張強 許璨 唐朝克*

（1）南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院心血管疾病研究所，動脈硬化學(xué)湖南省重點實驗室，動脈硬化性疾病湖南省國際科技合作創(chuàng)新基地，衡陽醫(yī)學(xué)院儀器設(shè)備技術(shù)實驗室，湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心，衡陽 421001；2）南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，衡陽 421001）

體內(nèi)膽固醇具有許多重要的生理功能。細胞是膽固醇發(fā)揮生理功能的重要場所。細胞膜上膽固醇一方面能與鞘脂類和糖基磷脂酰肌醇蛋白結(jié)合形成脂筏，在膜轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和宿主-病原體相互作用的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用；另一方面可以與膜上蛋白質(zhì)相互作用，維持或改變其構(gòu)象［1］。細胞內(nèi)膽固醇能通過促進Hedgehog基因轉(zhuǎn)錄和共價修飾Hedgehog蛋白、Smoothened蛋白，確保胚胎發(fā)育［2］。固醇轉(zhuǎn)移蛋白能通過直接結(jié)合膽固醇調(diào)節(jié)膽固醇細胞內(nèi)分布，是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)的重要因子［3］。

細胞內(nèi)膽固醇水平受膽固醇生物合成、攝取、流出和酯化調(diào)節(jié)。膽固醇生物合成由乙酰輔酶A在20多種酶作用下完成。3-羥基-3-甲基-戊二?；o酶A還原酶（HMGCR）和角鯊烯單加氧酶（squalene monooxygenase，SQLE）是膽固醇合成的關(guān)鍵限速酶。食物中膽固醇由小腸上皮細胞刷狀緣側(cè)尼曼-匹克C1型類似蛋白1（Niemann-Pick type C1（NPC1）-like 1，NPC1L1）攝取，并以乳糜微粒形式轉(zhuǎn)運至肝臟。肝臟內(nèi)膽固醇以極低密度脂蛋白（VLDL）形式進入血液，并在血液中轉(zhuǎn)化為低密度脂蛋白（LDL）。外周細胞通過細胞膜上的低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）將血液中LDL攝取進入細胞內(nèi)。高密度脂蛋白（HDL）中膽固醇經(jīng)B族清道夫受體1（scavenger receptor class B1，SR-B1）攝取進入肝臟細胞。細胞內(nèi)游離膽固醇可在ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運體（ATP binding cassette transporter，ABC）介導(dǎo)下流出細胞，并與乏脂apo A-I（lipid-poor or lipid free apo A-I）結(jié)合形成HDL，最終轉(zhuǎn)運至肝臟，在此過程中載脂蛋白A-I結(jié)合蛋白（apolipoprotein A-I binding protein，AIBP）也發(fā)揮重要作用。細胞內(nèi)游離膽固醇亦可通過?；o酶A∶膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（acid coenzyme A∶cholesterol acyltransferase，ACAT）酯化生成膽固醇酯，儲存在細胞質(zhì)脂滴中。本文綜述膽固醇的生理作用以及其生物合成、攝取、流出和酯化中關(guān)鍵分子調(diào)控細胞內(nèi)膽固醇水平的研究新進展，以期為膽固醇相關(guān)研究提供新的思路。

1 膽固醇的生理作用

膽固醇是一種環(huán)戊烷多氫菲衍生物，是在18世紀(jì)膽石中發(fā)現(xiàn)并命名的一種具有脂類性質(zhì)的物質(zhì)。膽固醇一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便受到科研工作者的廣泛關(guān)注。研究結(jié)果表明，膽固醇廣泛存在于動物體內(nèi)，腦和神經(jīng)組織中含量最為豐富。膽固醇在動物體內(nèi)具有許多重要的生理功能，它參與細胞膜形成，對細胞膜的穩(wěn)定有不可或缺的作用；能合成膽汁酸和維生素D，調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)和鈣磷代謝；還是類固醇激素合成的原料，類固醇激素在體內(nèi)對維持生命、調(diào)節(jié)性功能、免疫調(diào)節(jié)以及機體發(fā)展起著重要的作用。

2 膽固醇生物合成調(diào)節(jié)

膽固醇生物合成是膽固醇缺乏時的主要來源，這一過程涉及多種酶以及調(diào)節(jié)膽固醇合成的因子。體內(nèi)幾乎所有細胞均能合成膽固醇，其中肝臟合成膽固醇占總合成膽固醇的50%。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（sterol regulatory element-binding protein 2，SREBP2）、HMGCR和SQLE是調(diào)節(jié)膽固醇合成的關(guān)鍵因子。

