何凡應(yīng)，徐汪君，黃柳向

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南長沙 410208

2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 湖南長沙 410007

功能性消化不良是指由胃和十二指腸功能紊亂引起的癥狀，而無器質(zhì)性疾病的一組臨床綜合征，臨床主要表現(xiàn)為上腹部脹滿、疼痛不適，食欲不振、惡心嘔吐、胃脘部燒灼感等不適癥狀[1]。在中醫(yī)中并無功能性消化不良病名，而是根據(jù)其臨床表現(xiàn)，將其歸屬于胃痞、胃痛范疇。素問其病位在脾胃，與肝密切相關(guān)，還可涉及肺和大腸?；静C為肝郁氣滯，脾胃虛弱[2]?！毒霸廊珪てM》言：“怒氣暴傷，肝氣未平而痞皆有嘔證”。若平素憂思惱怒，則易傷肝損脾，脾胃受損，則不思飲食，脾胃為升降樞紐，其受損中焦升降失常，肝郁還可犯胃，甚至嘔吐，進而發(fā)展為本病。

枳術(shù)丸由枳實、白術(shù)兩味藥組成，是由張元素在張仲景中金匱要略的枳術(shù)湯化裁而來，藥物不變，將湯劑改制成丸劑?！督饏T要略·水氣病脈證病治第十四》云：“心下堅大如盤，邊如旋盤，水飲所作，枳術(shù)湯主治”。枳實性苦、辛、微寒，歸脾胃經(jīng)，具有破氣消積，化痰散痞之功。白術(shù)性甘苦溫，歸脾胃經(jīng)，功效為健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎。二者相配伍，枳實主消，白術(shù)為守，一走一守，一消一補，相互制約互用，共奏疏肝健脾，消食化積散痞之功。若單純健脾補氣而不消滯行氣，則恐補而壅滯， 積痞難去，若一味行氣消滯而不輔以健脾益氣， 則積滯雖可暫去，卻有再積之虞。故二者合用，健脾與行氣并施， 雙管齊下，則可達到消補兼施， 消而不傷正， 補而不礙滯之功[3]。臨床上常用其治療功能性消化不良，并取得了不錯的效果。

為進一步揭示枳術(shù)丸治療功能性消化不良的作用機制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對枳術(shù)丸進行深入挖掘。

材料與方法

1 枳術(shù)丸活性成分靶點的獲取

借助中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[4]，在搜索框中依次輸入白術(shù)、枳實兩味中藥，得到其所有活性成分，根據(jù)人體對藥物吸收、分布、代謝及排泄的藥動學(xué)參數(shù)[5]，再篩選出高活性成分，篩選標準為：口服利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30% 且類藥性（drug-likeness，DL）≥ 0.18，[6]并利用uniprot數(shù)據(jù)庫借助R語言將得到的活性成分統(tǒng)一轉(zhuǎn)化為規(guī)范的靶點。

2 功能性消化不良的靶標的收集

利用 genencard（https：//www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫[7]，在其搜索框中輸入功能性消化不良的英文名，即Functional dyspepsia，搜索后得到該疾病的有關(guān)靶標，再選擇參數(shù)relevance score ＞ 10，得到與該疾病密切相關(guān)的常見靶標。

3 枳術(shù)丸-功能性消化不良共同靶點的收集

利 用 在 線 畫 圖 網(wǎng) 站，（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）將枳實、白術(shù)，功能性消化不良（Functional dyspepsia）各自的靶標輸入其中，得到共同靶標和韋恩圖。

4 枳術(shù)丸-功能性消化不良共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的共同靶點輸入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）[8]，選擇參數(shù) MultipleProtein，選定物種為Homosapiens，設(shè)定最低要求互動分數(shù)為中度信度0.400得到蛋白相互作用（PPI）相關(guān)信息并導(dǎo)出PPI網(wǎng)絡(luò)圖與TSV文件，運用R語言將TSV文件目錄中node1與node2各個靶點的節(jié)點數(shù)目degree導(dǎo)出得到xsl表與柱狀圖。

5 枳術(shù)丸-功能性消化不良共同靶點的GO分析

運 用 DAVID 數(shù) 據(jù) 庫（https：//david.ncifcrf.gov）[9]，對共同靶點進行GO富集分析，輸入格式選擇“OFFICIAL GENE SYMBOL”，“Background” 選 擇“Homo aspiens”，P＜0.05，并將 BP（生物過程）、CC（細胞成分）、MF（分子功能）分別導(dǎo)出，對 P 值取負對數(shù)，P 值越小，-lgP大，表明富集程度越大。進行GO分析，將導(dǎo)出后的結(jié)果用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）在線繪制出GO富集氣泡圖。

6 枳術(shù)丸-功能性消化不良共同靶點的KEGG通路富集分析

運 用 DAVID 數(shù) 據(jù) 庫（https：//david.ncifcrf.gov），對共同靶點進行KEGG通路富集分析，設(shè)置的參數(shù)同1.5項，將得到的前20條通路進行通路富集分析。并用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）在線繪制出KEGG通路富集氣泡圖。

