董佳藝 陳斯?jié)?邵麗娟 宋明瀚

廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科（廣州 510000）

近年來腫瘤免疫細胞治療無耐藥性、毒副作用少、療效顯著。過去十年見證了新型腫瘤免疫精準靶向療法CAR-T細胞，開創(chuàng)了腫瘤治療新路徑。CAR-T細胞療法已被批準用于血液腫瘤的治療，但在實體瘤中的作用仍不盡人意，因此，許多研究通過探索聯合治療來提高實體瘤CAR-T治療療效。除放療、化療、靶向藥物、細胞因子、腫瘤疫苗和溶瘤病毒，近年許多團隊不斷探索CAR-T細胞新的聯合方法，免疫調節(jié)劑。臨床前及臨床研究表明，合理的腫瘤免疫聯合治療，可誘導更多免疫細胞到腫瘤微環(huán)境，并持續(xù)活化，產生持續(xù)抗腫瘤反應；CAR-T細胞接受長期抗原刺激會出現耗竭現象，這一現象在實體腫瘤模型中表現更顯著，免疫調節(jié)劑可減少T細胞耗竭，從而增強療效。

本文將首先介紹CAR-T背景，進一步綜述目前CAR-T細胞聯合免疫調節(jié)劑的臨床前及臨床研究，包括免疫檢查點抑制劑、干擾素基因刺激物激動劑、來那度胺，并對其現狀、真實特性、機制展開綜述，最后討論其未來前景和挑戰(zhàn)。

1 CAR-T細胞療法

目前CAR-T細胞已經歷五代。第一代CAR-T細胞在T細胞基礎上嵌入特異性抗原識別的跨膜結構域，因其缺乏共刺激信號，無法完全激活抗腫瘤活性，有持久性欠佳、體內擴增不良缺點。第二代CAR-T細胞引入了共刺激結構域和誘導共刺激因子，克服T細胞持久性低和腫瘤定位差等問題，是當前主流CAR-T細胞，有較多的臨床研究數據支持，且穩(wěn)定性高、制備工藝成熟。第三代CARs在共刺激結構域上加入兩種信號序列，但會降低T細胞刺激閾值，細胞因子過量分泌產生毒副反應，不足以提升效果。在第二代的基礎上加入誘導釋放肝素酶或細胞因子（主要為IL-12），重塑腫瘤免疫微環(huán)境，形成了第四代CAR-T，提高治療效率。第五代CARs的基礎也是第二代，添加IL-2受體β片段，防止終末分化，重建免疫系統(tǒng)，但其安全性和有效性有待證實。為了降低腫瘤復發(fā)率有研究者設計了CD19/CD20雙靶CAR-T細胞［1］，以及實體瘤對雙靶CAR-T細胞反應的數學模型，理論證明了腫瘤細胞在免疫抑制的情況下，雙靶CAR-T細胞可提高療效［2］。

2 CAR-T聯合免疫檢查點抑制劑

免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）通過阻斷免疫檢查點通路，逆轉T細胞的耗竭狀態(tài)、免疫逃逸現象，增強機體抗腫瘤能力。目前主要免疫檢查點包括程序性死亡受體1（programmed cell death receptor1，PD-1）、程序性死亡配體1（programmed cell death-ligand1，PD-L1）和細胞毒T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T lymphocyte associated protein4，CTLA-4）。