2.1 SREBP2調(diào)節(jié)

哺乳動物體內(nèi)存在三個SREBPs亞型：SREBP1a、SREBP1c和SREBP2，其中SREBP2是哺乳動物體內(nèi)一種可選擇性上調(diào)膽固醇合成酶相關(guān)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子。SREBP2首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成N端“堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域和C端兩次跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)前體，并錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。SREBP2必須轉(zhuǎn)移至高爾基體中進一步修飾才能發(fā)揮功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的SREBP2與SREBP分裂激活蛋白（SREBP-cleavage activating protein，SCAP）結(jié)合。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膽固醇水平高于細胞總脂質(zhì)水平5%時，SCAP結(jié)構(gòu)中的固醇感受域（sterol-sensing domain，SSD）與胰島素誘導(dǎo)基因（insulin-induced gene，INSIG）1蛋白相互作用，將SREBP2固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上［4］。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中膽固醇水平低于細胞內(nèi)總脂質(zhì)水平5%時，SCAP則與INSIG1蛋白分離，使SCAP-SREBP2復(fù)合物隨即從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上分解并脫落。脫落后的分解產(chǎn)物經(jīng)COPII囊泡轉(zhuǎn)運至高爾基體。高爾基體中SREBP2在1位點蛋白酶（site 1 protease，S1P）和2位點蛋白酶（site 2 protease，S2P）依次作用下，轉(zhuǎn)化為活 化SREBP2，即 核SREBP2（nSREBP2）。nSREBP2以同型二聚體形式進入核內(nèi)，并與靶基因HMGCR、SQLE等啟動子中的固醇調(diào)節(jié)元件（sterol regulatory element，SRE）結(jié) 合，上 調(diào)HMGCR和SQLE等基因的表達（圖1）。

在上述過程中，25-羥基-固醇可通過直接結(jié)合INSIG1蛋白并促進INSIG1蛋白與SCAP結(jié)合，抑制SREBP2激活，其抑制作用較膽固醇更強。哺乳動物體內(nèi)有兩種INSIG蛋白，即INSIG1蛋白和INSIG2蛋白。INSIG2蛋白不能與25-羥基-固醇結(jié)合，不具有抑制SREBP2激活的功能。實驗表明，當(dāng)SCAP蛋白發(fā)生Y298C、L315F或D433N突變時，SCAP與INSIG1蛋白結(jié)合作用減弱，導(dǎo)致在細胞內(nèi)膽固醇充足的情況下，SREBP2同樣能激活。而在SACP-INSIG1蛋白解離受損的情況下，即使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中膽固醇耗盡，細胞內(nèi)也僅有微量的活化SREBP2。以上證據(jù)表明SCAP和INSIG蛋白相互作用在膽固醇合成調(diào)節(jié)中有著十分重要的作用。INSIG1蛋白與SCAP結(jié)合不僅阻止SREBP2的激活，同時防止其自身降解。當(dāng)膽固醇水平降低時，INSIG1與SCAP分離并迅速降解，促進SREBP2激活?；罨蟮腟REBP2進入核內(nèi)能促進INSIG1基因及膽固醇合成酶相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中膽固醇含量增加，SCAP與INSIG1結(jié)合作用逐漸增強，SREBP2激活隨之減少。這一負(fù)反饋機制調(diào)節(jié)細胞內(nèi)膽固醇合成的動態(tài)平衡。

三 種E3泛 素 連 接 酶RNF139、RNF145和RNF5均能抑制SREBP2的激活。RNF145和RNF5可通過泛素化SCAP結(jié)構(gòu)中與COPII結(jié)合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，減少SREBP2向高爾基體轉(zhuǎn)位［5］。RNF139能夠通過直接結(jié)合SREBP2-SCAP復(fù)合物，抑制SREBP2從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上脫出。這些E3連接酶通過不同機制抑制SCAP-SREBP2從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運，最終抑制SREBP2激活。SREBP2從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫離后，能否轉(zhuǎn)運至高爾基體對SREBP2激活同樣至關(guān)重要。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT可促進CPOII囊泡向高爾基體轉(zhuǎn)運。高爾基體中存在的adipoQ受體3（adipoQ receptor 3，PAQR3），可同SCAP和SREBP2相互作用使SCAP-SREBP2復(fù)合體保留在高爾基體。研究表明，一種高爾基體相關(guān)蛋白NBEAL1能通過促進PAQR3與SCAP相互作用促進SREBP2激活，進而調(diào)節(jié)LDLR表達［6］。熱休克蛋白90（HSP90）能通過與SCAP-SREBP2復(fù)合物結(jié)合，阻止其降解并促進復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體轉(zhuǎn)運，增加SREBP2的激活［7］。

Fig.1 SREBP2 activation pathway and its mechanism圖1 SREBP2活化途徑及其作用機制

nSREBP2蛋白水平及其轉(zhuǎn)錄活性為SREBP2蛋白增加了另一層調(diào)節(jié)。mTOR復(fù)合物1（mTOR complex1，mTORC1）是nSREBP2蛋白形成的主要調(diào)節(jié)因子。mTORC1能通過磷酸化并阻止脂蛋白1（lipin1）進入細胞核和抑制膽固醇從溶酶體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運促進nSREBP2形成［8］。相反，碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（carbohydrate response element-binding protein，ChREBP）促進nSREBP2泛素化降解，其機制尚未闡明。nSREBP2經(jīng)糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK-3）磷酸化后，被Skp1-Cullin-F-box蛋白（Skp1-Cullin-F-box protein，SCF）泛素連接酶復(fù)合物中的FBW7蛋白靶向降解。nSREBP2轉(zhuǎn)錄活性受到翻譯后修飾調(diào)節(jié)。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶P300及環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CBP）的結(jié)合蛋白可通過結(jié)合并乙?；痭SREBP2的N端，增強nSREBP2轉(zhuǎn)錄活性，因此抑制去乙酰酶1（SIRT1）的表達，以增加nSREBP2的水平。在機體饑餓狀態(tài)下，SIRT1被激活，激活后的SIRT1可使nSREBP2去乙酰化并加速其降解，使機體在饑餓狀態(tài)下減少膽固醇生物合成［9］。ERK可磷酸化nSREBP2使其活性增強，AMPK則可磷酸化nSREBP2使其活性下降，SUMO-1可結(jié)合nSREBP2使其轉(zhuǎn)錄活性下降。

