宇曉軍，李丹丹，厲學(xué)武，王 群，王 光，王利華

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島 266109;2.山東新希望六和集團(tuán)有限公司，青島 266000)

腸道健康和免疫功能是影響動(dòng)物健康的重要因素，在抗病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。腸道健康包括腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、分泌、屏障等功能[1]，與機(jī)體免疫能力密切相關(guān)，共同決定著動(dòng)物能否健康生長，從而影響動(dòng)物生產(chǎn)效率。水貂的育成期正值每年氣溫最高的夏季，食物易酸敗，加上仔貂腸道等免疫器官發(fā)育不完善，所以容易發(fā)生腸道等疾病[2]，給養(yǎng)殖業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失?？咕?antimicrobial peptide,AP)又稱抗微生物肽或宿主防御肽[3]，是由多種生物細(xì)胞特定基因編碼經(jīng)外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有廣譜抗細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲，抑殺腫瘤細(xì)胞，具有免疫活性等作用的多肽[4-6]。天蠶素抗菌肽是發(fā)現(xiàn)最早、研究最徹底、效果最明顯的一類抗菌肽[7]，包含離子線性α-螺旋結(jié)構(gòu)[8]，具有熱穩(wěn)定性好、抗菌力強(qiáng)、抗腫瘤活性、無免疫原性等特點(diǎn)，在動(dòng)物生產(chǎn)中有廣泛應(yīng)用[9]。研究表明，添加天蠶素抗菌肽可以改善動(dòng)物腸道黏膜形態(tài)[10]；降低炎癥因子含量，緩解炎癥因子帶來的損傷[11]；提高817肉雞生產(chǎn)性能、臟器系數(shù)、抗體水平及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力[12]；促進(jìn)AA肉雞生長，減少發(fā)病率[13]。目前，抗菌肽在水貂生產(chǎn)中研究較少。為提高水貂抗病力，降低水貂發(fā)病死亡帶來的經(jīng)濟(jì)損失，本試驗(yàn)以育成期母貂為研究對(duì)象，在飼糧中添加不同水平的抗菌肽，探究其對(duì)育成期母貂免疫功能和腸組織形態(tài)的影響，確定抗菌肽在水貂養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用效果及適宜添加水平。

1 材料與方法

1.1 材料

抗菌肽購自北京中農(nóng)穎泰生物技術(shù)有限公司，天蠶素活性多肽≥100萬IU/g，純度≥98%。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2020年7月4日-2020年9月6日在山東省海陽市某水貂養(yǎng)殖場進(jìn)行，選取65日齡體重相近的健康短毛黑母貂。采用單籠棚舍飼養(yǎng)，已完成犬瘟熱和細(xì)小病毒疫苗接種。每天05：00和17：00各飼喂一次，自由飲水，自然光照。預(yù)試期1周，正試期8周。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，60只育成期母貂分為6組，每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只。各組飼糧中抗菌肽的添加水平分別為0(對(duì)照組)、100、200、300、400和500 mg/kg，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，每組取6只水貂先進(jìn)行心臟采血，然后進(jìn)行屠宰試驗(yàn)，剝離各內(nèi)臟器官、取十二指腸及空腸樣品，用于臟器系數(shù)、血清和空腸免疫指標(biāo)的測(cè)定，并參考孫偉麗等[14]制作腸組織切片。

1.4.1 臟器系數(shù)測(cè)定 水貂屠宰后，迅速取出心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟，用濾紙吸干臟器表面的血液后進(jìn)行稱重記錄，計(jì)算臟器系數(shù)。

臟器系數(shù)(%)=(器官重量/體重)×100%

1.4.2 血清免疫指標(biāo)測(cè)定 水貂心臟采血10 mL，待血清析出后3 500 r/min離心10 min，將分離出的血清分裝在1.5 mL Eppendorf管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎妹嘎?lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、補(bǔ)體C3(C3)及補(bǔ)體C4(C4)含量。

1.4.3 水貂空腸免疫指標(biāo)測(cè)定 稱取1 g空腸組織，加入9 mL PBS(pH 7.4)制作組織勻漿，低溫離心機(jī)3 500 r/min離心10 min，取上清液。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)測(cè)定分泌型免疫球蛋白(sIgA)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)及溶菌酶(LZM)含量，均使用全波長酶標(biāo)儀(CFX96，伯樂公司)測(cè)定。

1.4.4 水貂腸組織切片制備 分別取十二指腸和空腸腸段2～3 cm，用生理鹽水清洗后放入10 mL/L甲醛溶液進(jìn)行固定。將已固定好的腸道經(jīng)修整、水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟后，用蘇木精-伊紅(HE)進(jìn)行染色，制成腸組織切片。挑選制作合格的切片，在100倍顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)不連續(xù)視野，并挑選典型視野拍攝成圖片，使用軟件ZEN 2011(Blue version)測(cè)定腸絨毛長度及隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(V/C)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2019整理，采用SPSS 24.0進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 抗菌肽對(duì)育成期母貂臟器系數(shù)的影響