2.1 PD-1抑制劑 回輸CAR-T細胞并使用PD-1抑制劑，是最早、最廣泛的聯合方法。早在2013年研究團隊［3］已證明PD-1抑制劑聯合CAR-T細胞使髓樣抑制細胞（MDSC）的百分比降低，增強對同基因小鼠模型乳腺癌細胞的殺傷作用；二者聯合使抗HER2陽性乳腺癌細胞的細胞毒性由39.85%升高至49.5%，誘導CAR-T細胞擴增，增加IL-2和IFN-γ分泌［4］；也可克服HER2陽性/PD-L1陽性乳腺癌曲妥珠單抗耐藥［5］。膠質母細胞瘤相關研究表明，PD1抑制劑激活靶向抗原后可增加anti-HER2-CAR-T細胞活化，進而增強療效［6］。在甲狀腺癌方面，PD-1抑制劑聯合靶向ICAM1的CAR-T細胞可促進PD-L1表達的腫瘤集落快速清除，延長小鼠總生存期（OS）［7］。前列腺癌研究中，PD-1抑制劑對anti-hPSMA-CAR-T細胞殺傷功能有直接影響，使腫瘤內CD3+T細胞密度增加約13倍，提高其活化、增殖和效應功能［8］。在宮頸腫瘤方面，5只小鼠接受GPC1特異性mCAR-T細胞與PD-1抑制劑聯合治療后，其中2只表現為腫瘤完全根除，且無不良反應［9］，該研究使用宮頸鱗狀細胞癌為腫瘤模型，未來可以選擇其他表達GPC1的腫瘤模型，進一步探索CAR-T聯合ICIs的療效。2021年有團隊對惡性胸膜相關腫瘤進行臨床研究，在證明PD-1阻斷可增強小鼠CAR-T細胞功能后，18例惡性胸膜間皮瘤患者也安全接受了PD-1抑制劑治療，這些患者OS為23.9個月，8例患者病情穩(wěn)定（SD）持續(xù)6個月以上，2例患者PET-CT顯示完全代謝反應，表明胸腔灌注靶向間皮素的CAR-T細胞聯合PD-1抑制劑治療惡性胸膜瘤安全有效［10］，在此臨床實驗中，另外入組有1例轉移性非小細胞肺癌和1例表皮生長因子受體2陰性的乳腺癌患者，這些惡性胸膜疾病患者未使用PD-1抑制劑聯合治療，未來可以探索其他惡性胸膜疾病使用CAR-T細胞聯合PD-1抑制劑的安全性及有效性。

“外源性”PD-1抑制劑因導致自身反應性T細胞激活而增加了免疫抑制相關毒性，為克服這一點，研究團隊探索“內源性”聯合方式，為CAR-T細胞實體腫瘤聯合治療提供了安全、有效的新策略。其一，將編碼PD-1抑制劑的序列構建到載體中，得到自身分泌PD-1抗體的CAR-T（CAR.αPD1-T）細胞，并通過異種移植小鼠模型試驗證實CAR。αPD1-T細胞在腫瘤、血液和脾臟中高速擴增，延長小鼠OS［11］，在毒性最小的情況下取得了100%ORR和80%CR［12］。其二，CarlJune團隊證明CRISPR工程T細胞對腫瘤患者安全有效后，陸續(xù)有研究證實，PD-1敲除的EGFRvIII特異性CAR-T細胞［13］、PD-1缺失的CD19特異性CAR-T細胞［14］、PD-1破壞的間皮素特異性CAR-T細胞［15］分別在EGFRvIII陽性膠質母細胞瘤細胞、CD19陽性K562白血病細胞、三陰乳腺癌細胞中增強細胞毒性，使CAR-T細胞PD-1表達減少，并分泌更多細胞因子，避免免疫抑制，提高體內外抗腫瘤活性，降低腫瘤復發(fā)率。另外，在T細胞表面過表達截斷胞內信號段的PD-1受體或重組PD-1蛋白是免疫療法組合新類型，這種組合方式需要進一步探索。

本研究小組評估了PD-1基因敲除anti-MUC1-CAR-T細胞治療晚期非小細胞肺癌的安全性（NCT03525782），這是首次嘗試使用PD-1基因敲除技術治療實體瘤。報告中包括6例患者的數據，CAR-T細胞輸注后2周內，所有患者癥狀明顯改善，回輸后血清CYFRA21水平下降，回輸4周后升高。其中2例患者肺部病灶在治療后4周內明顯縮?。?例從25 mm×19 mm×22 mm減少到14 mm×10 mm×26 mm）。雖然有3例患者細胞因子水平升高，但未觀察到細胞因子釋放綜合征（CRS），數據表明PD-1基因敲除是安全的，且耐受性良好。但聯合治療的療效具有病例特異性，表現為一些NSCLC患者反應良好，而在其他患者中沒有觀察到明顯的反應［16］。

