張少璐 駱樹瑜 邱玉玲 張向宇 鐘玉緒 孔德新***

（1）天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津 300070；2）天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院，天津 300070；3）軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100089）

口腔潰瘍（oral ulcer，OU）為最常見的口腔黏膜炎癥性潰瘍性疾病，調(diào)查發(fā)現(xiàn)至少有10%～25%人患有該病，在特定人群中OU的患病率可高達(dá)50%［1-2］。因發(fā)作時(shí)疼痛劇烈而嚴(yán)重影響患者的正常生活，嚴(yán)重者可能造成組織缺損。如何安全而有效地緩解疼痛、促進(jìn)組織修復(fù)，從而縮短發(fā)作期、延長間歇期是治療口腔潰瘍關(guān)鍵所在［3］。臨床局部用藥以抗菌藥、具有抗炎和血管收縮作用的糖皮質(zhì)激素、各類生長因子以及中草藥為主。吲哚美辛作為非甾體類抗炎藥，通過抑制前列腺素（prostaglandin，PG）類物質(zhì)而發(fā)揮其抗炎作用［4］，相比皮質(zhì)激素還有鎮(zhèn)痛作用，且副作用小，更為安全有效。本文旨在探究吲哚美辛對(duì)口腔潰瘍愈合過程中的主要作用及機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

SD（Sprague Dawley）遠(yuǎn)交群大鼠購自維通利華，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均按美國國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行，并經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；NO檢測試劑盒（比色法）ab65328和NOS檢測試劑盒（比色法）ab211083購自Abcam；免疫組化表皮生長因子（EGF）、表皮生長因子受體（EGFR）兔抗鼠一抗、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）兔抗鼠多克隆一抗、鼠兔通用型免疫組化試劑盒，購自Proteintech。

1.2 造模、分組

將SD大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉后，取仰臥位，于大鼠右側(cè)頰囊處用直徑5 mm的燒紅鐵釘燙燒2 s。造模第2 d隨機(jī)選取造模大鼠觀察，口腔黏膜可見明顯充血水腫，潰瘍表面厚重黃色莢膜覆蓋，并有炎性分泌物滲出，口腔內(nèi)唾液分泌量增加，表明造模成功。SD大鼠共36只，隨機(jī)分為6組，每組6只。造模第3天開始用藥如下：

a.吲哚美辛凝膠給藥組（YN）。用吲哚美辛凝膠涂抹創(chuàng)面，3次/d。吲哚美辛凝膠為本實(shí)驗(yàn)室自制，由吲哚美辛噴霧劑組溶液加入羥丙基纖維素（HPC）制成3%凝膠劑。

b.復(fù)方苯佐卡因凝膠陽性對(duì)照組（NP）。用復(fù)方苯佐卡因凝膠（國藥準(zhǔn)字H20064406）涂抹創(chuàng)面，3次/d。

c.吲哚美辛噴霧給藥組（YP）。給予吲哚美辛噴霧劑，吲哚美辛噴霧劑為本實(shí)驗(yàn)室自制，取適量吲哚美辛粉末溶于0.1 mol/L Tris緩沖液（三羥甲基氨基甲烷），用HCL調(diào)成pH 8.1，制成10 g/L的儲(chǔ)存液，3次/d。

d.口腔炎噴霧陽性對(duì)照組（PP）。給予口腔炎噴霧劑（國藥準(zhǔn)字X20044198），3次/d。

e.正常對(duì)照組（N）。不作任何處理。

f.陰性對(duì)照組（M）。蒸餾水和3%HPC凝膠交替涂抹創(chuàng)面，3次/d。

1.3 處理方法

給藥3 d后每組隨機(jī)處死3只大鼠，觀察口腔潰瘍愈合情況并拍照，取潰瘍組織樣本檢測潰瘍組織中NO、NOS水平；給藥7 d后處死其他大鼠，拍照，觀察口腔潰瘍愈合情況，取潰瘍組織多聚甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行HE、免疫組織化學(xué)染色。

1.4 NO、NOS檢測方法

每只大鼠處死后取一定重量的潰瘍組織，冷PBS洗后，重懸于100 μl緩沖液中，制成組織勻漿；4℃12 000 r/min高速離心取上清，加入4 mol/L冰高氯酸（perchloric acid，PCA）至終濃度為1 mol/L，渦旋混勻，冰上孵育5 min后12 000 r/min離心15 min取上清，加入等體積的冰KOH沉淀過量的PCA，再次12 000 r/min離心15 min取上清；取85 μl標(biāo)準(zhǔn)液和樣品，按照說明依次加入試劑盒中的檢測液，波長540 nm檢測A值。