由表2可知，抗菌肽可顯著影響育成期母貂脾臟指數(shù)，對(duì)其他臟器系數(shù)均無顯著影響，與對(duì)照組相比，100、300及400 mg/kg抗菌肽組脾臟指數(shù)均顯著升高(P<0.05)，分別提高50.90%、62.45%和42.24%，各試驗(yàn)組之間無顯著差異(P>0.05)。

表2 添加抗菌肽后育成期母貂的臟器系數(shù)

2.2 抗菌肽對(duì)育成期母貂血清免疫指標(biāo)的影響

由表3可知，抗菌肽可顯著影響育成期母貂血清免疫指標(biāo)，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組血清C3、C4及IgM含量均顯著升高(P<0.05)；100、300、400、500 mg/kg抗菌肽組血清IgA和IgG含量均顯著升高(P<0.05)。

表3 添加抗菌肽后育成期母貂的血清免疫指標(biāo)

2.3 抗菌肽對(duì)育成期母貂空腸免疫指標(biāo)的影響

由表4可知，抗菌肽可顯著影響育成期母貂空腸sIgA、TNF-α、IFN-γ和IL-10含量，對(duì)IL-1β、IL-8和LZM含量均無顯著影響，與對(duì)照組相比，100、200、300及500 mg/kg抗菌肽組sIgA含量均顯著升高(P<0.05)；100、200及300 mg/kg抗菌肽組IFN-γ含量均顯著升高(P<0.05)；100、200、300及400 mg/kg抗菌肽組IL-10含量均顯著升高(P<0.05)；各試驗(yàn)組TNF-α含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且各試驗(yàn)組之間無顯著差異(P>0.05)。

表4 添加抗菌肽后育成期母貂的空腸免疫指標(biāo)

2.4 抗菌肽對(duì)育成期母貂腸組織形態(tài)的影響

由表5可知，抗菌肽可顯著影響育成期母貂十二指腸絨毛高度、隱窩深度、V/C，以及空腸絨毛高度、V/C，對(duì)空腸隱窩深度無顯著影響，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組十二指腸和空腸絨毛高度均顯著升高(P<0.05)；200 mg/kg抗菌肽組十二指腸隱窩深度顯著低于400和500 mg/kg抗菌肽組(P<0.05)，V/C顯著高于對(duì)照組、400和500 mg/kg抗菌肽組(P<0.05)；200、300及400 mg/kg抗菌肽組空腸V/C均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表5 添加抗菌肽后育成期母貂的腸組織形態(tài)

水貂十二指腸、空腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)見圖1、2。由圖1、2可知，對(duì)照組母貂十二指腸空腸組織絨毛分布稀疏，長度較短，抗菌肽添加組絨毛較長、濃密、整齊完整。

A，對(duì)照組；B～F，100、200、300、400和500 mg/kg抗菌肽組。下同

圖2 育成期母貂空腸組織切片(100×)

3 討 論

3.1 抗菌肽對(duì)水貂臟器系數(shù)的影響

臟器系數(shù)是動(dòng)物試驗(yàn)中非常重要的一項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)，其大小在一定程度上能夠反映動(dòng)物器官的功能強(qiáng)弱[15]。脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是各種免疫細(xì)胞產(chǎn)生、分化、成熟及進(jìn)行免疫應(yīng)答的主要場所，是主要的免疫器官。王莉等[12]研究表明，天蠶素抗菌肽能顯著提高21、42日齡817肉雜雞的胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)和脾臟指數(shù)；田麗娜等[16]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Sublancin可提高蛋雞肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)；肖發(fā)沂等[17]研究表明，抗菌肽可提高斷奶仔豬脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，這與雷岷等[18]在肉兔上的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，飼糧中添加抗菌肽能夠提高育成期母貂脾臟指數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加抗菌肽可以促進(jìn)機(jī)體免疫器官發(fā)育，誘導(dǎo)免疫球蛋白及細(xì)胞因子產(chǎn)生，發(fā)揮免疫效應(yīng)[3]。本試驗(yàn)結(jié)果也證明，抗菌肽可以提高水貂血清和腸道免疫因子，減少炎癥反應(yīng)，說明抗菌肽可能通過調(diào)節(jié)血清和腸道免疫，促進(jìn)免疫器官發(fā)育，從而提高水貂免疫力，保持機(jī)體健康。

