周智博，王卿惠，郭欣欣，徐婧怡，苑世偉，陳彥龍，王世偉

解淀粉芽孢桿菌抑菌蛋白研究進展

周智博1，2，王卿惠3，郭欣欣1，2，徐婧怡1，2，苑世偉1，2，陳彥龍1，2，王世偉1，2

（齊齊哈爾大學 1. 生命與農林學院，2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3. 東北農業(yè)大學 生命科學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

解淀粉芽胞桿菌（）具有廣泛的抑菌活性．在種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、果蔬采后病害防治、環(huán)保、食品安全等領域具有廣泛應用前景，其菌體能產生多種抑菌蛋白．目前，國內外對解淀粉芽胞桿菌抑菌蛋白的研究逐漸深入．綜述了解淀粉芽胞桿菌抑菌蛋白的研究，其中包括解淀粉芽孢桿菌菌株的生境多樣性，解淀粉芽孢桿菌產生的抑菌蛋白種類和作用效果，抑菌蛋白提取、純化、鑒定及其初步的作用機制，以期對解淀粉芽孢桿菌的抑菌蛋白研究、應用及開發(fā)提供科學參考．

解淀粉芽孢桿菌；抑菌蛋白；純化；抑菌機理

盡管化學防治是防治植物病蟲害的有效措施，但隨著農藥的使用和農藥殘留量增加，給環(huán)境造成了巨大的污染和危害．生物防治符合綠色環(huán)保要求，無污染，高效節(jié)能，受到廣泛重視[1]．解淀粉芽孢桿菌（）是一種益生菌，能產生多種抑菌蛋白．近年來，人們對其進行了大量研究，相關報道逐年增加，但報道較為分散，有必要總結歸納．本文對解淀粉芽胞桿菌產生的抑菌蛋白進行了綜述，以期對其開發(fā)和應用提供參考．

1　解淀粉芽孢桿菌的生境多樣性

解淀粉芽孢桿菌分布較廣，具有豐富的生境多樣性．自發(fā)現解淀粉芽孢桿菌可拮抗多種植物病原菌以來，研究人員從各個區(qū)域的作物、土壤、白酒大曲，甚至動物體內分離鑒定了多種解淀粉芽孢桿菌．如寧豫昌[2]等從健康豬腸道中篩選出一株解淀粉芽孢桿菌，命名為MY-6．王偉[3]等從牡蠣中分離1株能產生抑菌活性物質菌株，經形態(tài)特征及16sRNA基因序列鑒定為解淀粉芽孢桿菌，命名為DH 8030．王世偉[4]等在北大倉白酒大曲中分離1株細菌M1-1，經傳統顯微鏡技術結合16sDNA序列鑒定該菌為解淀粉芽胞桿菌．該菌對米曲霉和尖孢鐮刀菌等植物病原菌均有較強的抑制作用．秦楠[5]等從玉米田土壤中分離到一株解淀粉芽孢桿菌HRH31，該菌能產抗菌肽．梁麗瓊[6]等從柑橘根際土壤中分離鑒定了可抑制水稻基腐病菌（）EC1生長的解淀粉芽孢桿菌．Mushtaq[7]等從印度丹希岡（Dachigam）國家公園土壤中分離出一種新的能夠產生堿性蛋白酶細菌（HM48），經鑒定也為解淀粉芽孢桿菌．可見，解淀粉芽孢桿菌具有豐富的生境多樣性，這為解淀粉芽孢桿菌的分離、篩選和開發(fā)提供了堅實的基礎．

2　解淀粉芽孢桿菌產生的抑菌蛋白

解淀粉芽孢桿菌產生的抑菌蛋白（Antagonistic protein）是由核糖體途徑合成蛋白前體后，經過轉運、翻譯、修飾、跨膜運輸、切除引導肽等過程形成的具有抗微生物活性的蛋白質或抗菌肽，是從解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液中分離的多種蛋白類拮抗物質，主要包括抗菌肽、細胞壁降解酶以及其它抑菌蛋白．