1.5 HE染色

組織固定后常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，制成厚度為5 μm的切片；二甲苯脫蠟后梯度酒精水化，蘇木伊紅染色，脫水、透明、封片。

1.6 免疫組化

切片二甲苯脫蠟后梯度酒精水化，微波抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min；PBS緩沖液沖洗3次，3 min/次，滴加一抗，37℃孵育60 min；PBS緩沖液沖洗3次，3 min/次，滴加酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物，滴加酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物，DAB顯色，蘇木復(fù)染，脫水透明后封片。

1.7 檢測指標(biāo)

a.相同參數(shù)下拍照，圖像導(dǎo)入Image-Pro Plus 6.0測量傷口面積，計(jì)算平均傷口表面積。根據(jù)臨床治療效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［5］，顯效表示潰瘍愈合且紅腫癥狀消失，有效表示潰瘍面積縮小但仍可見紅腫，無效表示潰瘍面積縮小或增大、表面覆蓋假膜。

b.檢測潰瘍面再上皮化以及肉芽組織形成情況。剝離全層頰黏膜，HE染色后進(jìn)行組織學(xué)觀察，按照Eldad的組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)定量評(píng)價(jià)［6］，即在光鏡下通過觀察：上皮結(jié)構(gòu)、上皮-固有層連接的完整性、固有層膠原纖維束、炎細(xì)胞浸潤數(shù)量來評(píng)分，其中粒細(xì)胞為每視野放大400倍的細(xì)胞數(shù)，滿分為8分，評(píng)分越高越接近正常組織。

c.免疫組化檢測大鼠潰瘍組織中EGF、EGFR、VEGF的表達(dá)情況。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)按積分半定量法，首先將染色強(qiáng)度打分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色（染色深淺需與背景著色相對(duì)比。再將陽性細(xì)胞所占的百分比打分：0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為＞75%，染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積＞3分時(shí)認(rèn)為有免疫反應(yīng)陽性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析整理，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（n）進(jìn)行描述，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，臨床效果評(píng)價(jià)采用確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其余組間計(jì)量資料比較采用方差分析，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肉眼觀察和傷口面積測定

M組大鼠口腔黏膜可見明顯黃色假膜，有大小不一的典型潰瘍分布。NP、PP組與YN、YP組大鼠口腔黏膜潰瘍面明顯縮小變淺，可見黏膜輕度充血水腫。有些無明顯潰瘍面，考慮潰瘍己愈合。與M組相比，YN、YP和NP、PP組顯效有效率更高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001。經(jīng)計(jì)算，潰瘍面積大小如表1、圖1所示，與M組相比，YN、YP組和NP、PP組潰瘍面積均減小，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，其余兩兩相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。

Table 1 Evaluation of clinical effect of ulcer in rats after administration

Fig.1 Ulcer area of rats after 7 days of administration

2.2 炎癥反應(yīng)與組織細(xì)胞損傷情況

給藥3 d后，化學(xué)試劑盒檢測潰瘍組織中NO和NOS含量（圖2c），YP組NO水平明顯低于M組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；與N組相比，僅YP組NO水平無明顯變化，其余各組均明顯升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；NOS僅在YP組中的水平低于M組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，其余各給藥組NOS水平均低于M中，但無明顯差異P＞0.05；給藥7 d后潰瘍組織中NO、NOS含量均無明顯變化。

Fig.2 Contents of NO and NOS in ulcer tissue after 3 days of administration

2.3 口腔黏膜組織學(xué)觀察

口腔正常黏膜組織顯微鏡下見口腔黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)透明，胞核深染，呈橢圓形，固有層膠原纖維排列稀疏。潰瘍模型組黏膜上皮水腫、溶解破壞形成非特異性炎性潰瘍，表面纖維素性滲出物形成假膜，固有層及黏膜下層纖維水腫變性甚至破壞消失，血管擴(kuò)張，大量淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤，可見大量由內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增生形成的毛細(xì)血管和實(shí)性細(xì)胞條索。NP、PP組與YN、YP組中可見黏膜新生上皮增殖修復(fù)，炎性細(xì)胞明顯減少，膠原纖維排列規(guī)則趨于成熟。組織學(xué)定量積分評(píng)價(jià)顯示，與N組相比，YN、YP組和NP、PP組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05，而YN、YP組和NP、PP組之間兩兩相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05（圖3）。