SREBP2作為膽固醇合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其基因表達受到多種因素調(diào)控。SREBP2基因中含有固醇調(diào)節(jié)元件，該元件能與nSREBP2蛋白結(jié)合上調(diào)SREBP2表 達。轉(zhuǎn) 錄 因 子NF-Y和SP1能 與nSREBP2協(xié)同上調(diào)SREBP2基因的表達。雌激素能結(jié)合SREBP2啟動子中雌激素元件上調(diào)其表達［10］。神經(jīng)遞質(zhì)神經(jīng)肽Y能通過SREBP2轉(zhuǎn)位激活促進HMGCR表達［11］。在機體饑餓狀態(tài)下，F(xiàn)OXO3和SIRT6的表達增加，F(xiàn)OXO3能通過與SREBP2基因相應(yīng)元件結(jié)合募集SIRT6形成復(fù)合物，下調(diào)SREBP2表達。

2.2 HMGCR調(diào)節(jié)

HMGCR是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種糖蛋白，由8次跨膜的N端疏水結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)內(nèi)C端催化結(jié)構(gòu)域組成，是膽固醇生物合成的兩種關(guān)鍵限速酶之一。HMGCR蛋白降解調(diào)節(jié)是影響膽固醇從頭合成途徑的關(guān)鍵因素。細胞內(nèi)固醇水平升高，特別是羊毛固醇和氧化固醇水平升高，是HMGCR降解的主要誘因［12］。INSIG蛋白和泛素化酶是HMGCR降解的關(guān)鍵因子。當(dāng)細胞內(nèi)羊毛固醇或氧化固醇水平升高時，INSIG1蛋白能通過與HMGCR的固醇感受域結(jié)合，促進HMGCR泛素化。泛素化HMGCR從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上脫落，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑（ERassociated degradation，ERAD）降解。異戊烯轉(zhuǎn)移酶UBIAD1能與INSIG1競爭性結(jié)合HMGCR，抑制HMGCR從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上脫出［13-14］。在施奈德結(jié)晶狀角膜營養(yǎng)不良（Schnyder crystalline corneal dystrophy）中，UBIAD1特異突變使其穩(wěn)定保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，阻止HMGCR泛素化降解，使眼角膜膽固醇生物合成增多［14］（表1）。INSIG2蛋白可募集E3連接酶，促進HMGCR泛素化降解。禁食能提高小鼠肝臟中INSIG2的表達，抑制SREBP2激活，HMGCR表達隨之降低，這一效應(yīng)阻斷了禁食狀況下膽固醇的生物合成。

細胞中HMGCR以磷酸化和去磷酸化兩種形式存在。磷酸化后HMGCR活性降低，但對降解無影響。AMPK是HMGCR磷酸化的關(guān)鍵酶。阻斷AMPK可通過抑制HMGCR磷酸化，促進膽固醇合成。非酒精性脂肪肝中的miR-34a可通過抑制SIRT1促進AMPK去磷酸化，進而使細胞內(nèi)HMGCR活性增強，膽固醇在非酒精性脂肪肝患者肝細胞中蓄積，正反饋促進脂肪肝發(fā)展。

2.3 SQLE調(diào)節(jié)

SQLE是膽固醇生物合成的另一種關(guān)鍵限速酶，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)尚未闡明，目前認(rèn)為其N端前100個氨基酸和C端兩個螺旋結(jié)構(gòu)域是SQLE能錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。SQLE不僅是膽固醇合成的關(guān)鍵限速酶之一，而且是異戊二烯生物合成的關(guān)鍵酶。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中膽固醇水平高于細胞內(nèi)總脂質(zhì)水平5%時，SQLE蛋白N端前100個氨基酸構(gòu)象發(fā)生改變，形成一個兩親螺旋結(jié)構(gòu)，使SQLE從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上脫離，繼而在E2泛素結(jié)合酶（UBE2J2）和E3泛 素 連 接 酶（MARCH6）作 用 下 降 解［15］。MARCH6還可作為轉(zhuǎn)錄因子直接抑制SREBP2基因轉(zhuǎn)錄來抑制SQLE的表達［16］。SQLE和HMGCR轉(zhuǎn)錄合成均受nSREBP2調(diào)節(jié)，但兩者的降解依賴不同的E2泛素結(jié)合酶［17］。這種特殊機制，保證了膽固醇充足情況下，減少膽固醇生成，同時維持異戊二烯的生物合成。

3 膽固醇攝取調(diào)節(jié)