2.1　抗菌肽

抗菌肽（antibiotic peptide）是一類具有抗微生物活性的小分子短肽，能抵御其它病原微生物侵染，在防御反應中起重要作用，其中包括多種細菌素（bacteriocin）．細菌素多為環(huán)肽結構，耐熱性強，對酸堿環(huán)境表現穩(wěn)定，具廣譜抑菌活性．王偉[8]等從解淀粉芽孢桿菌中提取了一種細菌素Amylocyclicin W5，它不僅能抑制蠟樣芽孢桿菌（）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（），還可能對腸出血性大腸桿菌（O157：H7）產生抑制作用．Bindiya[9]等在解淀粉芽孢桿菌中分離和純化了一種細菌素BaCf3BTSS3，它對一些食品腐敗細菌的生長和生物膜形成具有抑制潛力，具有較強的pH和溫度耐受性，但對氧化劑和還原劑較為敏感．該細菌素的序列分析顯示，其C6和C13之間存在二硫鍵．微量滴定板實驗證明，BaCf3可以減少高達80%的生物膜，同時對3-TL3細胞系沒有細胞毒性．Regmi[10]等從發(fā)酵泡菜中篩選出與解淀粉芽孢桿菌同源高達99.79%的亞種FZB42（T），并從中純化到分子量為4.6 kDa的抗菌肽CSpK14．該抗菌肽在pH 6.0～11.5，80 ℃下穩(wěn)定，對各種金屬離子、溶劑和蛋白酶也很穩(wěn)定．具有廣泛的抑制譜及抗生物膜的協同作用．可見，解淀粉芽孢桿菌合成的抗菌肽類蛋白質有比較獨特的抗逆性，抗菌譜廣泛，充分挖掘其抗菌肽蛋白對病原微生物的防治具有潛在價值．

2.2　細胞壁降解酶

解淀粉芽孢桿菌產生的細胞壁降解酶（Cell wall degrading enzyme）也是一種重要的抑菌蛋白，主要包括：幾丁質酶、-1，3-葡聚糖酶、內切葡聚糖酶和DEF-纖維素蛋白酶．茍艷[11]等以殼聚糖為唯一碳源從土壤中分離篩選出一株具有產殼聚糖酶能力的解淀粉芽孢桿菌MY001，其可直接分解幾丁質，在幾丁質資源清潔利用和農作物真菌病害生物防治方面具有重要潛能．郭繼平[12]等從解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液中篩選到53種蛋白質，其中4種蛋白質參與了幾丁質降解．-1，3-葡聚糖是真菌細胞壁的主要成分，對真菌生長具有重要作用．-1，3-葡聚糖酶能夠水解-1，3-葡聚糖成為葡萄糖和小分子寡糖．由于-1，3-葡聚糖酶在植物病原真菌的生物防治方面具有重要應用價值，因此受到人們的廣泛關注[13]．Kim[14]等研究了解淀粉芽孢桿菌MET0908抑菌蛋白，其分子質量為40 ku，具有-1，3-葡聚糖酶活性，對黃瓜炭疽病具有拮抗作用．可見，降解真菌細胞壁的相關酶是解淀粉芽孢桿菌重要的抑菌蛋白，對其進行的研究將在植物病原真菌的生物防治中具有開發(fā)和應用潛力．

Rajaselvam[15]等從發(fā)酵的大豆中篩選出解淀粉芽孢桿菌菌株KJ10，其能分泌一種能溶解纖維蛋白的蛋白酶，該酶最適pH為8.0，在40～55 ℃范圍內具有較高活性．劉宇[16]等用含羧甲基纖維素鈉的培養(yǎng)基結合剛果紅染色法，從玉米青貯飼料樣品中篩選到一株產纖維素酶的益生菌，通過形態(tài)學和系統進化樹鑒定該菌為解淀粉芽孢桿菌．其粗酶液的濾紙酶活為2.500 5×10-8mol/（s·mL），外切葡聚糖酶活性為2.167 1×10-8mol/（s·mL），內切葡聚糖酶活性為1.066 88×10-7mol/（s·mL），-葡萄糖苷酶活性為3.834 1×10-8mol/（s·mL）．該菌產生的纖維素酶可降解細胞壁，在抑制植物病原真菌方面具有一定的價值．