2.2 PD-L1抑制劑 CAR-T細胞激活會導致腫瘤細胞PD-L1表達增多，從而導致自身功能下降，現已證實，淋巴細胞清除后，CAR-T細胞聯合抗PD-L1可改善CAR-T細胞介導的腫瘤免疫反應，增強抗腫瘤作用［17］。2021年有團隊將CAR-T細胞和PD-L1抗體修飾的血小板以及包載IL-15的納米顆粒同時裝載進一個生物相容性較好的可植入水凝膠中，CAR-T細胞因水凝膠緩釋作用得到可控釋放，避免了快速釋放引起細胞失活，同時可釋放IL-15維持細胞活性，并在特定條件下觸發(fā)血小板的激活釋放PD-L1抗體阻斷PD-L1，增強CAR-T細胞殺傷能力，抑制癌癥復發(fā)［18］。間充質干細胞（MSCs）遞送并產生功能性病毒以感染和裂解肺腫瘤細胞，同時通過釋放IL-12和PD-L1抗體增強CAR-T細胞抗腫瘤活性及其細胞因子分泌功能［19］。

2.3 CTLA-4抑制劑 CTLA-4是T細胞表面表達的免疫蛋白，其阻斷會引起淋巴細胞增殖，抑制腫瘤生長，提高生存率，為免疫檢查點免疫抑制性抗腫瘤治療提供理論依據。2021年，伊匹木單抗（Ipilimumab）被國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）批準上市，成為我國第一且唯一正式獲批的CTLA-4抑制劑。

為改善CAR-T細胞功能，有團隊制備了mRNA編碼硫酸軟骨素蛋白聚糖4（CSPG4）和小干擾RNA（siRNA）的特異性CAR-T細胞，以下調PD-1和CTLA-4，增強了體外CAR-T細胞功能增強，為黑色素瘤免疫治療提供了新思路［20］。同為ICIs，CTLA-4抑制劑與PD-1抗體解除免疫抑制作用不同，有研究發(fā)現Ipilimumab可使T細胞過度活化［21］，抗體誘導CTLA-4溶酶體降解［22］，導致免疫治療相關不良事件，帶來嚴重副作用。雖然靶向CTLA-4的抗體已廣泛應用于多種實體瘤，聯合治療適應證探索數目眾多，但目前暫未涉及CTLA-4抑制劑與CAR-T細胞聯合治療研究，其聯合治療毒副反應更是不可忽略，若在抗腫瘤免疫治療過程中，“保留”免疫檢查點CTLA-4而非“阻斷”，是否可以不影響治療效果的情況下減少免疫相關毒副作用值得進一步探索。

2.4 其他 B7-H3是一種Ⅰ型膜蛋白免疫檢查點分子，與PD-L1細胞外結構域序列相似，其異常高表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展、免疫逃逸、不良預后有關。

B7-H3在非小細胞肺癌中過表達，B7-H3特異性CAR-T細胞有效控制NSCLC生長，其與CCL2趨化因子/CCR2趨化因子受體軸相結合，增強抗腫瘤活性［23］。B7-H3是CAR-T細胞治療脊索瘤的潛在靶點，B7-H3-CART細胞識別脊索瘤細胞后可抑制腫瘤形成，增強CAR-T細胞活化和細胞因子分泌［24］。另外研究表明泛組蛋白去乙?；敢种苿?5］、分次輻照（FIR）［26］可增強B7-H3-CART細胞的抗腫瘤活性。目前有B7-H3-CART治療惡性皮膚腫瘤單臂臨床研究正在招募中，但暫無B7-H3抑制劑聯合CAR-T細胞的臨床研究。