膽固醇攝取對維持膽固醇動態(tài)平衡具有重要作用。其中腸道NPC1L1、LDLR和清道夫受體SRB1是膽固醇攝取的關(guān)鍵受體。

3.1 NPC1L1調(diào)節(jié)

NPC1L1是一個高度糖基化的13次跨膜蛋白，機體內(nèi)NPC1L1主要定位于腸細胞和肝臟膽管上皮細胞。其N端結(jié)構(gòu)域能選擇性結(jié)合膽固醇和氧化甾醇，胞外第二個大環(huán)是膽固醇吸收抑制劑依折麥布（Ezetimibe）作用位點。NPC1L1在細胞內(nèi)膽固醇充足狀態(tài)下主要定位于內(nèi)吞循環(huán)囊泡（endocytic recycling compartment，ERC）中。在體內(nèi)膽固醇水平降低時，NPC1L1轉(zhuǎn)運至質(zhì)膜表面，通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用攝取膽固醇。在細胞內(nèi)膽固醇水平降低時，腸道細胞內(nèi)NPC1L1轉(zhuǎn)運至腸道細胞刷狀緣，并于腸道中膽固醇、Flotillins蛋白和神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合形成一個特殊微域。微域中NPC1L1暴露蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中YVNxxF內(nèi)化序列。YVNxxF序列能通過與NUMB（一種網(wǎng)格蛋白銜接蛋白，能特異性識別并結(jié)合內(nèi)化序列啟動內(nèi)化）結(jié)合促進該微域內(nèi)化，形成內(nèi)吞囊泡，內(nèi)吞囊泡沿著肌動蛋白絲遷移形成內(nèi)吞循環(huán)囊泡。

肌 動 蛋 白 結(jié) 合 蛋 白1（LIMA1）可 識 別NPC1L1結(jié)構(gòu)中QKR序列并促進NPC1L1轉(zhuǎn)運至刷狀緣，該轉(zhuǎn)運過程還需要小GTP酶CDC42、肌球蛋白Vb和微絲參與［18-19］。CDC42可通過與GTP結(jié)合而激活，然后活化的CDC42與NPC1L1結(jié)合，促進微絲聚集。NPC1L1通過LIMA1與肌球蛋白Vb作用，沿微絲返回腸細胞刷狀緣，這一過程可被Ezetimibe阻斷（圖2）。

腸道特異性敲除NUMB和LIMA1的小鼠表現(xiàn)為NPC1L1循環(huán)受損，膽固醇吸收顯著下降。NUMB的G595D突變和LIMA1的K306移碼突變，使NPC1L1從ERC向質(zhì)膜轉(zhuǎn)移減少，表現(xiàn)為膽固醇的吸收和血漿LDL-C的顯著降低。同時，NPC1L1蛋白R1325X突變導(dǎo)致NPC1L1的內(nèi)吞作用減弱，其引起血漿LDL-C水平降低的作用同NUMB和LIMA1的突變類似。由于LDL-C水平與心血管系統(tǒng)疾病的風(fēng)險呈正相關(guān)，以上3種突變均可降低心血管系統(tǒng)患病風(fēng)險。

細胞內(nèi)NPC1L1合成主要受SREBP2調(diào)節(jié)。NPC1L1基因中含有多個固醇調(diào)節(jié)元件。nSREBP2可結(jié)合基因中固醇調(diào)節(jié)元件上調(diào)基因的表達。除了nSREBP2可調(diào)節(jié)NPC1L1表達外，肝細胞核受體4α（HNF4α）能增強nSREBP2對NPC1L1基因的上調(diào)作用。在人肝源性HeG2細胞中，PPARα-RXRα核受體復(fù)合物能上調(diào)NPC1L1的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄共抑制因子SHP可通過增強餐后FGF19信號通路，抑制小鼠腸道細胞中SREBP2上調(diào)的NPC1L1轉(zhuǎn)錄［20］。選擇性Ah受體調(diào)節(jié)劑通過抑制SREBP2轉(zhuǎn)錄來減弱NPC1L1表達和腸道膽固醇的吸收［21］。禁食可下調(diào)NPC1L1的mRNA及蛋白質(zhì)表達。肝X受體（LXRs）激活和Sortilin蛋白降解均能抑制NPC1L1表達，其機制尚未闡明［22］。NPC1L1具體降解機制目前尚未闡明，但有研究指出溶酶體和泛素蛋白酶體是參與NPC1L1降解的重要因素［23］。