2.3　其它抑菌蛋白

解淀粉芽孢桿菌還能產生含50個氨基酸的抑菌蛋白，是主要的抑菌蛋白．這些抑菌蛋白對大部分蛋白酶、溫度及酸堿性不敏感，其結構與化學性質較穩(wěn)定，并可拮抗多種病原菌．近年來，科研工作者分離純化了多種抑菌蛋白，只確定了其分子量及部分性質，但其立體結構和氨基酸序列尚有待進一步研究．王曉輝[17]等從解淀粉芽孢桿菌K1發(fā)酵液中獲得一種分子量為55 kDa的抑菌蛋白，該蛋白可有效抑制灰霉病菌（）生長．王彪[18]等經硫酸銨沉淀、透析除鹽等技術從解淀粉芽孢桿菌ASR-12發(fā)酵液中分離純化了一種抑菌蛋白，經SDS-PAGE檢測獲得一條單一條帶，通過計算，分子量約為50 kDa．王培松[19]采用硫酸銨分級沉淀從解淀粉芽孢桿菌MG-3發(fā)酵液中提取了粗蛋白，經DEAE-650C弱陰離子交換層析和Sephacry1 S-200凝膠層析的組合策略，純化了粗蛋白，通過SDS-PAGE電泳檢驗證實該蛋白分子量約45 kDa．以枇杷焦腐病菌為供試菌株，驗證該抑菌蛋白對枇杷焦腐病菌具有很好的抑制作用．Wang[20]等從解淀粉芽孢桿菌FS6培養(yǎng)液的上清液中純化一種抑菌蛋白，經鑒定證實該蛋白屬于LCI家族，命名為APC（2）．該蛋白對茄屬植物及人參根腐病具有保護作用．可見，對解淀粉芽孢桿菌抑菌蛋白的純化是后續(xù)對其進行研究的基礎，這些較大分子量的抑菌蛋白穩(wěn)定性較好，一般對植物病原菌具有較強抗性．隨著研究的深入，將使這類抑菌蛋白得到更好地開發(fā)利用．

3　解淀粉芽胞桿菌抑菌蛋白的作用效果

3.1　對真菌的作用

解淀粉芽胞桿菌抑菌蛋白能直接抑制病原性真菌．Qin[21]等從解淀粉芽孢桿菌HRH317中分離一種抑菌蛋白，分子量為36 kDa，并經牛津杯法檢測了抑菌蛋白的活性．研究發(fā)現，該蛋白的抗菌譜較廣，尤其對水果腐敗霉菌有較好的抑制作用．Xu[22]等研究發(fā)現，解淀粉芽孢桿菌MQ01對尖孢鐮刀菌、核盤菌、增殖鐮刀菌、輪枝孢子菌、膠孢炭疽菌、雪花小孢子菌、木賊鐮刀菌、半蓋鐮刀菌8種植物病原體具廣譜抗真菌活性．提取其抗真菌物質，經分離鑒定、蛋白質同源性分析，證明其2種拮抗蛋白類物質為幾丁質結合蛋白和枯草桿菌蛋白酶．Xu[23]等對純化的解淀粉芽孢桿菌H6ZTE138蛋白進行了序列比對，證明其為一種蛋白酶，屬于輔酶A硫酯酶的YBGC/FADM家族．該蛋白可裂解禾谷鐮刀菌產生的真菌毒素ZEA．Fan[24]等從解淀粉芽孢桿菌MG-3中分離得到抗真菌蛋白MG-3A ，通過純化鑒定可能是一種絲氨酸蛋白酶，分子量接近48 kDa，表現出廣泛的抗真菌譜，可有效延長枇杷果實保質期至25 d．Fang[25]等從解淀粉芽胞桿菌CMN1308中分離出一種抗真菌蛋白，分子量為22.4 kDa，鑒定為幾丁質結合蛋白，可以降解真菌細胞壁中的幾丁質成分．可見，很多從解淀粉芽孢桿菌產生的抑菌蛋白的抑菌作用均具有寬泛的抑菌譜．這些抑菌蛋白的后續(xù)研究將對植物病原菌的生物防治具有巨大價值．同時，也為研究真菌-植物-解淀粉芽孢桿菌的生態(tài)互作提供有針對性的科學參考．

