王小惠，白新秀，朱姍姍，劉魯?shù)?，趙雅文，楊嘉璐，夏 敏

（中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州 510080）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）及其所導(dǎo)致的心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的重大非傳染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)顯示，2016 年大約有1 790 萬(wàn)人死于心血管疾病，占全球總死亡人數(shù)的31%［1］。動(dòng)脈粥樣硬化是由脂質(zhì)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核來(lái)源的巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等多因素共同參與的慢性炎癥性疾?。?-4］，但由于其發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，目前尚未完全闡明，仍然缺乏有效的預(yù)防及治療措施。腸道菌群指的是定植在宿主腸道內(nèi)的所有微生物群落，人類腸道細(xì)菌群的微生物體數(shù)量可達(dá)1014［5］。腸道菌群在調(diào)節(jié)宿主機(jī)體營(yíng)養(yǎng)、代謝和免疫方面發(fā)揮了重要作用。以往多項(xiàng)研究表明，腸道菌群失調(diào)與多種代謝性疾病有關(guān)，包括肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾?。?-8］。膳食干預(yù)調(diào)節(jié)腸道菌群及其代謝物是防治心血管疾病的重要手段。副干酪乳桿菌屬于厚壁菌門、桿菌科、乳酸桿菌屬，廣泛存在于人體腸道和口腔中，是一類常用于發(fā)酵乳制品和蔬菜制品的益生菌［9］。研究結(jié)果顯示，副干酪乳桿菌具有一系列有益于機(jī)體健康的作用，在多種慢性代謝性疾病如肥胖、2 型糖尿病、非酒精性脂肪肝、腸易激綜合征等的轉(zhuǎn)歸方面發(fā)揮了重要的作用［10-13］。目前，關(guān)于副干酪乳桿菌延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的作用及其具體的作用機(jī)制尚未清楚，需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。本研究擬通過(guò)高脂高膽固醇飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，建立動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，進(jìn)而通過(guò)副干酪乳桿菌干預(yù)，觀察ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積、動(dòng)脈局部的炎癥反應(yīng)程度、巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積，探討副干酪乳桿菌抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF 級(jí)ApoE-/-小鼠（C57BL/6）30 只，6 周齡，采購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXX（粵）2017-0080，動(dòng)物房溫度（22±2）℃，濕度（45±15）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑

正常對(duì)照飼料（1010009，3 616 kcal/kg）采購(gòu)于江蘇省協(xié)同生物醫(yī)藥工程有限責(zé)任公司，高脂高膽固醇飼料（B12790D，4686kcal/kg）采購(gòu)于RD 公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、總甘油三酯（total triglyceride，TG）高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-c）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-c）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；CD36 抗體（sc-9154）、SR-A 抗體（sc-20444）均采購(gòu)自Santa Cruz 公司，脫脂奶粉、二氟乙烯膜、ECL 發(fā)光試劑盒、甘氨酸、丙烯酰胺、N，N’-甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉、四溴苯酚磺酞、過(guò)硫酰胺、四甲基乙二胺、油紅O粉末均采購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。

冰凍切片機(jī)CM1950型（Leica 公司）、正置立體式顯微鏡M125 型（Leica 公司）、激光共聚焦顯微鏡TCS SP5 型（Leica 公司）、熒光酶標(biāo)儀Infinite F200型（Tecan公司）。

1.3 副干酪乳桿菌的培養(yǎng)

副干酪乳桿菌（DSM 20207）采購(gòu)于德國(guó)DSMZ菌庫(kù)，培養(yǎng)基采用ATCC Medium 2431培養(yǎng)基，將培養(yǎng)獲得的菌體以每5×109CFU 用200 μL 含終濃度為10%甘油的無(wú)菌PBS重懸后，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠的建立

ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為3 組，每組10 只，分別為正常飼料對(duì)照組、模型組和副干酪乳桿菌干預(yù)組。除正常飼料對(duì)照組外，其余各組均采用高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)12 周建立動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型，高脂高膽固醇飼料的配方為20%蛋白質(zhì)、50%碳水化合物、21%脂肪、0.21%膽固醇。模型組每天灌胃無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液，灌胃體積為200 μL，副干酪乳桿菌干預(yù)組每天灌胃5×109CFU 的副干酪乳桿菌，灌胃體積為200 μL，連續(xù)干預(yù)12周。