Fig.2 NPC1L1 mediates cholesterol absorption pathway圖2 NPC1L1介導(dǎo)膽固醇吸收途徑

3.2 LDLR調(diào)節(jié)

LDLR是外周細胞從循環(huán)中攝取膽固醇的主要受體，約75%的循環(huán)膽固醇由LDLR內(nèi)吞除去［24］。LDLR是一個多結(jié)構(gòu)域單次跨膜蛋白，其胞外段有一個apo B/apo E結(jié)合區(qū)域，一個表皮生長因子（EGF）前體同源結(jié)構(gòu)域，一個O-連接的富含低聚糖的結(jié)構(gòu)域；胞內(nèi)段有一個相對較短的C端尾部，包含高度保守的NPxY內(nèi)吞序列。LDLR首先合成為一個120 ku前體，在分泌轉(zhuǎn)運途徑中糖基化，最終轉(zhuǎn)變?yōu)?60 ku的成熟蛋白并定位在質(zhì)膜上。LDLR可通過細胞外配體結(jié)合域募集循環(huán)中的LDL。隨著LDL在配體結(jié)合域增多，LDLR胞質(zhì)內(nèi)側(cè)NPxY內(nèi)化序列暴露并結(jié)合常染色體隱性高膽固醇血癥（autosomal recessive hypercholesterolemia，ARH）銜接蛋白，募集DAB2、網(wǎng)格蛋白和網(wǎng)格蛋白受體AP2形成內(nèi)吞囊泡進入細胞內(nèi)。內(nèi)吞囊泡在酸性核內(nèi)體中，LDLR結(jié)構(gòu)發(fā)生變化與LDL分離。脫落的LDLR可在COMMD-CCDC22-CCDC93核苷酸循環(huán)復(fù)合體作用下返回細胞膜［25］，或與PCKS9結(jié)合后轉(zhuǎn)運至溶酶體降解［26］。LDLR還可在E3連接酶LDLR誘導(dǎo)降解因子（IDOL）作用下泛素化，隨即從細胞膜上脫落并轉(zhuǎn)運至溶酶體降解。LDLR功能受損或低表達可使脂質(zhì)在循環(huán)中蓄積，導(dǎo)致家族性高膽固醇血癥［27］（表1）。LDL攜帶膽固醇進入細胞后，在溶酶體酸性脂肪酶作用下形成游離膽固醇。溶酶體中的游離膽固醇可通過NPC1（Niemann-Pick type C1）、NPC2（Niemann-Pick type C2）和溶酶體相關(guān)糖蛋白LAMP2轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)。細胞質(zhì)中的游離膽固醇通過溶酶體-過氧化物酶體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜接觸方式轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中［28-29］。NPC1和NPC2突變導(dǎo)致溶酶體內(nèi)脂質(zhì)蓄積稱 為 尼 曼-匹 克 ?。∟iemann-Pick disease，NPD）［30］（表1）。

LDLR基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成主要受SREBP2調(diào)節(jié)。LDLR降解是影響外周細胞膽固醇攝取的主要因素。LDLR降解受PCSK9和IDOL調(diào)控。IDOL是一種E3泛素連接酶，它能識別LDLR上僅靠NPxY內(nèi)吞序列上游的一個殘基，并通過泛素化NPxY下游的兩個殘基促進LDLR降解。PCSK9則可通過中段催化結(jié)構(gòu)域直接與細胞內(nèi)LDLR的EGF-A重復(fù)片段結(jié)合，并通過ARH途徑內(nèi)化運輸至核內(nèi)體中。在核內(nèi)體酸性條件下，LDLR結(jié)構(gòu)發(fā)生變化進一步增強與PCSK9的結(jié)合，最終運輸至溶酶體中降解。

SREBP2能同時上調(diào)LDLR和PCSK9轉(zhuǎn)錄。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中膽固醇水平低于細胞內(nèi)總脂質(zhì)水平5%時，SREBP2激活增多，上調(diào)LDLR和PCSK9表達，總體效應(yīng)將循環(huán)中膽固醇攝取進細胞。甲狀腺激素可通過直接與LDLR基因啟動子結(jié)合促進其表達。肝臟轉(zhuǎn)錄激活因子HNF1α可通過上調(diào)PCSK9表達促進LDLR降解，減少細胞對膽固醇的攝取。LXRs通過上調(diào)IDOL表達降低LDLR水平，限制肝臟對LDL的攝取。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中膽固醇水平高于5%，可激活LXR/IDOL/LDLR軸，LDLR降解，降低膽固醇攝?。?4］。LDLR表達與降解之間平衡機制目前尚未闡明。

3.3 SR-B1介導(dǎo)高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）攝取

SR-B1是一種膜蛋白受體，包含N端膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域、中間胞外結(jié)構(gòu)域，以及C端膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域。SR-B1整個細胞外結(jié)構(gòu)域具有多個同源性序列、多個半胱氨酸和糖基化位點。SR-B1是B類清道夫受體家族成員，在全身細胞均有表達，主要在肝臟、腎上腺和卵巢等類固醇激素合成細胞中表達。SR-B1是介導(dǎo)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運（RCT）中HDL-C攝取的主要受體。SR-B1介導(dǎo)HDL中膽固醇攝取分子機制目前尚未闡明，但可將過程分為兩個步驟：a.血漿中HDL與細胞膜上SR-B1胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合；b.HDL中膽固醇經(jīng)SR-B1選擇性攝取進入細胞。進入類固醇激素合成細胞中的膽固醇可在細胞內(nèi)生成類固醇激素，參與體內(nèi)多種生理過程。肝臟攝取的膽固醇可在肝細胞內(nèi)合成膽汁排出體外或繼續(xù)以VLDL形式進入循環(huán)。

SR-B1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是調(diào)節(jié)SR-B1蛋白合成及HDL-C攝取的主要因素。SREBP1上調(diào)SR-B1表達，是細胞內(nèi)固醇水平變化調(diào)節(jié)SR-B1生成的主要調(diào)節(jié)方式。LXRα及LXRβ同樣能促進細胞內(nèi)SRB1 mRNA及蛋白質(zhì)合成。核受體DAX-1可通過與SR-B1啟動子結(jié)合，抑制SR-B1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。

4 膽固醇流出調(diào)節(jié)

盡管體內(nèi)所有細胞均能合成膽固醇，但大多數(shù)細胞無法分解膽固醇，需要將多余游離膽固醇排出細胞，或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為膽固醇酯儲存在細胞脂滴中。細胞膜上AIBP及4種ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白（ABCA1、ABCG1、ABCG5、ABCG8）能特異性介導(dǎo)細胞膽固醇流出。