Fig.3 Histological observation HE×100

2.4 免疫組化染色結(jié)果

Fig.4 Results of immunohistochemical staining（IHC A1-F1，A2-F2×100，A3-F3×400）

EGF和EGFR在正常黏膜上皮的基底細(xì)胞及鄰近的棘細(xì)胞胞漿中表達(dá)陽性；不同的是，除N組外其余各組在肉芽組織部分細(xì)胞和新生上皮細(xì)胞胞漿中EGF陽性表達(dá)，EGFR除在肉芽組織成纖維細(xì)胞的胞漿中陽性表達(dá)外，還在潰瘍組織表面上皮細(xì)胞的包膜中表達(dá)（圖4a）。如圖4b所示，根據(jù)半定量積分結(jié)果，EGF在YN、YP組和NP、PP組的表達(dá)均高于M組和N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，YN、YP組和NP、PP組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05；EGFR在YN、YP組和NP、PP組的表達(dá)水平與正常組相比明顯升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，而與M組相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05；VEGF則主要在新生毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)，NP、PP組和YN、YP組的表達(dá)均低于M組，而除PP組其余各組均高于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，YN組低于NP組。

3 討 論

口腔潰瘍是上皮的完整性發(fā)生破壞而引起的組織缺損，臨床上分為發(fā)作期、愈合期、間歇期且具有自限性，這與損傷黏膜修復(fù)過程中相互銜接、重疊并影響的炎癥、增殖和重塑階段［7-8］一致。因此本課題擬選取大鼠頰黏膜用物理燙傷的方法模擬口腔潰瘍發(fā)生發(fā)展的過程。

創(chuàng)傷發(fā)生數(shù)小時(shí)內(nèi)便出現(xiàn)炎癥反應(yīng)［9］，潰瘍周邊組織缺氧導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等通過活化一氧化氮合酶（eNOS）導(dǎo)致潰瘍組織中NO等炎癥因子水平增加并通過釋放胞內(nèi)物質(zhì)，激活炎癥小體釋放PG等炎癥介質(zhì)［10-11］。本實(shí)驗(yàn)在大鼠給藥3 d后檢測潰瘍組織中NO水平發(fā)現(xiàn)，各組中NO含量與N組相比均有不同程度的升高，表明造模3 d后潰瘍周圍組織處于急性炎癥期，而YP組NO和NOS均低于與M組，表明吲哚美辛噴霧制劑能在一定程度上發(fā)揮減輕黏膜創(chuàng)面炎癥反應(yīng)的作用，這一結(jié)論在組織學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察中也得到進(jìn)一步證實(shí)。有學(xué)者研究證實(shí)，吲哚美辛處理的結(jié)腸癌細(xì)胞系中通過調(diào)控Wnt、Notch和PPAR-γ通路信號(hào)分子降低TNF-α、Cox-2等炎癥因子的表達(dá)而降低炎癥反應(yīng)［12］。炎癥反應(yīng)后期，巨噬細(xì)胞在氧濃度梯度差異的刺激下，分泌VEGF、血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等生長因子［13-14］。當(dāng)成纖維細(xì)胞、血管平滑肌或內(nèi)皮細(xì)胞等暴露于炎性細(xì)胞或細(xì)胞因子時(shí)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的Cox-2進(jìn)而誘導(dǎo)VEGF［15］，潰瘍邊緣血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體識(shí)別并結(jié)合VEGF，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激后開始增殖、遷移以出芽或發(fā)芽的形式伸出，啟動(dòng)毛細(xì)血管新生，以保證組織的供氧需求，同時(shí)，成纖維細(xì)胞增殖并分泌膠原，形成肉芽組織，填平傷口［16-17］。本實(shí)驗(yàn)中VEGF在NP、PP組和YN、YP組的表達(dá)均低于M組，而高于N組，YN組低于NP組。原因可能是給藥7 d時(shí)實(shí)際為潰瘍發(fā)生第10天，藥物的使用加速了組織的修復(fù)進(jìn)程而導(dǎo)致YN、YP組和NP、PP組以纖維和血管生成為主的修復(fù)階段提前結(jié)束，吲哚美辛凝膠比陽性對(duì)照藥物在這方面具有更強(qiáng)的作用。而N組由于不存在損傷修復(fù)過程而未表現(xiàn)出VEGF表達(dá)的明顯改變。有證據(jù)證明，VEGF是傷口損傷后出現(xiàn)的重要的影響傷口愈合的因子［18］。其最大活躍期發(fā)生在損傷后約3～7 d。一旦傷口出現(xiàn)慢性肉芽組織或者血管生成停止，VEGF水平會(huì)隨著內(nèi)皮細(xì)胞凋亡而下降［19］，這一結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

