田 微，方妍雅，柳海星，李鐘淑

(延邊大學農(nóng)學院，延吉 133000)

卵巢氧化應激通過影響卵母細胞發(fā)生、卵泡發(fā)育、卵泡成熟和卵泡破裂等影響卵母細胞質(zhì)量及早期胚胎發(fā)育，最終導致雌性生殖機能下降[1]。卵巢中活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生會引起氧化應激，從而影響卵母細胞質(zhì)量和輔助生殖技術(ART)的結(jié)果。建立哺乳動物早期胚胎體外培養(yǎng)體系是人工輔助生殖技術的關鍵，如何獲得大量且優(yōu)質(zhì)的胚胎是研究的熱點問題。小鼠作為實驗動物，在人工輔助生殖技術中發(fā)揮著重要作用。如何通過提高小鼠體外發(fā)育囊胚率而增加胚胎體外發(fā)育能力，是研究早期胚胎體外發(fā)育的重點。因此，建立相關氧化應激模型對開展該方面研究具有重要意義。

3-硝基丙基酸(3-nitroponic acid,3-NPA)能誘導線粒體產(chǎn)生和釋放ROS，從而致使線粒體DNA發(fā)生損壞，進而線粒體功能會受到很大的影響[2]。細胞內(nèi)三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，ATP)的產(chǎn)生主要發(fā)生在線粒體，線粒體的形態(tài)和位置發(fā)生改變出現(xiàn)在胚胎早期發(fā)育時期，線粒體氧化磷酸化能力被異常的線粒體分布所影響，線粒體內(nèi)發(fā)生一系列異常變化而影響早期胚胎的發(fā)育。3-NPA是一種在動物生產(chǎn)中較為常見的對動物體有毒性的化合物，可誘導氧化應激從而降低生產(chǎn)力。研究表明，利用3-NPA構(gòu)建小鼠氧化應激模型，具有時間短(7 d)、操作簡單、效果顯著等優(yōu)點。張家慶[3]、王慧瑞等[4]研究結(jié)果表明，連續(xù)7 d、每天2次給小鼠注射12.5 mg/kg 3-NPA可使小鼠卵巢達到氧化應激狀態(tài)，從而產(chǎn)生氧化應激的早期胚胎，在早期胚胎體外培養(yǎng)液中加入抗氧化劑可以調(diào)節(jié)線粒體損傷引起的氧化應激。說明在胚胎體外培養(yǎng)液中加入抗氧化劑是抵抗氧化劑引起的氧化應激最直接有效的方法之一。

堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一種在細胞體外培養(yǎng)增殖、誘導分化以及體外組織再生領域均有較大應用潛力的生長因子之一[5]。研究表明，bFGF可通過提高超氧化物歧化酶的活性，增強對ROS的清除能力，在胚胎及細胞中發(fā)揮重要的作用[6]。據(jù)相關文獻顯示，bFGF具有一定的對抗氧化應激的作用[7]，但bFGF在動物生殖系統(tǒng)特別是在卵母細胞和早期胚胎體外發(fā)育中的具體作用仍不清楚。本試驗擬通過在體外培養(yǎng)液中添加bFGF，探討bFGF對3-NPA處理的小鼠受精卵體外發(fā)育的影響，以期為提高氧化應激早期胚胎體外發(fā)育質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 本試驗中使用的繁殖雄鼠：7～8周齡、健康(單籠飼養(yǎng)，種用壽命為半年)、體重25 g以上；雌鼠：6～8周齡、體重25 g以上；均達到性成熟，均購自延邊大學動物實驗中心。在室內(nèi)光暗周期為12 h∶12 h、溫度為22～23 ℃的環(huán)境中飼養(yǎng)，保持良好通風。

