王立言，邴馨，劉尚明*，王輝，陳艷雯

（山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué)與電鏡中心，濟(jì)南 250012）

脫鈣是制備骨組織透射電鏡樣品的第一步。然而，如何縮短脫鈣時(shí)間，把握脫鈣終點(diǎn)，減少脫鈣過(guò)程中對(duì)組織的損傷，盡可能保持骨組織原有的微細(xì)結(jié)構(gòu)，一直是研究人員密切關(guān)注的問(wèn)題。傳統(tǒng)的脫鈣方法一般采用復(fù)合酸類脫鈣液，其效果不穩(wěn)定，對(duì)細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)的破壞及對(duì)染色的影響，已不能滿足透射電鏡觀察的要求[1,2]；EDTA脫鈣的作用優(yōu)于酸性脫鈣液，但脫鈣周期長(zhǎng)，一般需要2-4周，不利于科研實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展。本方法通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，采用JYBL-Ⅱ組織脫鈣液并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，對(duì)骨組織脫鈣后進(jìn)行透射電鏡樣品制備，在電鏡下觀察取得良好效果，同時(shí)很大程度的降低了脫鈣時(shí)間。

材料與方法

1 標(biāo)本

取小鼠新鮮股骨組織，大小為1 mm×1 mm×3 mm。

2 試劑

改進(jìn)的脫鈣液為L(zhǎng)eagene JYBL脫鈣液、戊二醛及磷酸緩沖液按一定比例配制而成的混合液。具體配制方法如下：100 mL Leagene JYBL-Ⅱ脫鈣液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）、20 mL 25%戊二醛（SPI，美國(guó)）、40 ml 0.2 mol/L，pH7.4 磷酸緩沖液混合均勻，4℃冰箱保存。

3 實(shí)驗(yàn)方法

傳統(tǒng)脫鈣方法：將取好的骨組織入預(yù)冷的3%戊二醛中，4℃下固定2~4 h或更長(zhǎng)。骨組織固定好后入緩沖、等滲、中性EDTA脫鈣液中，4 ℃下振蕩脫鈣2~4周。

改良脫鈣方法：將取好的骨組織立刻投入到3%戊二醛與4%多聚甲醛的混合液中，4 ℃固定12 h；0.1 mol/L、pH7.4磷酸緩沖液浸洗1 h（0~4℃）；棄去緩沖液，在小瓶中加入改進(jìn)脫鈣液對(duì)骨組織進(jìn)行脫鈣（4 ℃）。脫鈣液要沒(méi)過(guò)骨組織，約為骨組織體積的40倍；脫鈣時(shí)間控制在24 h以內(nèi)：每隔一段時(shí)間檢測(cè)一次脫鈣程度，在骨組織富有彈性、針刺無(wú)阻力感時(shí)即可終止脫鈣。在保證超薄切片質(zhì)量情況下，應(yīng)盡量縮短脫鈣時(shí)間，避免脫鈣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和反復(fù)針刺檢測(cè)造成組織損傷。

兩種方法脫鈣結(jié)束后，均行常規(guī)透射電鏡樣品制備過(guò)程：0.1 mol/L、pH7.4磷酸緩沖液浸洗3 h，中間換液3次（0～4℃）；1%鋨酸中后固定2 h（0～4℃）；0.1 mol/L、pH7.4磷酸緩沖液浸洗3 h，中間換液3次；依次在30%、50%、70%、80%、90%、100%丙酮中梯度脫水，每次15 min，其中100%丙酮脫水2次；在純丙酮∶Epon 812包埋劑為3∶1、1∶1和1∶3的混合浸透液中分別浸透1 h、3 h和12 h后，在純包埋劑中浸透12 h；用純包埋劑再包埋模具中包埋；37 ℃和45 ℃各聚合2 h后，60 ℃聚合48 h；超薄切片機(jī)（劍橋，英國(guó)）切片、醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后行透射電鏡（JEM-1200EX，日本電子）觀察[3]。

結(jié) 果

透射電鏡觀察顯示：用傳統(tǒng)方法脫鈣處理的樣品其切片質(zhì)量較差，骨細(xì)胞突起減少，膠原纖維、細(xì)胞核及細(xì)胞器均不清晰，骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞較明顯（圖1A）；而用改良脫鈣方法處理的樣品其切片質(zhì)量更好，超微結(jié)構(gòu)更完整，骨陷窩內(nèi)骨細(xì)胞清晰可見，骨細(xì)胞表面的突起保存完好，細(xì)胞核及胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整清晰，基質(zhì)中的膠原原纖維在縱切面上可見明顯的周期性橫紋（圖1B）。

討 論

骨組織由細(xì)胞、纖維和基質(zhì)構(gòu)成，其中含有大量的無(wú)機(jī)鹽。無(wú)機(jī)鹽的主要成分為以羥基磷灰石結(jié)晶形式存在的磷酸鈣和碳酸鈣[4]，約占骨干重的70%。由于鈣鹽的沉積，骨組織非常堅(jiān)硬。在透射電鏡樣品制備過(guò)程中，如果不去除骨組織的鈣質(zhì)，會(huì)給固定、脫水、浸透帶來(lái)困難，也無(wú)法制作出有效的超薄切片。因此在樣品制備前需要對(duì)骨組織進(jìn)行有效脫鈣，使鈣鹽溶解，使標(biāo)本變軟[5]，才能進(jìn)行后續(xù)操作。

目前的脫鈣液有有機(jī)酸、無(wú)機(jī)酸、乙二胺四乙酸(EDTA)等多種。用酸類脫鈣時(shí)，脫鈣速度快，但對(duì)骨組織破壞明顯，因此不適合透射電鏡樣品的制備。EDTA是一種相對(duì)較好的螯合脫鈣劑，對(duì)組織結(jié)構(gòu)影響較小，能保存組織中的抗原物質(zhì)和某些酶的活性，但是EDTA 脫鈣操作復(fù)雜，脫鈣時(shí)間長(zhǎng)（2~4周）。長(zhǎng)時(shí)間的脫鈣不利于脂類等物質(zhì)的保存，也延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)周期[6-8]。經(jīng)過(guò)大量的實(shí)踐，我們改進(jìn)了JYBL-Ⅱ組織脫鈣液，在脫鈣液中加入專用的戊二醛電鏡固定劑，同時(shí)對(duì)戊二醛的濃度、滲透壓、pH值等參數(shù)進(jìn)行了精確調(diào)整，消除試劑間的相互作用，由此更適合于制備電鏡樣品[9]。該方法的特點(diǎn)是：①作用迅速，24 h即可完成脫鈣；②固定和脫鈣同時(shí)進(jìn)行，更利于微細(xì)結(jié)構(gòu)的保存。③脫鈣完全。如果脫鈣不完全，膠原原纖維上的無(wú)機(jī)鹽結(jié)晶會(huì)使周期性橫紋不可見。

本研究結(jié)果表明，應(yīng)用后改良快速骨組織脫鈣法制備透射電鏡樣品，可有效防止骨組織過(guò)度膨脹和脫鈣對(duì)骨組織的損傷，脫鈣時(shí)間由傳統(tǒng)的2~4周縮短至24 h；骨組織超微結(jié)構(gòu)保持完好，細(xì)胞及纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰；脫鈣液中的戊二醛可以較好的保存抗原活性[10]，脫鈣后的骨組織可正常進(jìn)行免疫組織化學(xué)和原位雜交組織化學(xué)染色；脫鈣過(guò)程中無(wú)需更換脫鈣液，操作簡(jiǎn)便，脫鈣均勻，效果良好，在骨組織透射電鏡樣品制備中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。