3 CAR-T聯合干擾素基因刺激物激動劑

干擾素基因刺激物（stimulator of interferon gene，STING）是一種免疫調節(jié)因子，通常處于自我抑制狀態(tài)，受到配體刺激引起構象變化而激活，介導干擾素調節(jié)轉錄因子IRF3磷酸化，誘導產生Ⅰ型干擾素和促炎細胞因子，使腫瘤免疫細胞活化，有研究［27］表明STING激動劑可促進黑色素瘤微環(huán)境中的血管正?；腿壛馨徒Y構形成，STING激動劑還可增強腫瘤特異性CD8+T細胞的運輸和激活以有效抑制胰腺癌進展［28］，2022年1月，新型小分子STING激動劑已獲批靜脈輸注給藥治療晚期實體瘤并開展臨床研究，為腫瘤免疫治療帶來新的希望。

STING激動劑聯合Th/Tc17-CAR-T細胞通過介導免疫刺激和抑制之間的平衡，增強CAR-T細胞持久性，促進其轉運，STING通路在ICIs的作用下，將“冷”腫瘤轉化為“熱”腫瘤［29］，在使用STING激動劑的Th/Tc17-CAR-T細胞中添加PD-1抑制劑和GR-1抑制劑才能實現持續(xù)的腫瘤消退，加入PD-1抑制劑克服耗竭（內部修飾），使用GR-1抑制劑消除抑制骨髓細胞（外部修飾）導致腫瘤持續(xù)緩解，與未接受抗GR-1治療對照組相比，接受抗GR-1 mAb的小鼠CCL2、G-CSF和IL-6顯著增加［30］。該研究為CAR-T細胞聯合GR-1抑制劑等其他藥物提供了新的思路，同時在未來研究中須謹慎其聯合所帶來的相關毒副作用。

2020年有團隊得出結論，Mn2+以cGAS-STING依賴的方式極大地促進樹突狀細胞和巨噬細胞的成熟、抗原遞呈，增強CD8+T細胞分化、NK細胞活化，在接受腫瘤皮下種植后，Mn2+缺乏小鼠的腫瘤發(fā)生率增高7倍，且靜脈接種會誘導更強的肺轉移，Mn2+與免疫檢查點抑制協(xié)同提高抗腫瘤功效，降低小鼠所需的PD-1抗體劑量，并且文章提到在一項晚期轉移性實體瘤Ⅰ期臨床試驗初步結果表明，Mn2+具有良好的免疫增強作用：20名患者（90.9%）的疾病得到持久控制，其中包括10例患者（45.5%）被評估為PR，其中8例PD-1抗體抵抗的患者有6例實現了部分緩解（PR），2例疾病穩(wěn)定（SD），同時有6例患者盆腔粘連得到改善，Mn2+可改善免疫原性低（冷腫瘤）或抗PD-1反應低的癌癥患者療效［31］。Mn2+與免疫治療聯合使用值得進一步探索，其與CAR-T療法聯合也將成為可能，但神經毒性不容忽視。

4 CAR-T聯合其他免疫調節(jié)劑

來那度胺的免疫調節(jié)作用包括：通過免疫調控促進T細胞、NK細胞功能、增加NKT細胞數量、增強IFN-γ的分泌、抑制單核細胞促炎細胞因子釋放、直接增強抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用［32］；其次，可激活胞內Notch信號傳導、旁分泌IL-2，增強PD-1阻斷和腫瘤內CD8+T細胞活化，從而改善腫瘤免疫微環(huán)境［33］。

早在2015年，研究［34］表明來那度胺通過增強CAR-T和抗原呈遞細胞的免疫突觸來提高對神經膠質瘤細胞的殺傷作用。2018年研究［35］發(fā)現CS1-CAR-T細胞聯合來那度胺，可誘導分泌更多Th1細胞因子，增強CAR-T細胞記憶維持、免疫突觸形成和細胞毒性，提高多發(fā)性骨髓瘤療效。目前來那度胺聯合CAR-T治療實體瘤的研究甚少，其聯合治療實體瘤相關機制值得進一步探索，且有望為實體瘤治療困境提供新的突破。