1.1.2 主要試劑及儀器 CZB-HEPES、透明質(zhì)酸酶(Hy)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)均購自Sigma公司；JC-1、ROS(DCFH-DA)和谷胱甘肽(GSH)(CMF2HC)均購自Thermo Fisher Scientific公司；孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)均購自寧波第二激素廠；bFGF購自Sino Biological公司；KSOM培養(yǎng)液購自南京愛貝生物公司。體視顯微鏡(TMS)和熒光顯微鏡(Lecia DM IRB)均購自Nikon公司；CO2培養(yǎng)箱(TH3111)購自ESCO公司。

1.2 方法

1.2.1 受精卵的采集 采用PMSG-hCG法對挑選的6～8周齡雌鼠進行超數(shù)排卵，即于第1天注射0.1 mL(10 IU) PMSG促進小鼠卵母細胞成熟，48 h后注射0.1 mL(10 IU) hCG誘導小鼠排卵，注射hCG后立即與成年公鼠1∶1合籠，在合籠20 h后采用頸部脫臼處死小鼠，無菌手術摘取輸卵管，放入已經(jīng)預平衡的CZB-HEPES中，體視顯微鏡下劃破輸卵管膨大部，收集受精卵。將受精卵移入0.1%透明質(zhì)酸酶中消化2 min，吹打以去除卵丘細胞，將受精卵在CZB-HEPES中洗3次，收集含有雙原核的受精卵。

1.2.2 最佳bFGF濃度篩選 將雙原核受精卵放入已經(jīng)預平衡的KSOM培養(yǎng)液中。 KSOM中分別添加0、20、50、100和150 ng/mL bFGF，于37.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)的24、48和96 h觀察胚胎發(fā)育情況，并統(tǒng)計2-細胞率、4-細胞率和囊胚率，篩選出最佳bFGF處理濃度，以用于后續(xù)試驗。

1.2.3 3-NPA氧化應激處理及受精卵的分組 小鼠適應飼養(yǎng)1周后，經(jīng)腹腔注射12.5 mg/kg 3-NPA，2次/d，注射7 d，構(gòu)建小鼠卵巢氧化應激模型[3]。3-NPA注射7 d后按照1.2.1的方法進行超數(shù)排卵、合籠及受精卵收集。將受精卵分為對照組(C)、bFGF組、3-NPA組和3-NPA+bFGF組，其中對照組和bFGF組為正常組小鼠的受精卵，3-NPA組和3-NPA+bFGF組為體內(nèi)注射3-NPA小鼠的受精卵。 在體外培養(yǎng)時，bFGF組和3-NPA+bFGF組KSOM培養(yǎng)液中添加100 ng/mL bFGF，對照組和3-NPA組KSOM培養(yǎng)液中不添加bFGF，胚胎分別用相應培養(yǎng)液清洗3次后移入各組培養(yǎng)液微滴中，于37.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，得到的囊胚用于ROS、GSH和線粒體膜電位檢測。

1.2.4 ROS水平的檢測 將1.2.3獲得的囊胚在PVA中洗3次，然后轉(zhuǎn)移到DCFH-DA微滴中。 放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育15 min，再用PVA洗3次，在熒光顯微鏡綠色熒光下拍照。操作全過程應避光進行。用ImageJ 1.48軟件進行量化分析，每組試驗重復5次。

1.2.5 GSH水平的檢測 將1.2.3獲得的囊胚在PVA中洗3次，然后轉(zhuǎn)移到CMF2HC微滴中。 放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育20 min，再用PVA洗3次，在熒光顯微鏡藍色熒光下拍照。 操作全過程應避光進行。用ImageJ 1.48軟件進行量化分析，每組試驗重復5次。

1.2.6 線粒體膜電位的檢測 將1.2.3獲得的囊胚在PVA中洗3次，然后轉(zhuǎn)移到JC-1的微滴中。放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育25 min，再用PVA洗滌3次，在熒光顯微鏡紅色、綠色熒光下拍照，通過紅/綠熒光強度的比例來衡量線粒體膜電位強度。操作全過程應避光進行，用ImageJ 1.48軟件進行量化分析處理，每組試驗重復5次。