3.2　對細菌的作用

解淀粉芽孢桿菌不僅對真菌有抑制作用，其中一些菌株的抑菌蛋白對細菌也產生抑制作用．朱永明[26]等研究發(fā)現，解淀粉芽孢桿菌B-4M-6菌株胞外產的抑菌蛋白能抑制腸道大腸桿菌、沙門氏菌的生長，并且能夠產生各種消化酶促進腸道的消化吸收．Mukherjee[27]等純化出的抑菌蛋白屬于堿性蛋白酶，可以抑制腸道產細菌病原菌作用，以此來預防魚類腸道疾?。壳?，解淀粉芽孢桿菌抑制細菌的蛋白活性物質的研究報告的逐年增多，研究也不斷深入，對解淀粉芽孢桿菌產生的能抑制細菌的抑菌蛋白的研究、開發(fā)和利用，將不斷拓寬解淀粉芽孢桿菌抑菌蛋白在食品和果蔬保藏等領域的應用范圍，具有潛在的應用價值．

4　解淀粉芽胞桿菌抑菌蛋白的分離純化與鑒定

4.1 解淀粉芽胞桿菌抑菌蛋白的分離純化

抑菌蛋白的分離純化是研究其結構、功能、性質的基礎．解淀粉芽孢桿菌分泌產生的抑菌蛋白可采用凱氏定氮法[28]進行粗蛋白含量測定．粗提抑菌蛋白的方法主要包括：酸堿沉淀法、硫酸銨沉淀法等．針對抑菌蛋白特性，可選擇不同的提取方法．目前，對抑菌蛋白的分離和精制多采用硫酸銨鹽析后分步柱層析，包括離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析等[29-32]．對經純化得到的抑菌蛋白，可通過SDS-PAGE對其進行分子量測定．陳寶莉[33]等從解淀粉芽孢桿菌中克隆得到新型-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，成功構建了含重組質粒的轉化細胞．細胞經振蕩培養(yǎng)，離心收集上清液后，再經超聲波破碎收集細胞的上清液，使用Ni-IDA親和層析進行重組蛋白純化，洗脫并收集目的蛋白，用SDS-PAGE電泳對蛋白分子質量進行檢測．Zhu[34]等采用硫酸銨沉淀法分離解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液中的主要抑菌物質，經DEAE瓊脂糖凝膠快速流動弱陰離子交換層析和葡聚糖凝膠G-50分子篩層析純化后，獲得分子量約29.0 kDa的抑菌蛋白．可見，解淀粉芽孢桿菌的抑菌蛋白純化同其它蛋白質純化的方法大同小異，可以先進行硫酸銨或酸沉淀，然后根據抑菌蛋白活性，再經過各種層析方法對粗提取的抑菌蛋白進行精制．通過SDS-PAGE對抑菌蛋白的純度進行檢驗，測定抑菌蛋白的分子量等相關參數，為抑菌蛋白的鑒定奠定基礎．

