壽 曄 秦宇芬

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

2 湖州市中醫(yī)院 浙江 湖州 313000

冠狀動脈閉塞會使心肌缺血壞死，若及時行再灌注，也會造成缺血再灌注損傷（MIRI）[1]。尋找減輕心肌缺血再灌注損傷機(jī)體的藥物至關(guān)重要。當(dāng)歸藥理活性高，主要成分揮發(fā)油在心腦血管疾病中療效顯著。本文建立大鼠心肌MIRI模型，探究當(dāng)歸揮發(fā)油對MIRI致心肌損傷的保護(hù)作用，為臨床提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 動物：200～230g雄性SD大鼠24只，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2018-0006。飼養(yǎng)于杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心，許可證號為SYXK(浙)2020-0024。自由飲食。

1.2 材料：NF-κB P65(D14E12)XP?、PHOSPHO NF-κB P65(SER536)(93H1)、IκBα(L35A5)MOUSE MAB ANTIBODY（批號：8242S、3033S、4814S，CST）。

1.3 設(shè)備：UTP-313型電子天平（上?；ǔ保珽PS300型電泳儀（天能），DM3000型正置英熒光微鏡（LEICA），NIKON DS-U3型成像系統(tǒng)（日本尼康）。

1.4 MIRI模型制備：SD大鼠均分為4組，每組6只。用藥組以20、40mg/（kg·d），腹腔注射7d，假手術(shù)組與模型組注射等體積生理鹽水。麻醉，鈍性分離暴露氣管，連接動物呼吸機(jī)。氣管插管后分離左頸總動脈，遠(yuǎn)離左心耳2mm處結(jié)扎冠狀動脈，誘導(dǎo)缺血，之后取消結(jié)扎，再灌注2小時。假手術(shù)組僅進(jìn)行套圈不結(jié)扎。

1.5 心臟功能參數(shù)：左心室收縮壓(LVSP)、舒張末壓(LVEDP)、內(nèi)壓最大上升速率(+DP/DTMAX)、內(nèi)壓最大下降速率(-DP/DTMAX)等指標(biāo)。

1.6 心肌梗死面積：TCC染色，圖像處理軟件對非梗死區(qū)與梗死區(qū)進(jìn)行面積測定并計算評估。

1.7 HE染色：心肌組制備石蠟切片，行HE染色。

1.8 血清心肌酶：取血離心，全自動生化檢測儀測定肌酸激酶同工酶（CK-MB),乳酸脫氫酶（LDH)，心肌鈣蛋白L（CTNL）活性。

1.9 心肌組織髓過氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD)水平：按說明行ELISA實驗。

1.10 心肌組織中炎癥因子：ELISA法檢測血清白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平。

1.11 Western Blot實驗：取心肌組織行SDS-PAGE電泳，加入一、二抗孵育。ECL顯影，分析蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 心臟功能參數(shù)：模型組LVEDP顯著升高。與模型組比，高劑量組LVSP、+DP/DTMAX、-DP/DTMAX顯著增高,LVEDP顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。見圖1。

2.2 心肌梗死面積測定：見圖1。模型組心肌梗死面積顯著升高。與模型組相比，藥物處理組心肌梗死面積顯著降低（P＜0.05），且高劑量更明顯。

圖1 MIRI大鼠心臟功能各項參數(shù)及心肌梗死面積與藥物的關(guān)系（±s，n=6）

2.3 HE染色：見圖2。模型組細(xì)胞整體排列紊亂，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤。與模型組相比，給藥組炎性細(xì)胞浸潤情況改善，細(xì)胞排列逐漸恢復(fù)整齊。

圖2 大鼠腎組織病理學(xué)改變（HE染色，400倍）

2.4 血清心肌酶測定：模型組CK-MB、LDH、CTNL指標(biāo)均上升。與模型組相比，用藥組CK-MB、LDH指標(biāo)均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。見圖3。

圖3 藥物對缺血再灌注大鼠心肌酶活性、心肌組織MPO、MDA、SOD含量的影響（±s，n=6）

2.5 心肌組織中MPO、MDA、SOD水平測定：見圖3，模型組MPO、MDA含量升高，SOD含量降低。與模型組比，低劑量組MPO含量降低，高劑量組MPO、MDA含量顯著降低，SOD含量顯著升高（P＜0.01）。

2.6 心肌組織中炎癥因子測定：見圖4。模型組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高。與模型組比，藥物低劑量組TNF-α含量顯著降低，高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著性降低（P＜0.01）。

圖4 缺血再灌注大鼠心肌組織炎癥因子含量（±s，n=6）

2.7 Western Blot：見圖5。模型組蛋白表達(dá)上升，與模型組比，高劑量組心肌組織中P-NF-κBP65/NF-κBP65、P-IKBα/IKBα蛋白表達(dá)下降（P＜0.01）。

圖5 心肌組織NF-κBP65、P-NF-κBP65、IκBα、P-IKBα蛋白的表達(dá)水平（±s，n=3）

3 討論

心肌缺血損傷發(fā)病因素復(fù)雜不一、對機(jī)體損害大,研究合適的藥物，探究作用機(jī)制是目前研究的重點(diǎn)。本實驗表明用藥組心肌組織變得致密整齊，炎癥因子含量也顯著降低，提示缺血再灌注會影響心肌纖維的排列，當(dāng)歸揮發(fā)油可能通過降低心肌纖維化程度保護(hù)心肌組織。

臨床常用CK-MB、LDH、CTNL指標(biāo)是否上升判斷患者是否存在急性心肌梗死，而本實驗中可用于檢驗心肌缺血模型是否制備成功。用藥組指標(biāo)下降可能是當(dāng)歸揮發(fā)油可以促進(jìn)心肌組織中的有氧氧化、抑制糖酵解，或是促進(jìn)LDH轉(zhuǎn)化成丙酮酸，共同起到保護(hù)心肌組織的作用。研究表明[2]，組織缺血時氧自由基（OFR)的清除能力會降低，造成心肌細(xì)胞損傷。在本實驗給藥后SOD活性升高，脂質(zhì)過氧化物MDA含量降低，提示當(dāng)歸揮發(fā)油可增強(qiáng)OFR活性，減輕脂質(zhì)過氧化損傷。

NF-κB是一種核蛋白因子，IκBα的表達(dá)依賴于NF-κB的活化，產(chǎn)生的IκBα蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與活化的NF-κB結(jié)合，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。MIRI時，NF-κB能夠調(diào)控血清IL-1β、IL-6、TNF-α，使其含量升高，而用藥后相關(guān)炎癥因子含量降低，提示當(dāng)歸揮發(fā)油對NF-κB有一定的抑制作用。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明當(dāng)歸揮發(fā)油對MIRI致心肌損傷大鼠具有一定的保護(hù)作用，能夠減少心肌損傷和心肌梗死面積，使炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激降低，下調(diào)PNF-κBP65、P-IκBα蛋白的表達(dá)水平。