用[J].中華老年多器官疾病雜志， 2019，18（4）：308-312.

[9] 馬瑞松，江洪，李元紅.青蒿素抑制心肌缺血再灌注中的細(xì)胞凋亡[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2016，44（7）：919-922.

[10] 呂書(shū)博，張展，趙德華. 苯丙酮尿癥大鼠海馬神經(jīng)元損傷及其與BDNF/TrkB通路的關(guān)系[J]. 東南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2019，38（3）：461-466.

[11] 薛夢(mèng)，黃誠(chéng). BDNF/TrkB信號(hào)通路與神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)系研究[J]. 贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2020，40（1）：14-19.

[12] 趙彬，唐強(qiáng)，朱路文. 豐富環(huán)境對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/酪氨酸蛋白激酶受體信號(hào)通路的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2019，25（12）：1418-1424.

[13] 林玲，劉國(guó)良，楊麗娜. 西紅花苷基于BDNF-TrkB信號(hào)通路改善阿爾茨海默癥大鼠的學(xué)習(xí)記憶[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2019，35（5）：528-534.

[14] 徐夢(mèng)穎，邱頤.腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在神經(jīng)退行性疾病中的作用[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2021，53（5）：550-554.

[15] 李越峰，司昕蕾，牛江濤.腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其酪氨酸激酶受體B信號(hào)通路在神經(jīng)性疾病研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2021，37（9）：1121-1125.

（收稿日期：2021-06-08）