4.1 ABCA1介導(dǎo)膽固醇流出機制

ABCA1是全身細胞廣泛表達的細胞膜轉(zhuǎn)運體蛋白，包含2個跨膜結(jié)構(gòu)域、2個核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域、1個調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和2個胞外結(jié)構(gòu)域。ABCA1是介導(dǎo)細胞內(nèi)膽固醇流出的關(guān)鍵膜轉(zhuǎn)運蛋白，其主要功能是將細胞內(nèi)多余游離膽固醇轉(zhuǎn)運至循環(huán)乏脂的apo A-I中，形成新生HDL。新生HDL在卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（LCAT）作用下形成成熟HDL，并繼續(xù)接收ABCG1介導(dǎo)流出的游離膽固醇。HDL能將外周細胞中多余的膽固醇運輸至肝臟，經(jīng)SR-B1攝取進入肝細胞，完成膽固醇逆向轉(zhuǎn)運。ABCA1表達減少或突變導(dǎo)致細胞內(nèi)游離膽固醇流出障礙，引起丹吉爾病［31］（表1）。

ABCA1轉(zhuǎn)運膽固醇的機制目前還存在爭議。過去研究認(rèn)為，ABCA1介導(dǎo)膽固醇流出主要有3種模型，即通道轉(zhuǎn)運、蘑菇狀突起和胞吞-胞吐模型［32］。在新近研究中提出了幾種新的假說。一種假說認(rèn)為，ABCA1首先將細胞內(nèi)游離膽固醇轉(zhuǎn)運至胞外，ABCA1胞膜外側(cè)結(jié)構(gòu)可通過直接結(jié)合apo A-I，將轉(zhuǎn)運至胞外的游離膽固醇直接傳遞到apo A-I上形成新生HDL。另一種假說認(rèn)為，胞外ABCA1結(jié)構(gòu)可形成一個突出于細胞表面的活性微域，apo A-I可與微型結(jié)構(gòu)域結(jié)合而固定在細胞膜上，并啟動脂質(zhì)雙分子層的微溶解，導(dǎo)致細胞內(nèi)的膽固醇和磷脂排出并與apo A-I結(jié)合。除了這兩種外，還有假說認(rèn)為，ABCA1和apo A-I可通過網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞進細胞內(nèi)，apo A-I可直接通過ABCA1接收NPC2中膽固醇，并以酯化顆粒形式分泌出細胞，ABCA1則可返回細胞膜。最新研究表明，ABCA1 C端的特殊結(jié)構(gòu)使ABCA1不僅介導(dǎo)膽固醇流出至apo A-I生成HDL，還能直接將膽固醇從質(zhì)膜胞質(zhì)側(cè)翻轉(zhuǎn)至胞外側(cè)，造成膽固醇在細胞膜表面的不對稱分布，但其機制尚未闡明［33］。

ABCA1表達受多種因素影響。LXRs和維甲酸X受體（retinoid X recepter，RXR）能上調(diào)ABCA1轉(zhuǎn)錄。巨噬細胞中，AMPK能促進LXRα-ABCA1途徑膽固醇流出。一種長鏈非編碼RNA（lnc RNA）MeXis能與LXR作用來促進小鼠ABCA1的轉(zhuǎn)錄［34］。最近研究表明，ABCA1是肝癌和結(jié)腸癌細胞中主要腫瘤抑制因子P53的靶點。P53能通過激活A(yù)BCA1，促進膽固醇從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來抑制SREBP2激活途徑，從而抑制甲羥基戊酸途徑和肝腫瘤的發(fā)生［35］。miR-33和miR-34a能抑制ABCA1的表達［36］。我們小組研究發(fā)現(xiàn)，miR-19b和miR-33能通過靶向沉默ABCA1，降低ABCA1表達；IL-8可通過上調(diào)miR-183抑制ABCA1表達［37］，IL-5則通過抑制miR-211表達上調(diào)ABCA1表達［38］。熱休克蛋白27（HSP27）可通過P13K/PKC ζ/SP1途徑上調(diào)ABCA1表達。熱休克蛋白70（HSP70）可激活JNK/ELK-1抑制ABCA1表達。lncRNA PAC3可 通 過miR-140-5p/RFX7/ABCA1通路上調(diào)ABCA1表達，抑制動脈粥樣硬化（AS）發(fā)生發(fā)展［39］。

ABCA1必須在細胞膜上才能發(fā)揮功能。新合成的ABCA1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)修飾、經(jīng)COPII囊泡轉(zhuǎn)運至高爾基體加工，并經(jīng)TGN（trans Golgi network）分泌囊泡轉(zhuǎn)運至質(zhì)膜發(fā)揮功能。SNAREs（soluble NSF attachment protein receptors）和RABs（targeting GTPase）是修飾過程中兩種特異性調(diào)控蛋白，SNAREs保證囊泡特異性識別，RABs可調(diào)節(jié)囊泡運輸［40］。

ABCA1主要通過溶酶體、泛素化和鈣蛋白酶降解。鈣蛋白酶能通過直接結(jié)合ABCA1引起ABCA1的水解。但ABCA1通過溶酶體和泛素化降解的機制尚未闡明。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)巨噬細胞高表達的Sortilin蛋白，能夠通過直接結(jié)合ABCA1引起ABCA1經(jīng)溶酶體降解，減少巨噬細胞中膽固醇流出，加速AS斑塊的形成［41-42］。這為ABCA1溶酶體降解提供了一種可能機制。

