張利環(huán)，賈 浩，張若男，王燕飛，劉 璇

(山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，太谷 030801)

世界衛(wèi)生組織將益生菌定義為在體內(nèi)定植達到一定數(shù)量時可使機體受益的活性微生物[1]，其中干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌與雙歧桿菌被統(tǒng)稱為“健康三益菌”，常用作食品添加劑[2]。研究表明，益生菌可以增加腸道中的有益菌，調節(jié)腸道健康[3]。益生菌代謝還是刺激上皮細胞增殖和分化的能源，通過刺激肽和緊密連接蛋白的產(chǎn)生來發(fā)揮抗菌作用，維持腸道屏障內(nèi)微生物穩(wěn)態(tài)[4]。在集約化的肉雞養(yǎng)殖中，腸道炎癥是導致肉雞生產(chǎn)性能下降甚至死亡的主要原因之一。腸道炎癥會促進黏膜氧化應激，引起腸道微環(huán)境變化，導致有益細菌種類數(shù)量減少，而致病菌種類相對增多[5]。雛雞腸道微生物的首要來源為蛋殼和飼料中的微生物群，剛孵化的雛雞補充益生菌后，盲腸會被兼性需氧菌定植，這些細菌可消耗腸道內(nèi)氧氣且產(chǎn)生大量有機酸，導致腸道pH變低，從而抑制致病菌的生長和定植，改善腸道炎癥[6-7]。研究表明，乳桿菌可增加肉雞腸道中乳酸菌和雙歧桿菌屬等有益菌，減少大腸桿菌等致病菌，改善宿主的腸道微生物組成，降低死亡率[8-10]。Hong等[11]研究表明，補充2.0×1010CFU/g芽孢桿菌可增加厚壁菌門豐度，促進肉雞生長。張李榮等[12]研究發(fā)現(xiàn)，雛雞飼料中添加乳雙歧桿菌后，可通過改善盲腸微生物的組成結構來提高生長性能。因此，可通過在雛雞飲食中添加適量益生菌來調控雛雞腸道微生物群的組成、降低致病菌的數(shù)量，改善其生長性能[13]。近年來研究顯示，干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌對肉雞生長有益，然而3種益生菌的混合物對肉雞腸道微生物群的影響尚不清楚。因此，本研究將幼齡黃麻肉雞作為研究對象，探討復合益生菌對肉雞生長性能及腸道微生物區(qū)系的影響，以期為復合益生菌在肉雞生產(chǎn)中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與動物飼養(yǎng)

“健康三益菌”(干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌)凍干菌粉購自陜西瑞茂生物科技有限責任公司，按1∶1∶2的劑量比例配制成復合菌，有效活菌數(shù)>3.4×109CFU/g。將200只1日齡雄性黃麻肉雞隨機分為2組，每組5個重復，每個重復20只。復合菌制劑按1%比例補充于益生菌組肉雞的飲用水中，以正常飲水的肉雞為對照?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。飼喂周期為42 d。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平

肉仔雞皆按規(guī)定接種疫苗，采用3層立籠式飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學生命科學院動物房，每天上午08:00和下午20:00定時飼喂，雞舍整潔且定期消毒，試驗過程中雞舍內(nèi)保持24 h光照，確保肉雞正常采食和飲水。室溫從育雛第1周的33 ℃每日降低1 ℃，降至23℃結束。相對濕度第1周為65%～70%，之后降至60%左右保持不變。每天記錄各組肉雞的采食量。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 生產(chǎn)性能 飼喂結束前12 h，肉雞停止進食，但可繼續(xù)自由飲水，各組肉雞以重復單位稱取體重。根據(jù)試驗期間的記錄統(tǒng)計數(shù)據(jù)，計算肉雞的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。每個處理取40只42日齡肉雞屠宰，分別測定屠宰率和全凈膛率。