1.3 統(tǒng)計分析

用SPSS 16.0進行單因素方差分析，用LSD檢驗進行組間多重比較，結(jié)果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 最佳bFGF濃度篩選

由表1可知，各組2-細胞率無顯著差異(P>0.05)，150 ng/mL bFGF組4-細胞率和囊胚率均顯著低于其他組(P<0.05)，100 ng/mL bFGF組囊胚率顯著高于其他組(P<0.05)。因此，小鼠胚胎的最適bFGF處理濃度為100 ng/mL。

表1 各組小鼠早期胚胎體外培養(yǎng)的發(fā)育率

2.2 bFGF對3-NPA處理的小鼠受精卵體外發(fā)育的影響

由表2可知，各組間2-細胞率差異均不顯著(P>0.05)，3-NPA組4-細胞率顯著低于其他組(P<0.05)，bFGF組囊胚率顯著高于其他組(P<0.05)，3-NPA+bFGF組與對照組4-細胞率和囊胚率差異均不顯著(P>0.05)，且均顯著高于3-NPA處理組(P<0.05)。

表2 bFGF對3-NPA處理的小鼠受精卵體外發(fā)育的影響

2.3 bFGF對3-NPA處理的小鼠囊胚ROS水平的影響

由圖1可知，與對照組相比，3-NPA組ROS水平顯著升高(P<0.05)。3-NPA+bFGF組與對照組差異不顯著(P>0.05)，并均顯著低于3-NPA組(P<0.05)。

①A，DCHFDA染色結(jié)果(100×)；B，量化結(jié)果。②a～d，分別代表C、bFGF、3-NPA和3-NPA+bFGF組。圖2同

2.4 bFGF對3-NPA處理的小鼠囊胚GSH水平的影響

由圖2可知，與對照組相比，3-NPA處理組的GSH水平顯著降低(P<0.05)，bFGF組GSH水平顯著高于其他各組(P<0.05)；3-NPA+bFGF處理組與對照組差異不顯著(P>0.05)，且顯著高于3-NPA組(P<0.05)。

A，DCHFDA染色結(jié)果(100×)；B，量化結(jié)果

2.5 bFGF添加對3-NPA處理的小鼠囊胚中線粒體膜電位水平的影響

由圖3可知，與對照組相比，3-NPA組線粒體膜電位水平顯著降低(P<0.05)，bFGF組線粒體膜電位顯著增加(P<0.05)。3-NPA+bFGF組與對照組線粒體膜電位差異不顯著(P>0.05)，并均顯著高于3-NPA組(P<0.05)。

A，JC-1染色結(jié)果(100×)；B，量化結(jié)果

3 討 論

為了探究bFGF對3-NPA處理的小鼠受精卵體外發(fā)育能力的影響，本試驗檢測了不同濃度bFGF(0、20、50、100和150 ng/mL)對小鼠受精卵分裂率和囊胚率的影響。試驗結(jié)果表明，在3-NPA處理的小鼠受精卵體外培養(yǎng)液中添加100 ng/mL bFGF可以顯著提高囊胚率。研究表明，ROS和抗氧化物存在于卵泡液和輸卵管中，在母鼠妊娠時期，氧化應激可直接調(diào)控發(fā)育相關基因的表達或通過間接氧化損傷細胞中的脂類和蛋白等成份，從而對胚胎發(fā)育和受孕造成嚴重危害[8-9]。本研究在培養(yǎng)液中添加bFGF可以降低胚胎發(fā)育過程中ROS的產(chǎn)生，從而提高小鼠受精卵的體外發(fā)育能力，這與毛挺挺等[10]研究結(jié)果一致。