4.2　解淀粉芽孢桿菌抑菌蛋白的鑒定

解淀粉芽孢桿菌抑菌蛋白純化后需要對其進行分析與鑒定．確定抑菌蛋白常采用質譜法，該方法主要能測定蛋白質一級結構，包括蛋白質的分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數目和位置，這些研究對抑菌蛋白的結構分析十分重要[35]．同時，質譜技術常與液相色譜聯用分析復雜的抑菌蛋白質．根據離子源的不同，質譜可分為電噴霧離子化質譜（ESI-MS）、熱噴霧離子化質譜（HEI-MS）、二次離子質譜（SIMS）、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）等．在進行蛋白質鑒定時，可根據所測數據用不同的軟件進行檢索、比對，進而對未知蛋白進行鑒定[36]44．Zhao[37]等發(fā)現解淀粉芽孢桿菌GSBa-1能產一種新型凝乳酶（MCE），經純化并經LC-MS/MS將其鑒定屬于肽酶M4家族，分子量約為38 kDa．Fang[25]等從CMN1308中提取的真菌蛋白，通過在分離凝膠中添加尿素的Tricine-SDS-PAGE電泳進行了分離．經過質譜分析和蛋白質表征，發(fā)現分離的真菌蛋白在M/Z處顯示最大離子峰為2 679，分子量為29.5 kDa，與蛋白質鞭毛蛋白匹配．細胞外抑菌蛋白菌株CMN1308的尿素-Tricine-SDS-PAGE電泳后顯示4個條帶，而在質譜分析后僅鑒定出2個條帶．帶“A”的最大離子峰M/Z為1 926，分子量為49.8 kDa，經NCBI數據庫對比，與DLDH（二氫硫辛酰胺脫氫酶）匹配．帶“D”顯示M/Z處的最大離子峰為2 936，分子量為22.4 kDa，與幾丁質結合蛋白相匹配．可見，使用在蛋白質結構分析以及多肽氨基酸特異性序列分析中LC-MS和MS-MS串聯方法應用較多．這些方法靈敏，分辨率較高，甚至僅用一段多肽就能鑒別蛋白質的類型[36]44，可用于解淀粉芽孢桿菌抑菌蛋白的分析和鑒別．

5　解淀粉芽孢桿菌抑菌蛋白抑菌機制

解淀粉芽孢桿菌抑菌蛋白主要通過2種方式抑制病原菌生長，一是抑制侵染器官的解淀粉芽孢桿菌分生孢子形成；二是通過水解病原菌細胞壁或改變細胞膜透性，使細胞內容物外泄，菌絲斷裂，抑制病原菌生長．

5.1　抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)

病原菌主要靠分生孢子侵染植物，而解淀粉芽孢桿菌可以使菌絲發(fā)生畸形，菌絲細胞膨大甚至破裂，導致菌絲不能正常產生分生孢子．王彪[38]等采用牛津杯法檢測了解淀粉芽孢桿菌ASR-12粗蛋白對8種病原真菌的抑制作用，同時以小麥雪腐病原菌作指示菌，觀察粗蛋白對病原菌的抑制作用．結果表明，該抑菌蛋白耐高溫、耐紫外，最適pH為7.0，對蛋白酶K和胰蛋白酶不敏感；同時可以抑制大白菜軟腐病菌和8種病原真菌．通過抑制真菌孢子的萌發(fā)，降解真菌菌絲的細胞壁，造成菌絲畸形、膨大、扭曲．Zhang[39]等從解淀粉芽孢桿菌6256分離純化出抗真菌肽P657，對胰蛋白酶和蛋白酶K具有抗性，25 ℃培養(yǎng)24 h后，在體外能完全抑制灰葡萄孢的孢子萌發(fā)．可見，解淀粉芽孢桿菌抑菌蛋白的抑菌機理研究是初步的，但抑菌蛋白對真菌性病原菌孢子萌發(fā)及破壞菌絲的生長是抑菌作用的重要機制．

