■蔡忠良 張靜靜 王淏冉 任欣欣 朱超杰 劉莎莎 崔文姍 馮軍廠

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南 省水產(chǎn)動物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，水產(chǎn)動物疾病控制河南省工程實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453007）

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，集約化、工廠化、高密度養(yǎng)殖已成為行業(yè)的發(fā)展趨勢。在該類養(yǎng)殖模式下，養(yǎng)殖面積急劇擴張；水體污染日益嚴重；抗生素的濫用導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)、魚病更加難以治療；同時抗生素殘留也危害了食用者的安全。益生菌是一種活性微生物，足夠數(shù)量的益生菌可以提供給宿主有益的作用，包括改善宿主腸道微生物環(huán)境、消化酶活性、非特異性免疫，促進動物生長和增強機體對病原體的抵抗力等。乳酸菌作為最常見的益生菌，通常分離于健康動物或其生活環(huán)境，因此他們被認為是綠色的、環(huán)境友好的和安全的，這使得他們成為抗生素的潛在替代物。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，對乳酸菌的研究主要是將其作為微生態(tài)制劑添加到飼料中，探究其對宿主生長性能、免疫應(yīng)答和抗氧化活性的影響。

目前，阻礙乳酸菌作為飼料添加劑的挑戰(zhàn)之一是其存活率問題。由于活菌的不穩(wěn)定性，研究者們將熱滅活菌株、胞外多糖和菌株細胞壁成分等多種處理方式應(yīng)用到微生態(tài)制劑之中。如將含2×1011CFU/g滅活后的植物乳桿菌L-137（Lactobacillus plantarumL-137）菌粉，以20～50 mg/L噴灑在日糧之中可以增強尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的免疫力和抗病能力；給黃羽肉雞雛雞口服熱滅活草分枝桿菌（Myco?bacterium phlei），能夠顯著提升雞的細胞免疫應(yīng)答以及血清、小腸黏液的IgA分泌量，并促進雞的生長；熱滅活后的乳雙歧桿菌BL-99（BifidobacteriumBL-99）不僅可以緩解小鼠結(jié)腸炎，還可以調(diào)節(jié)機體免疫和腸道菌群；此外Giahi等（2013）還發(fā)現(xiàn)，熱滅活菌株和活菌一樣，誘導(dǎo)細胞因子分泌的能力和菌的劑量有關(guān)，并具有菌種和菌株特異性。本試驗室前期的研究表明，乳酸乳球菌Q-9（Lactococcus lactisQ-9）所產(chǎn)生的胞外多糖（exopolysaccharides of cell-free culture superna?tant, EPS），在鯉（Cyprinus carpioL.）體內(nèi)和體外均具備提高其非特異性免疫、抗氧化活性和抗病原菌感染的能力；注射柱狀黃桿菌（Flavobacterium cloumnare）EPS后，可以增加草魚（Ctenopharyngodon idellus）免疫相關(guān)基因表達量，增強免疫功能并加強機體的炎癥反應(yīng)和抗原提呈能力以及草魚對柱狀黃桿菌的抵抗力，提高草魚的免疫應(yīng)答水平。副干酪乳桿菌D3-5（Lac?tobacillus paracaseiD3-5）細胞壁的脂磷壁酸改善了老齡小鼠（>79周）的腸道炎癥和其認知功能，還可以延長秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）的壽命。同時，日糧中添加2.0%粉末狀植物乳酸桿菌提取物，可以提高豬的生長性能、免疫機能及經(jīng)濟效益。以上研究結(jié)果表明：熱滅活的益生菌、益生菌的胞外多糖、細胞成分以及提取物，仍可繼續(xù)發(fā)揮益生作用。