1.2.2 腸道菌群高通量測序 斷頸處死抽樣雞后解剖，無菌剪刀沿腹底部向上剖開腹腔，剪切下回腸與盲腸組織，使用無菌鑷子分別從回腸與盲腸中挑取中心內(nèi)容物于無菌離心管中(使用前用液氮預凍)，-80 ℃保存。

腸道內(nèi)容物樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在IlluminaMiSeqPE300系統(tǒng)上進行高通量測序。原始的測序序列通過fastp(v 0.19.6)軟件進行質量過濾，通過FLASH(v 1.2.11)軟件進行拼接。生成的序列通過USEARCH(v 7.0)軟件根據(jù)97%的相似度進行操作分類單元(OTU)聚類，并識別和移除嵌合體序列。 利用RDP classifier(v 11.5)對每條序列進行物種分類注釋，使用置信閾值為70%的QIIME2(v 2020.11)平臺計算門-屬水平上微生物群落的相對豐度。以觀測到的OTU數(shù)為基礎，利用QIIME2算法進行分類信息的注釋，通過7個指數(shù)(包括Sobs、Chao、Shannon、Simpson、Shannoneven、Pd和Coverage)分析樣本的物種豐富度、多樣性、均一性與覆蓋度，并利用QIIME2軟件計算Beta多樣性距離矩陣，基于Bray-Curtis距離進行主坐標分析(PCoA)和相似性分析(ANOSIM)，在OTU水平上比較各樣本微生物區(qū)系的組成，使用R語言(v 2.15.3)進行統(tǒng)計分析和作圖。利用NetworkX軟件進行網(wǎng)絡分析，得到菌群在不同樣本中的共存關系，凸顯樣本之間的相似性和差異性，采用線性判別分析(LDA)對各組差異菌群進行鑒定，以P<0.05和LDA=4用作LEfSe分析的閾值，并利用在線軟件(http:∥huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=lefse_upload)進行非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗。使用PICRUSt(v 1.1.0)軟件通過16S rDNA基因序列預測腸道菌群的功能組成概況，統(tǒng)計Level 3功能類別上的KEGG直系同源物。

1.3 統(tǒng)計分析

生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，高通量測序數(shù)據(jù)采用Wilcoxon秩和檢驗確定各處理間的差異。結果以平均值±標準差表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 復合益生菌對肉雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，與對照組相比，益生菌組肉雞的平均日增重顯著增加(P<0.05)，平均日采食量、屠宰率和全凈膛率增加，料重比降低，但差異均不顯著(P>0.05)。

表2 各組肉雞生產(chǎn)性能

2.2 腸道菌群的Alpha多樣性

測序后通過高質量篩選和去除冗余序列，共獲得1 303 882條高質量序列，分屬于772個OTUs，459種，296屬，160科，98目，41綱，18門。每個樣本觀測到的OTU數(shù)目的稀釋曲線和Core分析均表明本次測序的測序量接近飽和，大部分多樣性已產(chǎn)生，即使增加測序量也很少會有新物種出現(xiàn)(圖1A、1B)。在回腸中，對照組的Sob、Chao、Shannon、Shannoneven、Pd和Simpson指數(shù)分別為154.00、196.51、2.06、0.41、16.54和0.28，益生菌組分別為123.38、171.70、1.43、0.29、12.21和0.44；在盲腸中，對照組分別為278.88、332.66、2.93、0.52、22.51和0.19，益生菌組分別為257.25、313.63、2.96、0.53、21.26和0.17。益生菌組較對照組腸道菌群多樣性有降低趨勢(P>0.05)。此外，盲腸的Sob、Chao、Shannon和Pd指數(shù)顯著或極顯著高于回腸(P<0.05；P<0.01)(圖1C～1H)。所測樣本的Coverage指數(shù)均高于0.99(圖1I)，表明本次測序覆蓋率高。

①A、B，分別為腸道微生物區(qū)系OTU水平的稀釋與核心曲線；C～I，分別為腸道微生物區(qū)系OTU水平的Sob、Chao、Shannon、Simpson、Shannoneven、Pd與Coverage指數(shù)。②CI、CC、PI、PC，分別為對照組回腸、對照組盲腸、益生菌組回腸與益生菌組盲腸。③*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。圖7同