EGF與其受體EGFR相結(jié)合，EGFR的酪氨酸激酶激活，啟動(dòng)下游信號(hào)通路，包括Ras/Raf/MEK/MAPK、JAK/STAT、PI3K/AKT和PLCγ/PKC通路，而引發(fā)多種生物學(xué)效應(yīng)，包括上皮基底部的生發(fā)層干細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞的增殖分化［20-21］，上皮增殖修復(fù)階段開始。增殖的上皮細(xì)胞向傷口中心遷移形成單層上皮覆蓋于肉芽組織表面，逐漸增生分化為鱗狀上皮填充并覆蓋損傷部位。本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR在正常大鼠頰黏膜生發(fā)層胞漿中表達(dá)，M組肉芽組織中成纖維細(xì)胞和組織細(xì)胞的胞漿及個(gè)別胞核中表達(dá)，YN、YP組和NP、PP組中EGFR則表達(dá)于上皮細(xì)胞的胞膜、成纖維細(xì)胞和組織細(xì)胞的胞漿及個(gè)別胞核中。EGFR是一條單鏈跨膜糖蛋白，由胞外結(jié)合功能域、跨膜功能域及胞內(nèi)功能域3部分組成，屬于酪氨酸激酶型受體。對(duì)不同來源的多種細(xì)胞，比如上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞均有強(qiáng)烈的促分裂活性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成而加速組織的增殖與分化。在參與炎癥損傷上皮修復(fù)的信號(hào)傳遞過程中，可能激活了跨膜功能域發(fā)揮作用而導(dǎo)致其表達(dá)模式的改變［22］。而藥物的使用則進(jìn)一步促進(jìn)了大鼠口腔潰瘍組織中上皮細(xì)胞對(duì)EGF的反應(yīng)性，上皮生發(fā)層EGFR的強(qiáng)烈表達(dá)，使上皮深方的肉芽組織中EGF作用加強(qiáng)，從而影響?zhàn)つど掀さ纳L和分化，可能提高了上皮細(xì)胞的增殖和遷移。本實(shí)驗(yàn)通過組織學(xué)定量評(píng)價(jià)也發(fā)現(xiàn)，YN、YP組和NP、PP組上皮和固有層的修復(fù)再生優(yōu)于M組，而炎癥程度亦在一定程度上較輕。

噴劑噴涂后藥物分散均勻，局部能形成較高濃度，生物利用度好，奏效迅速，且藥液罐裝，穩(wěn)定性強(qiáng)但作用于病變部位的時(shí)間短、易被稀釋。凝膠劑使用方便，在口腔內(nèi)持續(xù)緩慢釋放藥物，較長時(shí)間保持有效濃度。通過對(duì)潰瘍面積的測量和組織學(xué)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，兩種劑型均能起到抗炎和促進(jìn)愈合的作用，但通過對(duì)NO和NOS的檢測發(fā)現(xiàn)，僅YP組效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與給藥3 d時(shí)噴霧能在處于急性炎癥期的創(chuàng)面瞬時(shí)達(dá)到有效濃度有關(guān)。而對(duì)EGF及其受體以及VEGF的表達(dá)分析可知，兩種劑型對(duì)促進(jìn)上皮和肉芽組織修復(fù)均有明顯效果。

4 結(jié) 論

本課題組利用吲哚美辛抗炎鎮(zhèn)痛的作用將其制成噴霧和凝膠兩種制劑，探究了其對(duì)口腔黏膜上皮和肉芽組織在炎癥和修復(fù)過程的影響和作用機(jī)理。結(jié)果表明，吲哚美辛作為非甾體類抗炎藥，在大鼠口腔潰瘍的進(jìn)展過程中能減輕炎癥反應(yīng)，并起到促進(jìn)潰瘍愈合的作用。其不含類固醇所有的甾體環(huán)，通過對(duì)環(huán)氧酶的活性中心乙?；蚺c其共價(jià)鍵結(jié)合，抑制PG類物質(zhì)而發(fā)揮其抗炎作用，較皮質(zhì)激素，更為有效和安全［23］。有望成為保護(hù)口腔潰瘍創(chuàng)面、減輕炎癥反應(yīng)、并促進(jìn)愈合的新藥物。