結(jié) 果

1 枳術(shù)丸的活性成分及其對應(yīng)的靶點

通過TCMSP共收集到枳術(shù)丸活性成分共120種，其中枳實65種，白術(shù)55種，通過篩選共得到活性成分29種，其中枳實22種，白術(shù)7種，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫借助R語言將其活性成分轉(zhuǎn)化為靶點，刪除重復(fù)靶點后共得到62個靶點，其中枳實52個，白術(shù)10個，見表1。

表1 枳術(shù)丸藥物活性成分

2 功能性消化不良的靶點

在genencard數(shù)據(jù)庫搜索框中輸入功能性消化不良的英文名，即Functional dyspepsia，搜索共得到2452個靶標，選擇relevance score ＞ 10，得到與功能性消化不良密切相關(guān)的靶標共553個。

3 疾病-藥物活性成分的共同靶點

將枳術(shù)丸的活性成分得到的靶標與功能性消化不良得到的靶標在（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）中的list 1，list 2，list 3中分別輸入后，得到藥物疾病共同的靶點共23個，該靶點即是枳術(shù)丸對功能性消化不良起治療作用密切相關(guān)的靶點，同時導(dǎo)出韋恩圖，見圖1。

圖1 藥物-疾病韋恩圖

4 共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

在String數(shù)據(jù)庫中將得到的藥物疾病23個共同靶點輸入后，設(shè)置參數(shù)完畢后，得到PPI蛋白互作關(guān)系圖并導(dǎo)出，見圖2；同時導(dǎo)出TSV數(shù)據(jù)文件，運用R語言對文件進行處理，得到各個靶點的連接節(jié)點數(shù)的degree的 xls表，見表 2， 其中 EGFR（degree=18）、IL6（degree=18）、VEGFA（degree=18）、CASP3（degree=16）連接節(jié)點均大于15，表明枳術(shù)丸可通過多個靶點對功能性消化不良起到治療作用。

表2 藥物疾病共同靶點的degree值

5 共同靶點的GO富集分析

23個共同靶點在DAVID數(shù)據(jù)庫中GO富集共得到92對BP，25對CC，28對MF，利用微生信對排在前10的BP、CC、MF在線繪制出GO富集氣泡圖，見圖3，結(jié)果顯示，共同靶點主要分布于細胞外間隙、細胞表面、高爾基體、細胞質(zhì)、細胞內(nèi)體膜等細胞成分中，主要通過酶結(jié)合、同蛋白結(jié)合、類固醇結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合等方式參與凋亡負調(diào)控、上皮細胞增殖、氨基酸反應(yīng)、雌二醇反應(yīng)、一氧化氮合成等生物進程。

圖3 GO分析富集氣泡

6 共同靶點的KEGG通路富集分析

23個共同靶點在DAVID數(shù)據(jù)庫中KEGG富集共得到39條信號通路，富集程度前20位的通路見表3，KEGG富集分析氣泡圖見圖4，共同靶點參與的關(guān)鍵通路為癌癥途徑、HIF-1信號通路、TNF信號通路、麻疹信號通路等。