2.3 腸道微生物群落的組成結構

由圖2A可知，在對照組回腸中，厚壁菌門(Firmicutes,92.69%)豐度最高，其次是放線菌門(Actinobacteriota,5.73%)；在盲腸中，厚壁菌門(Firmicutes,97.51%)豐度最高，其次是擬桿菌門(Bacteroidota,2.06%)。與對照組相比，益生菌組回腸厚壁菌門的豐度(98.55%)增加，放線菌門的豐度(0.74%)降低；盲腸厚壁菌門的豐度(98.27%)增加，擬桿菌門的豐度(1.41%)降低。說明厚壁菌門在肉雞腸道菌群中具主體地位，復合益生菌可增加其豐度。

由圖2B可知，在對照組回腸中，乳桿菌屬(Lactobacillus,43.38%)、腸球菌屬(Enterococcus,19.05%)、分節(jié)絲狀菌屬(Candidatus_Arthromitus,8.06%)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia,4.82%)、葡葡萄球菌屬(Staphylococcus,4.77%)等為主要屬；在盲腸中，羅姆布茨菌屬(Romboutsia,28.54%)、未分類的毛螺菌科細菌(unclassified_f__Lachnospiraceae,20.64%)、布勞特氏菌屬(Blautia,12.21%)、罕見小球菌屬(Subdoligranulum,6.54%)等為主要屬。與對照組相比，益生菌組回腸中未見梭菌屬(Lachnoclostridium)，乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬和羅姆布茨菌屬的豐度(8.41%、45.51%和13.09%)增加，腸球菌屬、分節(jié)絲狀菌屬和葡葡萄球菌屬的豐度(18.94%、0.60%和0.93%)降低；益生菌組盲腸中羅姆布茨菌屬與罕見小球菌屬的豐度(28.23%、5.06%)降低，未分類的毛螺菌科與布勞特氏菌屬的豐度(26.71%、13.86%)增加。說明復合益生菌可降低腸道病原菌的豐度。

A、B，分別為在門和屬水平上的腸道微生物組成，豐度<1%的類群被納入“其他”類群

2.4 腸道微生物群落結構差異

由圖3可知，對照組與益生菌組的回腸、盲腸的共有OTUs數(shù)分別為99和197，在對照組回腸、對照組盲腸、益生菌組回腸、益生菌組盲腸中獨有OTUs數(shù)分別為127、42、10和14。益生菌組較對照組回腸、盲腸菌群的OTUs總數(shù)由469、488分別降低至327、466。共線性網(wǎng)絡分析進一步發(fā)現(xiàn)，對照組與益生菌組回腸中各有3個獨有的屬，包括g_Gilliamella、迪茨氏菌屬(Dietzia)、魏斯氏菌屬(Weissella)與乳球菌屬、雞桿菌屬(Gallibacterium)、g_unclassified_o__Lactobacillales；對照組與益生菌組盲腸中分別有9和5個獨有的屬，包括顫桿菌屬(Oscillibacter)、g__Colidextribacter、g__Negativibacillus等與g_Anaerostipes、g__Butyricicoccus、g_Eisenbergiella、g__Tuzzerella等(圖4)。

圖3 腸道微生物的OTU數(shù)目Venn圖

圖4 細菌群落中50個最豐富屬的共線性網(wǎng)絡分析

由圖5可知，第一主成分和第二主成分分別能解釋對照組與益生菌組總差異的42.46%和12.63%。在ANOSIM分析中發(fā)現(xiàn)，R值為0.5705，P<0.001，表明本試驗分組有意義，組間差異顯著大于組內(nèi)差異。