3.2 抗菌肽對(duì)水貂血清免疫指標(biāo)的影響

體液免疫是動(dòng)物特異性免疫的一個(gè)重要方面，如對(duì)抗體、病原體和毒素的中和作用，免疫調(diào)理吞噬及抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，都與免疫球蛋白和抗體水平等有密切關(guān)系[19]。免疫系統(tǒng)能夠使B淋巴細(xì)胞在抗原刺激下增殖分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生免疫球蛋白，其在哺乳動(dòng)物體液免疫中發(fā)揮著極其重要的作用[20-21]。其中，IgG主要介導(dǎo)抗感染免疫；IgM是體液機(jī)體免疫中出現(xiàn)最早的抗體，具有殺菌激活補(bǔ)體[22]等功能；IgA主要參與黏膜免疫[23]；C3和C4是補(bǔ)體系統(tǒng)的主要成分，在抵抗微生物感染方面起重要作用，激活后具有免疫調(diào)節(jié)、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、中和毒素、免疫復(fù)合物溶解和清除等重要的生物學(xué)效應(yīng)[24]。田麗娜等[16]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽可提高海蘭褐殼蛋雞血清中IgA、IgG和IgM含量，以及脾臟中IFN-γ的表達(dá)；劉莉如等[24]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加不同水平天蠶素抗菌肽可提高蛋雞血清中IgA、IgG和C3含量；Wu等[25]研究表明，天蠶素抗菌肽可提高豬血清中IgA、IgG、IL-1β和IL-6含量，本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。這可能與昆蟲抗菌肽在機(jī)體內(nèi)通過3條信號(hào)通路(Toll樣受體信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路)發(fā)揮免疫調(diào)控作用有關(guān)[26]，說明在水貂飼糧中添加抗菌肽能夠在一定程度上提高水貂的體液免疫功能，增強(qiáng)其免疫力。

3.3 抗菌肽對(duì)水貂空腸免疫指標(biāo)的影響

腸黏膜免疫屏障主要由GALT(派伊氏結(jié)、黏膜淋巴集合體、彌散黏膜淋巴組織及免疫細(xì)胞)及其分泌的sIgA、細(xì)胞因子等免疫生成物質(zhì)構(gòu)成[27]。各種促炎性細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α等)與抗炎性細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-10等)之間的協(xié)同作用是調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥發(fā)展的關(guān)鍵[28]。sIgA是由小腸隱窩處未分化的M細(xì)胞通過多聚免疫球蛋白受體分泌而來，是腸道提供免疫保護(hù)的主要免疫球蛋白和黏膜免疫的核心[29]，是衡量腸道健康的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在水貂飼糧中添加適量抗菌肽可以增加水貂空腸sIgA、IFN-γ、IL-10含量，降低TNF-α含量，說明抗菌肽可以緩解腸道炎癥引起的損傷，提高機(jī)體免疫力?？赡苁怯捎诳咕淖鳛槊庖哒{(diào)節(jié)分子調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，能夠抑制脂多糖(LPS)與RAW264.7細(xì)胞表面的Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合，從而阻止TNF-α和IL-1β等細(xì)胞因子的表達(dá)[30]，改變宿主免疫相關(guān)基因表達(dá)。還有研究發(fā)現(xiàn)，天蠶素可以抑制炎性因子的表達(dá)，可能是其能與LPS結(jié)合，阻止或干擾LPS與TLR4的相互作用，最終抑制了與TLR4相關(guān)的下游信號(hào)的傳導(dǎo)，從而提高機(jī)體免疫力，緩解腸道炎癥損傷[31]。

3.4 抗菌肽對(duì)水貂腸道形態(tài)的影響

腸道形態(tài)學(xué)已經(jīng)成為評(píng)估腸道營養(yǎng)效果的常用研究工具[32]，絨毛高度、隱窩深度及絨毛高度/隱窩深度是腸道結(jié)構(gòu)完整健康的重要指標(biāo)，絨毛的長度與活性細(xì)胞有絲分裂和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收有關(guān)[33]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，抗菌肽可提高水貂十二指腸和空腸腸絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度，與劉莉如等[34]在海蘭褐仔公雞和李平等[35]在斷奶仔豬上的研究一致?？赡苡捎诳咕氖荏w富集于空腸和回腸，通過刺激腸道上皮細(xì)胞增殖促進(jìn)空腸和回腸的絨毛生長，并增加絨毛高度/隱窩深度[36]，也可能是由于抗菌肽具有調(diào)節(jié)腸道免疫屏障，抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用，降低腸道屏障功能受損程度，減少腸道有害菌對(duì)腸黏膜的破壞，進(jìn)而達(dá)到改善腸道黏膜形態(tài)的作用[37]。

4 結(jié) 論

飼糧中添加天蠶素抗菌肽可促進(jìn)育成期母貂免疫器官發(fā)育，提高機(jī)體免疫力，改善腸道形態(tài)，建議抗菌肽添加水平為100～200 mg/kg。