4.2 ABCG1介導(dǎo)膽固醇流出機制

ABCG1是許多細胞（除了肝臟細胞和腸上皮細胞）中高表達的半轉(zhuǎn)運體蛋白。ABCG1必須與另一個ABCG1或ABCG4形成二聚體才能發(fā)揮功能。其主要功能是將細胞內(nèi)游離膽固醇轉(zhuǎn)運至HDL、LDL、白蛋白甲基-β-環(huán)糊精和脂質(zhì)體中，但不能轉(zhuǎn)運至乏脂的apo A-I中。除了膽固醇，氧化固醇、25-羥基膽固醇和膽堿磷脂也是ABCG1的轉(zhuǎn)運底物。目前ABCG1介導(dǎo)膽固醇轉(zhuǎn)移的機制尚未闡明。ABCG1在細胞膜、分泌途徑和內(nèi)吞途徑中均有分布。早期核內(nèi)體和循環(huán)核內(nèi)體中ABCG1可將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中游離膽固醇轉(zhuǎn)移到核內(nèi)體中，核內(nèi)體攜帶游離膽固醇轉(zhuǎn)移至細胞膜并與細胞膜融合，釋放游離膽固醇。細胞膜上ABCG1定位于富含膽固醇和鞘磷脂的微域，與Flotilin1蛋白和肌動蛋白相互作用，促進膜上游離膽固醇與細胞外接受體結(jié)合。

ABCG1基因?qū)XR和RXR異二聚體具有多個反應(yīng)元件。ABCG1表達受miR-10b和miR34a抑制［36］。AMPK可通過激活ERK通路提高ABCG1 mRNA穩(wěn)定性，促進ABCG1表達。最近發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細胞來源的透明質(zhì)酸可以上調(diào)ABCG1的表達，促進腫瘤相關(guān)巨噬細胞胞質(zhì)膽固醇的流出，抑制巨噬細胞的抗腫瘤功能［43］。這一發(fā)現(xiàn)證明膽固醇流出在癌癥發(fā)展過程中的新功能。

4.3 ABCG5/8介導(dǎo)膽固醇流出機制

ABCG5和ABCG8是僅在肝細胞和腸道上皮細胞中表達的半轉(zhuǎn)運體蛋白，它們以異二聚體形式介導(dǎo)細胞內(nèi)膽固醇和植物固醇流出至膽管和腸腔中。ABCG5和ABCG8的單突變或雙突變導(dǎo)致谷固醇血癥［44］（表1）。ABCG5和ABCG8轉(zhuǎn)運膽固醇的機制目前尚未闡明。已有研究表明，ABCG5和ABCG8可通過增加膽固醇水溶性，使膽固醇易于與膽鹽-磷脂-膽堿膠團結(jié)合，促進膽管細胞游離膽固醇流出。

Table 1 Diseases caused by mutations in genes related to cholesterol metabolism pathway表1膽固醇代謝相關(guān)基因突變引起的疾病

ABCG5和ABCG8基因頭對頭的位于DNA鏈上，共享一個基因間區(qū)域，其間的啟動子可同時啟動兩個基因復(fù)制。基因間區(qū)域有LRH1、HFN4α、GATA結(jié)合蛋白、FOXO1和NF-κB的結(jié)合位點。LXRs是ABCG5和ABCG8的正性調(diào)節(jié)因子。法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）激動劑和膽汁酸可通過結(jié)合FXR反應(yīng)元件引起肝細胞ABCG5和ABCG8的表達。

4.4 AIBP介導(dǎo)的膽固醇流出

AIBP是一種分泌蛋白，最初于篩選apo A-I相關(guān)蛋白質(zhì)時發(fā)現(xiàn)。apo A-I是接收細胞內(nèi)流出膽固醇的關(guān)鍵載脂蛋白。研究表明，AIBP能通過促進膽固醇流出減少泡沫細胞形成及炎癥反應(yīng)。脂筏是一種質(zhì)膜上動態(tài)游離的有序結(jié)構(gòu)域，為炎性受體的組裝和信號傳遞提供一個平臺。AIBP通過結(jié)構(gòu)中第115～123位氨基酸穩(wěn)定ABCA1與apo A-I的結(jié)合，使ABCA1蛋白免于Csn2誘導(dǎo)的泛素化和蛋白酶 體 降 解，而 不 影 響ABCA1 mRNA水 平［45］。AIBP通 過 結(jié) 合HDL和apo A-I，增 強HDL和apo A-I與ABCA1結(jié)合，促進細胞內(nèi)及脂筏上膽固醇流出至HDL和apo A-I，減少泡沫細胞形成及炎癥反應(yīng)［45-46］。

5 膽固醇酯化調(diào)節(jié)

膽固醇酯化是防止細胞內(nèi)游離膽固醇在細胞內(nèi)聚集的另一種方式。ACATs可通過膽固醇酯化調(diào)節(jié)膽固醇的儲存或分泌，維持游離膽固醇和膽固醇酯之間的平衡。哺乳動物體內(nèi)存在兩種ACAT同工酶，均為膜蛋白，ACAT1有9個跨膜片段，ACAT2有2～5個跨膜片段。ACAT1結(jié)構(gòu)中第1～140個氨基酸位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞質(zhì)側(cè)，介導(dǎo)兩個ACAT1同源二聚體形成四聚體活化形態(tài)。ACAT1第460位置保守的組氨酸殘基是其活性位點。ACAT2 C端第434位置的組氨酸殘基是其關(guān)鍵的活性位點。ACAT2活化結(jié)構(gòu)目前尚未闡明。