圖4 KEGG富集分析氣泡

表3 共同靶點富集的前20條通路

討 論

功能性消化不良是一種功能性疾病，臨床表現(xiàn)為消化功能改變而無器質(zhì)性病變，其病因尚未明確，可能與胃動力及感覺異常、精神狀態(tài)、應(yīng)激因素、和環(huán)境影響有關(guān)，與HP感染的關(guān)系不密切，酸分泌亦無增加，女性患者較常見，目前西醫(yī)對其的治療主要以促胃動力、抑制胃酸分泌、保護胃黏膜及心理疏導(dǎo)為主，治療效果一般，而中醫(yī)藥對功能性病變的疾病治療有著極大的優(yōu)勢，尤其是在改善患者的癥狀這一方面，功能性消化不良對應(yīng)中醫(yī)“胃痞”“胃痛”范疇，《素問·六云正紀大論》云：“木郁發(fā)之……民病胃脘當心而痛”肝郁氣滯，脾胃虛弱乃其基本病機。臨床研究發(fā)現(xiàn)枳術(shù)丸及其衍變方對功能性消化不良的治療效果良好，李曉玲等人研究發(fā)現(xiàn)枳術(shù)丸對碘酰胺誘導(dǎo)的功能性消化不良大鼠具有加快胃排空、降低胃腸感覺過敏的作用，其機制可能與外周血Ghrelin、5-HT含量提高，CGRP含量降低有關(guān)[10]，沈一山等人將64名功能性消化不良的患者分為橘皮枳術(shù)丸組、嗎丁啉組，治療后發(fā)現(xiàn)橘皮枳術(shù)丸對功效性消化不良的治療效果優(yōu)于嗎丁啉組，P＜0.05[11]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)涉及了多門學(xué)科技術(shù)，可以從整體上揭示藥物、疾病、靶點之間的關(guān)系，為中醫(yī)藥治療疾病對疾病的治療提供了數(shù)據(jù)支撐，已廣泛應(yīng)用于單位中藥、中藥復(fù)方作用機制研究[12]。本研究通過對枳實、白術(shù)的有效成分檢索再篩選，共得到29種活性成分，枳實的主要活性成分有黃銅類、揮發(fā)油類、生物堿類、豆香素類。侯雪楠等人發(fā)現(xiàn)枳實的主要成分橙皮苷可以增加CUMS大鼠GR表達，抑制下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放，改善過度亢進的HPA軸狀態(tài)[13]。有研究證實枳實水提物可通過上調(diào)5-羥色胺受體4（5-HTR4）和神經(jīng)絲蛋白H （NF-H）的表達促進神經(jīng)絲生長， 從而顯著改善瀉劑結(jié)腸大鼠的腸道動[14]。枳實黃酮類化合物具有良好的抗氧化作用，其中黃銅A環(huán)中5，7-二羥基為主要活性基團，枳實黃銅能夠緩解氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肺功能損傷，從而改善肺部組織的病理變化[15]。白術(shù)的主要活性成分有揮發(fā)性成分、內(nèi)酯類成分、苷類、多糖類成分與氨基酸類成分[16]。曹艷霞等研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖可通過調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白、Bax蛋白的表達對應(yīng)激性胃潰瘍起到明顯的改善作用[17]。宋厚盼等觀察白術(shù)甲醇提取物可通過促進多胺介導(dǎo)的上皮細胞遷移修復(fù)胃腸黏膜的損傷[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)功能性消化不良與枳術(shù)丸的共同靶點共有23個，其中連接節(jié)點大于15的靶點有EGFR、IL6、VEGFA、CASP3；研究表明在特定的配體、組織和病理條件下，EGFR的配體直接激活可以產(chǎn)生不同的細胞反應(yīng)，促進細胞生長和纖維化[19]。IL-6一個典型的促炎性細胞因子，有研究表明，它通過gp130的同源二聚體化激活Janus激酶（JAK）/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與炎癥疾病有關(guān)進程，，與胃炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[20]。董宏超等發(fā)現(xiàn)VEGFA可通過ERK、PI3K/Akt通路調(diào)控血管的再生與增值，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[21]。有研究表明caspase-3是一種常見被激活的死亡蛋白酶，是細胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)，可催化許多關(guān)鍵細胞蛋白的特異性切割[22]。

本研究GO富集分析結(jié)果表明，共同靶點分布于細胞的多種成分中，能夠多靶點、多結(jié)構(gòu)、多形式、通過多種生物進程，包括凋亡負調(diào)控、上皮細胞增殖、氨基酸反應(yīng)等。細胞凋亡等。KEGG富集結(jié)果共得到39條信號通路，其中癌癥途徑、HIF-1信號通路、TNF信號通路為關(guān)鍵信號通路，癌癥途徑與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、非小細胞癌等。有研究發(fā)現(xiàn)，C-X-C基序配體8（CXCL8）是癌癥途徑中的一種關(guān)鍵因子，發(fā)揮著多功能細胞因子的作用，能以自分泌或旁分泌的方式調(diào)節(jié)腫瘤的增殖，侵襲和遷移，能參與多種細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)及整合，以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，從而介導(dǎo)各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展[23]。缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可在人類癌癥中低氧條件下誘導(dǎo)發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，BRU抑制了HIF-1的反式激活活性，并抑制了VEGF，GLUT1，HK2和LDHA等HIF-1靶基因的表達。此外，BRU還可以通過抑制HIF-1信號通路來降低缺氧條件下的葡萄糖消耗[24]。TNF（腫瘤壞死因子）是促炎和抗炎細胞因子，對自身免疫性疾病，癌癥的發(fā)展以及對傳染性病原體的保護至關(guān)重要。除無數(shù)其他活動外，TNF可以是T細胞的產(chǎn)物，并可以作用于T細胞。TNF可以促進中樞和效應(yīng)T細胞的活化和增殖，但也可以誘導(dǎo)高度活化的效應(yīng)T細胞凋亡，從而進一步確定病原性或保護性T細胞池的大小。而且，TNF可以對調(diào)節(jié)性T細胞產(chǎn)生不同的作用。它既可以下調(diào)其抑制能力，又可以在其他情況下促進其發(fā)展或積累[25]。

綜上所述，本研究運用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，揭示了枳術(shù)丸對功能性消化不良的可能的治療作用機制，但受限于數(shù)據(jù)庫、軟件的不足之處，其還可待進一步實驗論證其科學(xué)性，從而為新藥的開發(fā)提供有力依據(jù)。