乳酸乳球菌Z-2（Lactococcus lactisZ-2）及其胞外多糖可增強鯉免疫反應(yīng)和抗病的能力。但L. lactisZ-2的熱滅活或其他處理方式是否仍對鯉表現(xiàn)出益生作用，值得進一步研究。因此，試驗設(shè)置6種處理方式：活菌及上清液的混合物（mixture of live cells and su?pernatant, LCS）、無細菌培養(yǎng)上清液（cell-free culture supernatant, CS）、活菌（live cells, LC）、菌熱滅活（heat-killed cells, HK）、菌超聲破碎（ultrasonic bro?ken of cells, UB）和EPS-2 與鯉頭腎單核細胞體外共培養(yǎng)，通過相關(guān)指標檢測，探究魚源L. lactisZ-2菌株的不同處理方式對鯉的益生作用，以期為合理使用潛在的益生菌提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗菌株

L. lactisZ-2 從健康鯉的腸道內(nèi)容物中分離獲得，根據(jù)其理化特性和16S rDNA序列分析，鑒定為乳酸乳球菌。

1.2 L. lactis Z-2的不同處理

LCS：活菌及上清液的混合物，將L. LactisZ-2在無菌MRS培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)24 h（5×108個/mL，下同）；CS：無細菌培養(yǎng)上清液，L. LactisZ-2培養(yǎng)24 h后離心（8 000 r/min，5 min，4 ℃）收集上清液；LC：活菌，L. LactisZ-2培養(yǎng)24 h后離心（8 000 r/min，5 min，4 ℃）收集菌株，無菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌3 次后重懸浮于同體積PBS 中；HK：熱滅活，按照同樣方法獲得LC 溶液，該溶液再經(jīng)100 ℃熱處理10 min；UB：超聲破碎，將同樣方法獲得的LC 溶液經(jīng)超聲處理（破碎3 s，暫停3 s，功率40%，破碎時間10 min）；EPS-2（1 000 μg/mL）：L. LactisZ-2胞外多糖，具體處理方法參照先前研究。

1.3 鯉頭腎細胞的分離與處理

將健康鯉[體重（47.66±0.43）g]麻醉后，于無菌條件下取出頭腎并分離其巨噬細胞/單核細胞。加入RPMI-1640培養(yǎng)基[10%胎牛血清（GIBCO，USA）、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL 青霉素（Sigma，USA）]，調(diào)整細胞濃度后加入24 孔細胞培養(yǎng)板（2×106個/mL）。然后將經(jīng)不同處理方式的L. LactisZ-2（上述6種處理）作為試驗組加入細胞培養(yǎng)板，100 μL/孔，以PBS作為對照組，于28 ℃細胞培養(yǎng)箱共培養(yǎng)24 h后，檢測孵育液中的細胞因子和一氧化氮（NO）合成量。

1.4 鯉頭腎細胞增殖能力的檢測

為探討L. LactisZ-2 不同處理對鯉頭腎細胞增殖能力的影響，使用不同處理方式的L. LactisZ-2 與頭腎細胞（2×106個/mL）28 ℃孵育20 h 后，每孔加入50 μL的四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑（5 mg/mL），進一步孵育4 h，棄掉上清液后加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO），使用EnSpire 2300酶標儀（PE EnSpire，USA）在570 nm處測量吸光值。

1.5 鯉頭腎細胞吞噬活性的檢測

為探究L. LactisZ-2不同處理對鯉頭腎細胞吞噬活性的影響，方法與上述相似，不同處理方式的L.LactisZ-2與頭腎細胞28 ℃孵育20 h后丟棄上清液，每孔加入300 μL中性紅色染料（0.1%），繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，PBS 洗滌3 次以去除多余的中性紅色染料。然后向每個孔中加入100 μL細胞裂解緩沖液（等體積混勻的乙醇和冰醋酸），并將平板再次孵育2 h以提取吞噬的中性紅色染料，最后用EnSpire 2300酶標儀（PE EnSpire，USA）在540 nm處測量吸光度。

1.6 一氧化氮（NO）的檢測

根據(jù)總一氧化氮（NO）試劑盒說明書（Beyotime，上海，中國）測定頭腎細胞孵育液中NO的含量。使用EnSpire 2300 酶標儀（PE EnSpire，USA）在490 nm 處測量吸光度，并依據(jù)亞硝酸鈉5倍稀釋制備的標準曲線估算孵育液中NO的濃度。