1.5 葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)

在干預(yù)滿12 周時(shí)，各組小鼠禁食14 h 后測(cè)定禁食血糖并稱量體質(zhì)量，每只小鼠經(jīng)皮下注射1.5 mg/g 體質(zhì)量的葡萄糖溶液，并分別在注射后的15 min、30 min、60 min、90 min、120 min 測(cè)定小鼠的血糖并記錄。

1.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取

在各組小鼠飼養(yǎng)結(jié)束前3 d，分別腹腔注射2 mL 3%的巰基乙醇酸鈉培養(yǎng)基以使巨噬細(xì)胞向腹腔聚集；用14 mg/mL 的戊巴比妥鈉麻醉后處死，75%酒精消毒后轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)中，用預(yù)先高壓滅菌的眼科剪及眼科鑷小心剪開(kāi)并暴露小鼠的腹膜；使從小鼠左下腹部腹膜處緩慢注入預(yù)冷的含1%胎牛血清的PBS 緩沖液。用10 mL 無(wú)菌注射器從小鼠腹膜中部緩慢吸出細(xì)胞懸液并用70 μm 的濾膜過(guò)濾后收集于50 mL無(wú)菌離心管中；重復(fù)以上過(guò)程2-3 次以盡可能多的收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。4 ℃，200×g離心5 min 收集到的巨噬細(xì)胞懸液，重懸巨噬細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞懸液的密度并進(jìn)行調(diào)整。以1.5×107的密度將細(xì)胞接種于細(xì)胞6 孔板中，以5×105的密度將細(xì)胞接種于共聚焦皿中。在含5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)4 h。小心棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基并用無(wú)菌PBS 輕柔沖洗培養(yǎng)皿3 次，去除未貼壁的細(xì)胞。加入RPMI 1640 完全培養(yǎng)基后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.7 腹腔巨噬細(xì)胞膽固醇外流能力的測(cè)定

取出在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)了24 h 的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞棄掉培養(yǎng)基，并用溫?zé)岬臒o(wú)菌PBS 洗3 次后加入含終濃度為1 μg/mL NBD-膽固醇的無(wú)酚紅PRMI 1640 培養(yǎng)基孵育6 h；然后，用溫?zé)岬臒o(wú)菌PBS 洗3 次后分別加入含終濃度為50 μg/mL apo AI、50 μg/mL HDL的無(wú)酚紅PRMI 1640培養(yǎng)基孵育6 h 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇外流，孵育結(jié)束后收集培養(yǎng)基于1.5 mL 的離心管中。然后，用溫?zé)岬臒o(wú)菌PBS 洗3 次后加入200 μL RIPA 裂解液裂解細(xì)胞30 min 后收集細(xì)胞裂解液，在常溫條件下100×g離心10 min 去除細(xì)胞碎片。分別取100 μL 細(xì)胞裂解液上清液和細(xì)胞培養(yǎng)基于黑底96 孔板中，采用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定樣品中NBD-膽固醇的熒光強(qiáng)度。膽固醇外流率為孵育6 h后細(xì)胞培養(yǎng)液的熒光強(qiáng)度與6 h后細(xì)胞培養(yǎng)液的熒光強(qiáng)度加上細(xì)胞裂解液的熒光強(qiáng)度的比值，需要用不含NBD-膽固醇的PRMI 1640的培養(yǎng)基及RIPA裂解液做空白校正。

1.8 腹腔巨噬細(xì)胞中性脂肪蓄積的測(cè)定

將已在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞棄掉培養(yǎng)基，并用40 g/L 多聚甲醛固定20 min，棄掉固定液并用PBS 緩沖液洗2 次；然后，用Bodipy495/503 染色工作液（1：1 000），37 ℃避光染色30 min，PBS 洗2 次，最后用DAPI（1：500），37 ℃避光染色30 min，染色結(jié)束后棄掉染液，最后用PBS 洗2 次，并加1 mL PBS 緩沖液保持細(xì)胞的濕潤(rùn)狀態(tài)，于共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 腹腔巨噬細(xì)胞膽固醇的吞噬