已有研究表明，氧化劑3-NPA能特異地提高卵母細胞和顆粒細胞中ROS的水平，從而引起顆粒細胞凋亡與卵泡閉鎖[11]。有研究報道，在卵母細胞和胚胎中產(chǎn)生過量的ROS會導致其發(fā)生氧化應激，卵母細胞和早期胚胎發(fā)育能力也會降低，在壁顆粒細胞和卵丘顆粒細胞中產(chǎn)生過量的ROS也會降低受精率和胚胎質(zhì)量。此外，ROS還參與早期胚胎發(fā)育阻滯，如小鼠2-細胞胚胎發(fā)育阻滯與ROS的升高密切相關[12]。bFGF作為抗氧化修復劑能夠促進多種神經(jīng)細胞的增殖和分化[13]。本試驗結(jié)果表明，與3-NPA組相比，bFGF+3-NPA組顯著降低3-NPA處理小鼠囊胚ROS水平，說明bFGF能夠克服3-NPA誘導小鼠早期胚胎氧化應激并增強了胚胎的體外發(fā)育能力。GSH帶有的巰基(-SH)通過抗氧化作用能夠清除內(nèi)源和外源性有害物質(zhì)對細胞的損傷[14]。同時，它在新陳代謝和調(diào)節(jié)全身穩(wěn)態(tài)所必需的途徑方面也具有至關重要的作用[15]。在體外培養(yǎng)過程中，胚胎內(nèi)的GSH水平與細胞增殖、胚胎成熟發(fā)育等過程相關[16]。本研究結(jié)果表明，與3-NPA組相比，bFGF+3-NPA組顯著提高了3-NPA處理小鼠囊胚的GSH水平，說明bFGF減輕了3-NPA處理小鼠胚胎的氧化應激并提高了胚胎的抗氧化能力。將不同試驗組GSH與ROS水平比較發(fā)現(xiàn)，其處于一個動態(tài)平衡的過程，即胚胎內(nèi)GSH水平高時其ROS水平較低。對排卵前卵泡的研究表明，F(xiàn)SH可以抑制培養(yǎng)48 h卵泡中GSH水平的下降,FSH誘導的GSH增加與谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM)蛋白水平的增加和ROS產(chǎn)生的抑制有關[17]。本試驗結(jié)果說明，在體外培養(yǎng)液中添加100 ng/mL bFGF可以有效提高3-NPA處理的小鼠囊胚GSH水平，進一步證實bFGF可以通過維持胚胎內(nèi)GSH水平對抗氧化損傷，從而提高小鼠早期胚胎體外發(fā)育的能力。

3-NPA能夠抑制細胞線粒體功能，從而導致細胞缺乏ATP[18]，還可誘導線粒體產(chǎn)生和釋放ROS，從而發(fā)生氧化應激[19]。線粒體通過氧化磷酸化產(chǎn)生供細胞周期分裂和代謝等生命活動所需的能量，參與ROS引起的細胞凋亡過程，調(diào)節(jié)細胞氧化應激，是消耗細胞內(nèi)氧化物的主要場所，影響細胞的新陳代謝和生長，在胚胎發(fā)育的各個時期均起重要作用。早期胚胎發(fā)育的阻滯與早期細胞部分凋亡的現(xiàn)象均與線粒體功能障礙有關，發(fā)育的阻滯與早期凋亡會導致早期胚胎發(fā)育能力的降低[20]。胚胎內(nèi)線粒體膜電位水平與胚胎的發(fā)育能力成正相關，即膜電位水平增高則胚胎的發(fā)育能力增強。本試驗結(jié)果表明，100 ng/mL bFGF顯著提高了3-NPA處理小鼠囊胚期胚胎的線粒體膜電位水平。說明在體外培養(yǎng)液中添加100 ng/mL bFGF可以有效維持3-NPA處理小鼠囊胚的線粒體膜電位穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在小鼠受精卵體外培養(yǎng)液中添加100 ng/mL bFGF可以提高3-NPA誘導的小鼠受精卵的4-細胞率及囊胚率，顯著提高囊胚的GSH和線粒體膜電位水平，降低ROS水平，從而提高氧化應激早期胚胎體外發(fā)育的能力。