5.1 ACAT1的作用機制

ACAT1在全身細胞中廣泛表達，但在巨噬細胞、上皮細胞和類固醇激素產(chǎn)生細胞表達量明顯高于其他細胞。ACAT1與許多疾病相關(guān)。實驗表明，ACAT1在AS斑塊內(nèi)的巨噬細胞中高表達，但目前ACAT1在AS中作用機制尚未闡明。抑制ACAT1表達可改善阿爾茨海默病小鼠的淀粉樣變性，并阻止胰腺癌和前列腺癌的發(fā)展［47］。抑制CD8+T細胞ACAT1表達可增強細胞膜膽固醇水平，增強T細胞抗腫瘤活性［48］。

膽固醇是ACAT1的變構(gòu)激活劑，膽固醇可通過直接結(jié)合ACAT1使其活化，激活的ACAT1可酯化細胞內(nèi)游離膽固醇并儲存在脂滴之中。這種正反饋作用可快速調(diào)節(jié)細胞內(nèi)游離膽固醇含量。ACAT1基因有兩個啟動子P1和P7，由P1和P7驅(qū)動的兩個轉(zhuǎn)錄本通過反式剪接形成成熟的ACAT1 mRNA。在兩個啟動子中均未發(fā)現(xiàn)SREBP2和LXRs的結(jié)合位點。有研究發(fā)現(xiàn)，P1啟動子能被干擾素、全反式維甲酸、地塞米松、腫瘤壞死因子和胰島素激活。

5.2 ACAT2的作用機制

ACAT2主要在腸上皮細胞中表達，在肝臟中也有微量表達。ACAT2介導(dǎo)膽固醇酯化可增強腸道上皮細胞對膽固醇的吸收。全身性敲除ACAT2可顯著降低膽固醇吸收，并延緩高脂血癥小鼠的AS。ACAT2缺失可特異性提高ABCA1表達，且該作用不受細胞內(nèi)膽固醇水平影響。ABCA1促進細胞內(nèi)膽固醇流出，這一機制能部分平衡ACAT2缺失后的血液膽固醇水平，為AS提供了一個潛在靶點。

ACAT2可被膽固醇激活，繼而催化含有3β-羥基的固醇或固醇類似物酯化。與ACAT1相比，ACAT2對25-羥基膽固醇和膽汁酸衍生物的酯化作用更強。ACAT2這一特性，連同NPC1L1對膽固醇的高選擇性，以及ABCG5和ABCG8對谷固醇等的選擇性外排，有效保證腸道上皮細胞對膽固醇的高效吸收。

HNF1α、HNF4α、CDX2能促進肝臟和腸道細胞中ACAT2轉(zhuǎn)錄。在細胞游離膽固醇水平較低時，ACAT2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中高度保守的Cys277殘基上可發(fā)生泛素化，促進蛋白質(zhì)降解［49］。細胞內(nèi)游離膽固醇增高可誘導(dǎo)活性氧（ROS）氧化Cys277，增強ACAT2的穩(wěn)定性和膽固醇酯形成。

6 小結(jié)與展望

細胞內(nèi)膽固醇水平受到膽固醇生物合成、攝取、流出和酯化的動態(tài)調(diào)節(jié)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是膽固醇生物合成和酯化的主要場所。在正常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中膽固醇含量僅占內(nèi)質(zhì)網(wǎng)總脂質(zhì)的3%。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可在合成和接收外來游離膽固醇的同時，通過囊泡轉(zhuǎn)運或非囊泡轉(zhuǎn)運方式將游離膽固醇轉(zhuǎn)運至核內(nèi)體、高爾基體、線粒體和細胞膜。這一動態(tài)過程持續(xù)存在，并通過SCAP結(jié)構(gòu)中的固醇感受域調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膽固醇水平，維持細胞中膽固醇穩(wěn)態(tài)。在全身水平，多余游離膽固醇從外周細胞流出至血液，血液中膽固醇經(jīng)LDLR、SR-B1等進入肝細胞，維持全身膽固醇穩(wěn)態(tài)。膽固醇穩(wěn)態(tài)不僅與心血管系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，而且與阿爾茨海默病和癌癥也有關(guān)聯(lián)。目前對體內(nèi)膽固醇水平調(diào)節(jié)相關(guān)的許多調(diào)節(jié)因子，如SCAP-SREBP2復(fù)合 體、INSIG蛋 白、SQLE等的研究均取得了顯著成果。在此基礎(chǔ)上研究調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇水平的藥物，如他汀類藥物、Ezetimibe以及一些中藥提取藥物等。這些藥物雖然能有效降低患者體內(nèi)脂質(zhì)，但并未降低心血管疾病發(fā)生風(fēng)險。膽固醇代謝相關(guān)的一些問題目前仍未闡明。膽固醇在腦組織中的代謝方式有待研究。ABCA1作為膽固醇逆轉(zhuǎn)運的重要轉(zhuǎn)運蛋白，在基礎(chǔ)研究方面已有突破，但在臨床方面進展緩慢。進一步探索體內(nèi)膽固醇平衡的調(diào)節(jié)因素是今后研究的重要方向。