取出在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)了24 h 的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞棄掉培養(yǎng)基，并用含10 μg/mL Dil-ox-LDL 的PRMI 1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基干預(yù)6 h，干預(yù)結(jié)束后棄掉培養(yǎng)基并用PBS 緩沖液清洗細(xì)胞3 次，然后用40 g/L 多聚甲醛常溫固定細(xì)胞20 min，固定結(jié)束后再次用PBS 緩沖液清洗細(xì)胞3 次，最后用DAPI（1：500），37 ℃避光染色30 min，染色結(jié)束后棄掉染液，最后用PBS洗2次，并加1 mL PBS緩沖液保持細(xì)胞的濕潤(rùn)狀態(tài)，于共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.10 酶法檢測(cè)血脂水平

小鼠血液樣品于4 ℃條件下800×g離心20 min，收集小鼠血清，按照試劑盒的說(shuō)明及操作流程加入相應(yīng)的試劑反應(yīng)進(jìn)行血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、總甘油三酯（total triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-c）及低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-c）含量的測(cè)定。

1.11 心臟組織切片、染色及圖像處理

心臟組織用PBS緩沖液充分灌洗掉血液之后，浸潤(rùn)于OCT 組織包埋劑中，放入-20 ℃冰箱中，待組織冷凍成固體狀態(tài)時(shí)置于冰凍切片機(jī)中切片，將組織切為10 μm 厚的連續(xù)冰凍切片，心臟組織切片常溫復(fù)溫20 min，用40 g/L多聚甲醛固定20 min，于60%異丙醇中浸潤(rùn)20 s；油紅O 工作液染色20 min后，將切片置入60%異丙醇中清洗10 s，雙蒸水清洗掉浮色后用蘇木素染液染色10 s，再次用雙蒸水清洗切片，待切片水分風(fēng)干后，用蘇木素返藍(lán)液返藍(lán)2 min，染色結(jié)束后，用甘油明膠封片并進(jìn)行拍照，采用Image J 軟件對(duì)主動(dòng)脈竇斑塊面積的大小進(jìn)行定量分析。

1.12 主動(dòng)脈病理學(xué)觀察

動(dòng)物干預(yù)結(jié)束后，用PBS緩沖液對(duì)小鼠心臟進(jìn)行灌注，利用小鼠體循環(huán)的特點(diǎn)，將左心室及脈管系統(tǒng)中的血液充分沖洗干凈，使用眼科剪將心臟去除并包埋，在立體顯微鏡下觀察并用顯微鑷及顯微剪小心剝離血管外膜上附著的脂肪及其他組織。剝離干凈后，用顯微剪小心將血管縱向剖開(kāi)，并用PBS 緩沖液清洗2 次。用油紅O 工作液染色20 min，60%異丙醇清洗20 s，染色結(jié)束后將主動(dòng)脈平鋪于黑色方形橡膠板，并用細(xì)針固定，于立體顯微鏡下拍照，以斑塊面積占血管面積的百分比代表動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.13 蛋白質(zhì)印跡法

蛋白印跡法（western blot，WB）檢測(cè)巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白CD36、SR-A 的表達(dá)。細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的處理后，PBS洗滌3次，收集細(xì)胞，采用RIPA裂解液收集總蛋白并用BCA蛋白定量法測(cè)定總蛋白的濃度。進(jìn)行10%十二烷基硫磺鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用恒壓100 V電轉(zhuǎn)120 min的條件將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用TBST 緩沖液清洗PVDF膜5 min后，用5%脫脂牛奶封閉90 min。用相應(yīng)的一抗于4 ℃冰箱搖床孵育過(guò)夜，洗滌后用二抗在室溫孵育1 h。洗滌后采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影，使用Image J軟件進(jìn)行各目的蛋白的蛋白凈光密度值。

1.14 熒光定量PCR

采用Trizol 法提取中RNA 后，根據(jù)Takara 公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RR036A 說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行cDNA 的合成。熒光定量PCR 反應(yīng)步驟參照Takara 公司試劑盒DRR081A 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，引物序列如表1 所示。在vii A7 Quantitative PCR System（美國(guó)Applied Biosystems）進(jìn)行PCR 反應(yīng)，以熒光定量PCR 基因表達(dá)量q=2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算ABCA1 及ABCG1 基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列Table 1 The sequence of primers