圖5 OTU水平的PCoA分析

為確定各類群從門到屬水平上的特化類群特征，使用LEfSe方法對樣品中的所有有效序列進行分析，在回腸中，共富集了2門、1綱、2目、3科、4屬(圖6A)，放線菌門、布勞特氏菌屬、葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)在對照組回腸中富集，其中放線菌門的豐度最高；而厚壁菌門、乳球菌屬在益生菌組回腸中富集，其中乳球菌屬的豐度最高。在盲腸中，共富集了1目、2科、1屬，其相對豐度均在對照組盲腸中富集，其中顫螺旋菌目的豐度最高(圖6B)。

A、B，分別為對照組回腸與益生菌組回腸之間、對照組盲腸與益生菌組盲腸之間微生物類群和LDA得分的系統(tǒng)發(fā)育關系

使用Wilcox秩和檢驗評估LEfSe結果見圖7。由圖7可知，與對照組回腸相比，益生菌組回腸厚壁菌門、乳球菌屬的豐度顯著或極顯著增加(P<0.05;P<0.01)，放線菌門、葡萄球菌屬、布勞特氏菌屬及棒狀桿菌屬的豐度顯著或極顯著降低(P<0.05;P<0.01)；與對照組盲腸相比，益生菌組盲腸DTU089的豐度顯著降低(P<0.05)。

①A、B，門與屬水平下的對照組與益生菌組回腸間物種豐度的差異；C，屬水平下的對照組與益生菌組盲腸間物種豐度的差異。②X軸，某一物種在不同分組的平均相對豐度；Y軸，在特定分類級別下物種的名稱。③*,差異顯著(P<0.05);**,差異極顯著(P<0.01)

2.5 腸道微生物功能預測

基于肉雞腸道菌群COG代謝途徑的豐度分析，利用PICRUSt工具將肉雞腸道微生物劃分為23個蛋白質數(shù)據(jù)庫功能類群(圖8)。其中E與G類(氨基酸和碳水化合物的運輸和代謝)、J類(核糖體的結構和生物發(fā)生)、K與L類(復制、重組和修復)是肉雞腸道的優(yōu)勢代謝功能。此外，統(tǒng)計分析表明，1個未知的功能S保持著最高的豐度。而基于肉雞腸道菌群KEGG途徑 (第3級) 的豐度分析表示，代謝途徑、不同環(huán)境中的微生物代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、氨基酸的生物合成、ABC轉運蛋白、碳代謝與核糖體途徑的豐度在肉雞腸道中顯著富集(圖9)。

圖8 肉雞腸道菌群COG代謝途徑的豐度分析

圖9 肉雞腸道菌群KEGG(第3級)途徑的豐度分析

3 討 論

腸道菌群是體內(nèi)最大、最復雜的微生態(tài)系統(tǒng)。多種共生微生物形成一個微生物屏障，保護腸道功能以調節(jié)能量代謝和吸收；微生物群介導的先天免疫防御可抑制侵入病原體的增殖，維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)[14]。宿主和腸道菌群在正常條件下處于動態(tài)平衡，若平衡被破壞則會導致各種疾病發(fā)生。Rehman等[15]研究表明，可以通過飲食因素如飼料添加劑來恢復和重建腸道復雜的微生物群，提高禽類的生長性能。生態(tài)學理論表明，腸道微生物物種的豐富性與微生態(tài)的穩(wěn)定性有關。本研究表明，在42 d肉雞腸道中，復合益生菌可使腸道微生物區(qū)系的Alpha多樣性略為降低，這與Li等[16]研究結果一致，補充嗜酸乳桿菌可降低回腸微生物群的Shannon指數(shù)，恢復由壞死性腸炎破壞的肉雞的微生物群落組成。益生菌降低微生物群的多樣性指數(shù)可能是由于pH的降低為乳酸菌科這一優(yōu)勢菌群的增殖創(chuàng)造了良好的環(huán)境，限制了腸桿菌的生長[17]。 此外，本研究中對照組與益生菌組之間的細菌群落簇相互靠近，說明復合益生菌可以改善微生物群落結構，且影響較小。