5 總結與展望

CAR-T細胞治療面臨許多機遇和挑戰(zhàn)，CAR結構的不斷優(yōu)化、新靶點的不斷探索，CAR-T細胞治療將得到更廣泛的臨床應用，為CAR-T聯合治療鋪墊良好基礎。在CAR-T細胞培養(yǎng)到患者回輸前這一時間段，患者可接受局部放療提高療效且耐受性良好［36］，這種聯合療法可以預防腫瘤進展，并可能通過放療異位效應增強CAR-T細胞療效［37］，但其最佳放療劑量和放療與CAR-T細胞的治療順序仍待進一步探索?？勾x類化療藥物可增強CAR-T細胞功能［38］，在CAR-T細胞治療前的淋巴清除方案中加入鉑類化療藥奧沙利鉑，可改善腫瘤免疫微環(huán)境［39］。靶向藥物例如BTK抑制劑在CAR-T聯合治療中研究最為廣泛，可改善CAR-T細胞活性，降低嚴重CRS風險［40］。部分細胞因子和共刺激分子已被證明在調節(jié)T細胞的發(fā)育和功能方面發(fā)揮重要作用，可促進CAR-T細胞擴增，增加記憶表型CAR-T細胞提高持久性［41］。CAR-T細胞聯合溶瘤病毒可促進宿主免疫系統(tǒng)對腫瘤相關抗原（TAA）的識別，以基因改造方式增強CAR-T細胞抗腫瘤活性［42］。腫瘤疫苗可使CAR-T細胞快速激活和擴增從而提高療效［43］。

近年，許多團隊不斷探索CAR-T細胞新的聯合方法以克服實體腫瘤治療的不利條件，CAR-T聯合其他免疫相關治療越來越受到關注。結合臨床前和早期臨床觀察結果，CAR-T細胞與免疫調節(jié)劑聯合策略可能為腫瘤治療提供機會，解決實體腫瘤免疫治療相關挑戰(zhàn)，包括腫瘤免疫抑制環(huán)境、腫瘤部位可及性。目前，免疫檢查點抑制劑是許多癌癥免疫治療的基礎，還有干擾素基因激動劑、來那度胺這些新型免疫調節(jié)藥物，為CAR-T聯合治療提供了新的思路。

對于“外源性”聯合來說，大多數研究中受試者接受CAR-T細胞治療后再接受免疫調節(jié)劑，免疫調節(jié)劑的最佳劑量、合理的給藥間歇和給藥順序都需要進一步明確，其條件和相應機制也尚不清楚。免疫調節(jié)劑不同的給藥方式及其對CAR-T細胞的影響和藥物聯合使用內在機制同樣需要我們在未來得出結論。對于“內源性”聯合，CAR-T細胞靶點和免疫檢查點阻斷這種組合相比于“外源性”是否可能更有效地促進抗腫瘤治療，仍需要進一步探索。對于患者來講，第一，聯合治療可能增加治療成本，如何減少成本而達到最優(yōu)治療需要在實踐中總結經驗；第二，聯合治療可能增加藥物毒副作用，其毒副反應需要實踐記錄，有文獻表明ICIs相關內分泌反應較為常見［44］，其中包括爆發(fā)型的糖尿病癥狀和嚴重的糖尿病酮癥酸中毒為首發(fā)癥狀的ICIs介導型糖尿?。?5］，聯合治療是否會加重其內分泌相關毒副反應需得到足夠的臨床關注，其潛在機制和治療措施也需要進一步實踐探索；第三，對于新型免疫調節(jié)劑的聯合使用，其耐藥性和長期療效需要進一步探索。

CAR-T療法在實體瘤治療方面得到越來越多的關注，其聯合治療更是在近些年頗受關注。在未來，將會有越來越多基于CAR-T聯合治療的臨床試驗，將提供豐富的數據，為開發(fā)有效的CAR-T聯合治療提供思路。