1.15 免疫熒光染色

從-80 ℃冰箱中取出主動(dòng)脈竇切片并常溫復(fù)溫30 min，用PBS 洗滌切片3 次，洗滌結(jié)束后，用40 g/L 多聚甲醛固定組織20 min；用PBS 洗滌切片3次，去除殘留在組織上的40 g/L 多聚甲醛，于黑色避光濕盒中用5% BSA 室溫孵育組織90 min；用PBS 按照1：200 的稀釋度稀釋F4/80 抗體和α-actin抗體，將抗體工作液滴加到切片組織上，放置于濕盒4 ℃孵育過(guò)夜；賦予結(jié)束后取出濕盒，室溫復(fù)溫30 min 后，用PBS 洗滌切片3 次，用PBS 按照1：400的稀釋度稀釋Cy3 標(biāo)記的熒光二抗，將抗體工作液滴加到切片組織上，放置于濕盒中室溫避光孵育60 min；用PBS 洗滌切片3 次，向切片滴加1 μg/mL的DAPI 工作液，放置于避光濕盒中37℃染色30 min；用PBS洗滌切片3次，最后使用抗熒光淬滅劑封片液對(duì)切片進(jìn)行封片后，激光共聚焦進(jìn)行拍照。

1.16 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理分析，各組定量資料都呈正態(tài)分布并且方差齊性采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey HSD；各組定量資料都呈正態(tài)分布但不滿足方差齊性的情況時(shí)采用Welch方差分析，多重比較采用Games-Howell 檢驗(yàn)。樣本量較小采用Kruskal WallisH檢驗(yàn)，P＜0.05 定義為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 副干酪乳桿菌干預(yù)顯著抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成

油紅O 染色結(jié)果顯示，各組小鼠的主動(dòng)脈竇斑塊病變區(qū)域面積（F=23.931，P＜0.001）、主動(dòng)脈大體斑塊病變面積（F=22.780，P＜0.001）的平均水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，副干酪乳桿菌干預(yù)組主動(dòng)脈大體斑塊病變區(qū)域面積比例明顯下降（P＜0.000 1；圖1A）；另外，與模型組相比，副干酪乳桿菌干預(yù)組主動(dòng)脈竇斑塊病變區(qū)域面積明顯減少（P＜0.005；圖1C）。

圖1 副干酪乳桿菌干預(yù)減少高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈斑塊的形成Fig.1 Intervention of Lactobacillus paracasei reduced the formation of atherosclerotic plague of Western diet-fed ApoE-/-mice

2.2 副干酪乳桿菌干預(yù)改善小鼠血脂譜

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組小鼠的血清總膽固醇TC（F=12.597，P＜0.001）、總甘油三酯TG（F=5.629，P＜0.05）、高密度脂蛋白膽固醇HDL-c（F=9.825，P＜0.001）及低密度脂蛋白膽固醇LDL-c（F=25.489，P＜0.001）平均水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清總膽固醇TC、總甘油三酯TG、高密度脂蛋白膽固醇HDL-c 及低密度脂蛋白膽固醇LDL-c平均水平均顯著升高（均P＜0.05）；與模型組相比，副干酪乳桿菌干預(yù)組的TC、TG、HDLc、LDL-c 的平均水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但其結(jié)果提示副干酪乳桿菌干預(yù)有改善血脂水平的趨勢(shì)（圖2）。

圖2 副干酪乳桿菌干預(yù)對(duì)血脂水平的影響Fig.2 The effect of Lactobacillus paracasei intervention on serum lipid levels

2.3 副干酪乳桿菌干預(yù)抑制動(dòng)脈硬化進(jìn)展的作用與糖代謝改變無(wú)關(guān)

經(jīng)尾靜脈檢測(cè)ApoE-/-小鼠的禁食血糖、日常血糖及葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果表明，三組間的平均禁食血糖水平（F=0.393，P＞0.05）、平均日常血糖水平（F=0.165，P＞0.05）、葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)平均血糖水平（F=1.066，P＞0.05）差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示：副干酪乳桿菌干預(yù)不影響ApoE-/-小鼠的糖代謝功能（圖3）。

圖3 副干酪乳桿菌干預(yù)對(duì)血糖的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus paracasei intervention on glucose metabolism

2.4 副干酪乳桿菌干預(yù)抑制巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞浸潤(rùn)

巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和血管平滑肌細(xì)胞的遷移與增殖可進(jìn)一步促進(jìn)動(dòng)脈血管局部的炎癥反應(yīng)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展。以F4/80抗體標(biāo)記巨噬細(xì)胞，α-actin 抗體標(biāo)記血管壁平滑肌細(xì)胞。主動(dòng)脈竇組織免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組主動(dòng)竇斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和血管平滑肌細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加，而副干酪乳桿菌干預(yù)可以減少ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4、5）。結(jié)果提示：副干酪乳桿菌干預(yù)可抑制高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈血管局部炎癥反應(yīng)。

圖4 副干酪乳桿菌干預(yù)對(duì)主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的影響Fig.4 The effect of Lactobacillus paracasei intervention on macrophages infiltration in aortic root plaque

圖5 副干酪乳桿菌干預(yù)對(duì)主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞浸潤(rùn)的影響Fig.5 The effect of Lactobacillus paracasei intervention on smooth muscle cells infiltration in aortic root plaque

2.5 副干酪乳桿菌干預(yù)抑制巨噬泡沫細(xì)胞的形成

經(jīng)Bodipy493/503 染色結(jié)果表明，與正常飼料對(duì)照組相比，模型組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積水平明顯升高（P＜0.000 1）。與模型組相比，副干酪乳桿菌干預(yù)組的腹腔巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積程度明顯降低（P＜0.01）。正常飼料組與副干酪乳桿菌干預(yù)組的腹腔巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，副干酪乳桿菌干預(yù)可抑制巨噬泡沫細(xì)胞的形成（圖6）。

圖6 副干酪乳桿菌干預(yù)對(duì)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響Fig.6 The effect of Lactobacillus paracasei intervention on lipid accumulation of macrophages

2.6 副干酪乳桿菌干預(yù)降低巨噬細(xì)胞膽固醇吞噬

巨噬細(xì)胞主要通過(guò)吞噬ox-LDL 形成巨噬泡沫細(xì)胞，為進(jìn)一步探究副干酪乳桿菌干預(yù)如何抑制巨噬泡沫細(xì)胞的形成，采用10 μg/mL Dil-ox-LDL 分別處理正常飼料對(duì)照組、模型組、副干酪乳桿菌干預(yù)組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞6 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7 所示，與模型組相比，副干酪乳桿菌干預(yù)能明顯降低巨噬細(xì)胞對(duì)Dil-ox-LDL 的吞噬（P＜0.01）。CD36和SR-A 是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇吞噬的主要受體蛋白，如圖8 所示，與模型組相比，副干酪乳桿菌干預(yù)組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中SR-A 蛋白水平明顯降低（P＜0.05）；而CD36的表達(dá)不受副干酪乳桿菌的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，副干酪乳桿菌干預(yù)可通過(guò)抑制SR-A受體蛋白的表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞對(duì)膽固醇的吞噬。

圖7 副干酪乳桿菌干預(yù)對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇吞噬的影響Fig.7 The effect of Lactobacillus paracasei intervention on cholesterol uptake of macrophages

圖8 副干酪乳桿菌干預(yù)對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇吞噬相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.8 The effects of Lactobacillus paracasei intervention on cholesterol uptake related gene expression of macrophages

2.7 副干酪乳桿菌抑制巨噬泡沫細(xì)胞形成的作用與膽固醇外流無(wú)關(guān)

副干酪乳桿菌干預(yù)對(duì)HDL 及Apo-AI 介導(dǎo)的膽固醇外流能力均無(wú)明顯影響。ABCA1 和ABCG1是負(fù)責(zé)巨噬細(xì)胞膽固醇外流的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，正常飼料組、模型組和副干酪乳桿菌干預(yù)組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞中ABCA1、ABCG1mRNA 表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，副干酪乳桿菌干預(yù)對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇外流能力及其相關(guān)蛋白的mRNA 表達(dá)均無(wú)明顯影響（圖9）。

圖9 副干酪乳桿菌干預(yù)對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇外流及相關(guān)受體基因表達(dá)的影響Fig.9 Effects of Lactobacillus paracasei intervention on cholesterol efflux and expression of ABCA1 and ABCG1 mRNA of macrophages