肉雞腸道有900種以上細菌，其中最豐富的是厚壁菌門、變形菌門與擬桿菌門[18]，本研究結果與其一致。健康動物的腸道與菌群之間通過和諧的相互作用來保持生物穩(wěn)態(tài)，當菌群的成分或功能失調時，會導致腸道和腸道外疾病[19]。變形菌門細菌(如霍亂弧菌、大腸桿菌與沙門氏菌等)在肉雞腸道定植會導致腸道感染。研究表明，乳桿菌復合菌可降低變形菌門數(shù)量并逆轉沙門氏菌感染[20-21]。本研究表明，復合益生菌可提高肉雞腸道內(nèi)厚壁菌門的豐度，降低放線菌門、擬桿菌門與變形菌門的豐度，改善腸道健康。厚壁菌門和擬桿菌門作為肉雞腸道中數(shù)量最多的兩個門，兩者的豐度之比(F/B)是衡量腸道菌群群落結構的重要指標。在體重較高和料重比較低的肉雞糞便中F/B增加[22]。本研究中，復合益生菌影響腸道菌群的組成結構，可通過增加腸道內(nèi)F/B來促進肉雞體重的增加，提高肉雞的生長性能。Chen等[23]研究表明，膳食中補充芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)品也有類似效應，可改變能量收集、脂質代謝及內(nèi)分泌功能，影響宿主代謝。 F/B的增加與肥胖有關，主要是由于厚壁菌門細菌獲取能量的能力較高[24]。

毛螺菌科和消化鏈球菌科家族是一種厭氧、芽孢形成的細菌，可以降解淀粉和非淀粉多糖，將復雜的多糖轉化為短鏈脂肪酸[25-26]。由于家禽體內(nèi)缺乏消化非淀粉多糖的內(nèi)源性酶，因此限制了高纖維含量飼料的利用，而在本試驗中，盲腸毛螺菌科的豐度增加，表明復合益生菌可增加盲腸發(fā)酵降解非淀粉多糖的能力，提高飼料利用率。梭菌屬細菌可引起腸道感染，如常見的彎曲桿菌病，會引起血液炎癥，導致腹瀉、痙攣和疼痛等[27]，而乳酸菌是肉雞消化道的優(yōu)勢細菌之一，可以產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和抗菌因子，限制腸道病原體的增殖，預防腸道感染和腹瀉。Lin等[28]研究表明，膳食中補充地衣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)品可抑制金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長，緩解肉雞壞死性腸炎，改善生長性能。Hossain等[29]和劉鳳美等[30]也指出，復合益生菌會引起腸道中乳酸桿菌增加，梭狀芽孢桿菌和大腸桿菌減少。本研究中也有相同的結論，復合益生菌可使回腸產(chǎn)生特有的乳球菌屬細菌，增加了乳桿菌屬的豐度，同時降低梭菌屬、腸球菌與葡萄球菌屬的豐度，改善腸道健康。益生菌可產(chǎn)生抗菌性環(huán)狀脂肽，通過破壞細菌膜來表現(xiàn)其抗病活性，益生菌這種衍生表面活性素的抗菌機制可能會導致肉雞形成獨特的微生物組[31]。綜上，復合益生菌可增加乳酸桿菌種類，降低病原菌的生存能力，改善腸道細菌平衡，還可通過促進黏蛋白的產(chǎn)生來增強黏膜屏障，從而穩(wěn)定腸道菌群。盲腸是各種復雜微生物群的理想棲息地，在肉雞整個腸道中具有最豐富的代謝功能，而糖類運輸途徑的豐度富集在回腸。本研究中復合益生菌可調節(jié)腸道菌群的組成，但不會影響腸道多種代謝功能。

4 結 論

復合益生菌可通過增加肉雞回腸乳桿菌屬豐度、降低病原菌豐度來改善腸道菌群的組成、功能和多樣性；同時通過增加盲腸毛螺菌科豐度來提高盲腸發(fā)酵降解非淀粉多糖的能力，進而提高飼料利用效率，促進肉雞生長。