5.2　影響病原菌細胞膜和細胞壁

解淀粉芽孢桿菌抑菌蛋白的抑菌機理也可能是通過破壞真菌細胞的結構實現．王偉[8]等以蠟樣芽孢桿菌（LMGT2805）為指示菌對解淀粉芽孢桿菌產生的抑菌蛋白的抑菌機理進行探討，通過掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡研究了真菌細胞形態(tài)變化以及細胞內部結構變化．結果表明，抑菌蛋白的主要抑菌機制是破壞其細胞壁，使其形成孔洞，導致其內容物外泄，使細菌（營養(yǎng)或芽孢細菌）無法正常代謝，從而造成細菌的死亡．Xu[22]等研究發(fā)現，解淀粉芽孢桿菌MQ01對8種植物病原菌顯示出廣譜抗真菌活性，提取抗真菌物質，通過分離鑒定及蛋白質同源性分析，表明2種拮抗蛋白類物質為幾丁質結合蛋白和枯草桿菌蛋白酶．這2類抑菌蛋白的協同作用，可使病原菌的細胞壁發(fā)生破壞，從而提高了植株對病原真菌的抵抗力[40]．總之，解淀粉芽孢桿菌抑菌蛋白的抑菌機理可能是通過降解病原菌細胞壁或細胞膜，破壞病原菌細胞結構，使病原菌死亡，達到抑制真菌的目的．這些機理的研究是初步的，還需要深入分析和研究，從而進一步闡明解淀粉芽孢桿菌抑菌蛋白的抑菌機制．

6　展望

隨著生物技術的發(fā)展，在生物防治領域，解淀粉芽孢桿菌作為一種生物防治益生菌代替?zhèn)鹘y化學制劑勢在必行．解淀粉芽孢桿菌廣泛存在于自然界，并且其在眾多研究領域的應用具有獨特的優(yōu)勢．隨著研究該菌產生的抑菌蛋白的報道增多，將對其抑菌蛋白有更深入的了解．分離提純解淀粉芽孢桿菌抑菌蛋白、闡明其復雜的抑菌機理具有重要的研究意義．隨著蛋白質組學和基因組學在微生物領域的應用，解淀粉芽孢桿菌產生抑菌蛋白的分離純化、鑒定以及其抑菌機理的研究將更加明了，這勢必能為“解淀粉芽孢桿菌-動植物-病原菌”三者之間“互作”關系的揭示提供更多的證據和數據，這無疑能使解淀粉芽孢桿菌在動植物病蟲害、生物轉化和生物肥等領域的應用潛力得到更好的發(fā)揮，并為農業(yè)、畜牧業(yè)、食品和醫(yī)藥等重要行業(yè)的開發(fā)和應用奠定基礎．

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Research progress of antagonistic protein of

ZHOU Zhibo1，2，WANG Qinghui3，GUO Xinxin1，2，XU Jingyi1，2，YUAN Shiwei1，2，CHEN Yanlong1，2，WANG Shiwei1，2

（1. School of Life Sciences，Agriculture and Forestry，2. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas，Qiqihar University，Qiqihar，161006，China；3. School of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

has a wide range of antagonistic activities．It has a wide application prospects in the fields of planting，aquaculture，post harvest disease control of fruits and vegetables，environmental protection，food safety and so on．It can also produce a variety of antimicrobial proteins．At present，the research on its antagonistic protein is gradually in-depth around the world．Reviews the research on the antimicrobial proteins of，including the habitat diversity ofstrains，the types and effects of antimicrobial proteins produced by，the extraction and purification of antimicrobial proteins，the identification of antimicrobial proteins and their preliminary mechanism，in order to provide scientific reference for application and development of the antimicrobial proteins ofin related fields．

；antagonistic protein；purification；antagonistic mechanism

1007-9831（2022）04-0064-06

Q93

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2022.04.013

2021-12-30

2021年黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃資助項目（202110232101）

周智博（2001-），男，河南鶴壁人，在讀本科生．E-mail：1178975020@qq.com

王世偉（1965-），男，山東肥城人，教授，博士，從事微生物遺傳與發(fā)酵工程研究．E-mail：wsw888535@sohu.com