3 討論

本研究首次探明了副干酪乳桿菌干預(yù)能夠有效抑制動(dòng)脈斑塊部位巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)、血管平滑肌的遷移與增生，減少巨噬細(xì)胞泡沫化，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成及其所致的心血管疾病具有一定的預(yù)防和治療作用。研究使用8 周齡的雄性ApoE-/-小鼠，高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)12 周，成功建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展作用主要從以下3個(gè)方面來(lái)解釋。首先，副干酪乳桿菌干預(yù)有效抑制小鼠動(dòng)脈血管局部的炎癥反應(yīng)，從而抑制脈管系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞的黏附聚集及血管平滑肌細(xì)胞的遷移與增生。其次，副干酪乳桿菌對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞膽固醇吞噬相關(guān)的受體蛋白SR-A 具有一定的調(diào)控作用，抑制了巨噬細(xì)胞對(duì)膽固醇的吞噬，從而抑制了巨噬泡沫細(xì)胞的形成，減少巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積。最后，副干酪乳桿菌干預(yù)能夠改善小鼠的血脂譜。

副干酪乳桿菌廣泛存在于人體腸道和口腔中，是一類常用于發(fā)酵乳制品和蔬菜制品的益生菌。既往的研究結(jié)果表明，副干酪乳桿菌可抑制脂多糖介導(dǎo)的腸道炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)腸道黏膜修復(fù)及其功能恢復(fù)［14］。副干酪乳桿菌還能通過(guò)抑制炎癥因子的產(chǎn)生，發(fā)揮其延緩系統(tǒng)性紅斑狼瘡所誘導(dǎo)的心血管疾病進(jìn)展的作用［15］。此外，副干酪乳桿菌還可以抑制豬肺泡巨噬細(xì)胞膽固醇的蓄積，并且通過(guò)抑制豬肺泡中脂多糖介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)肺泡正常功能的作用［16］。然而，副干酪乳桿菌對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌干預(yù)有效抑制高脂高膽固醇誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

動(dòng)脈粥樣硬化是多因素共同參與的慢性炎癥反應(yīng)單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［17］。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的早期，動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，釋放多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附聚集并分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝功能紊亂是形成泡沫細(xì)胞的主要原因，巨噬細(xì)胞額脂質(zhì)代謝主要涉及在SR-A 及CD36 受體蛋白的介導(dǎo)下吞噬膽固醇及膽固醇酯與ABCA1、ABCG1 受體蛋白介導(dǎo)下的膽固醇外流［18-21］。當(dāng)巨噬細(xì)胞吞噬膽固醇及膽固醇酯形成巨噬泡沫細(xì)胞后其遷移能力下降，聚集在動(dòng)脈內(nèi)膜損傷的部位。巨噬泡沫細(xì)胞凋亡所釋放脂質(zhì)和促炎因子又進(jìn)一步促進(jìn)脈管系統(tǒng)炎癥的進(jìn)展及脂質(zhì)的蓄積，從而加速動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成［4］。在本研究中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，副干酪乳桿菌的干預(yù)有效減輕動(dòng)脈斑塊局部巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)、血管平滑肌細(xì)胞的浸潤(rùn)和增殖，抑制了動(dòng)脈血管局部的炎癥反應(yīng)和巨噬泡沫細(xì)胞的形成，并降低了巨噬細(xì)胞SR-A 受體蛋白的表達(dá)，但副干酪乳桿菌干預(yù)不影響CD36受體蛋白的表達(dá)；其次，副干酪乳桿菌干預(yù)不影響HDL 及Apo-AI 所介導(dǎo)的膽固醇外流、膽固醇外流相關(guān)蛋白ABCA1 和ABCG1 mRNA 的表達(dá)。高脂血癥及糖代謝紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，副干酪乳桿菌干預(yù)可降低血清LDL-c的水平，但不影響糖代謝。以上結(jié)果提示，副干酪乳桿菌可能通過(guò)抑制動(dòng)脈血管局部的炎癥反應(yīng)及SR-A 所介導(dǎo)的膽固醇吞噬作用和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，發(fā)揮抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的作用。

我們證實(shí)了副干酪乳桿菌可通過(guò)抑制血管局部的炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及SR-A 所介導(dǎo)的膽固醇吞噬作用，減少巨噬泡沫細(xì)胞的形成，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，為動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病防治提供了新靶點(diǎn)。然而，SR-A 作為一種廣泛分布的膜蛋白，可受到多種因素的調(diào)整。副干酪乳桿菌抑制SR-A表達(dá)的具體機(jī)制亟待進(jìn)一步的探索。