1.7 相關(guān)免疫指標的檢測

為評估L. LactisZ-2 不同處理的免疫調(diào)節(jié)活性，使用本實驗室制備的多克隆抗體通過ELISA 方法進行檢測。簡而言之，將培養(yǎng)上清液與2×包被緩沖液（0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）等體積混勻后加入96 孔免疫印跡板（Nunc）于4 ℃下包被過夜，然后加入10%脫脂奶粉于37 ℃封閉2 h，洗滌后加入相應(yīng)細胞因子的多克隆抗體（1：1 000），其余的試驗步驟參照之前的相關(guān)研究。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用one-way ANOVA和Duncan’s多重比較（SPSS 25 軟件）進行數(shù)據(jù)檢驗，設(shè)置P<0.05 為差異顯著水平，并采用柱狀圖以“平均值±標準差（Mean±SD）”的形式呈現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. lactis Z-2不同處理對鯉頭腎細胞增殖能力的影響（見圖1）

圖1 L.lactis Z-2不同處理對鯉頭腎細胞增殖能力的影響

如圖1所示，CS和HK同對照組相比，對頭腎細胞增殖能力無顯著促進作用（P>0.05）；LCS、LC、UB 和EPS-2 組鯉頭腎細胞的增殖能力均顯著高于對照組（P<0.05）。LC（1.580±0.032）對鯉頭腎細胞的增殖能力具有最積極的促進作用，且同其余各組相比都具有顯著性的提升（P<0.05）。

2.2 L. lactis Z-2不同處理對鯉頭腎細胞吞噬活性的影響（見圖2）

圖2 L.lactis Z-2不同處理對鯉頭腎細胞吞噬活性的影響

如圖2 所示，CS 同對照組（1.00±0.082）相比無顯著促進作用（P>0.05）；LCS、LC、HK、UB 和EPS-2 對鯉頭腎細胞吞噬活性均顯著高于對照組（P<0.05）。LCS（1.520±0.058）對鯉頭腎細胞的吞噬活性具有最積極的影響作用，且同其余各組相比都具有顯著性的提升（P<0.05）。

2.3 L. lactis Z-2 不同處理對鯉頭腎細胞NO 含量的影響（見圖3）

圖3 L. lactis Z-2不同處理對誘導(dǎo)鯉頭腎細胞產(chǎn)生一氧化氮（NO）的影響

如圖3所示，CS同對照組[（1.28±0.057）μmol/L]相比無顯著促進作用（P>0.05）；LCS、LC、HK、UB和EPS-2孵育液中NO 的濃度均顯著高于對照組（P<0.05），EPS-2[（1.960±0.043）μmol/L]孵育液中的NO含量最高。

2.4 L. lactis Z-2不同處理對鯉頭腎細胞促炎細胞因子的影響（見圖4）

圖4 L.lactis Z-2不同處理對鯉頭腎細胞分泌促炎細胞因子的影響

如圖4所示，在促炎細胞因子（TNF-α、IL-β、IL-6）中，每個處理組相對于對照組都得到了顯著的促進作用（P<0.05），較之對照組[（6.99±0.52）pg/mL]對促進TNF-α釋放最佳的處理組是LCS[（23.11±1.31）pg/mL]（P<0.05）；較之對照組[（526.16±65.18）pg/mL]促進IL-β釋放最佳的處理組是HK[（991.82±55.86）pg/mL]，且同其余各組相比都具有顯著性的提升（P<0.05）；較之對照組[（82.65±5.59）pg/mL]對促進IL-6釋放最佳的處理組是LCS[（147.98±8.25）pg/mL]和CS[（147.38±7.94）pg/mL]，且同其余各組相比都具有顯著性的提升（P<0.05）。

2.5 L. lactis Z-2不同處理對鯉頭腎細胞抗炎細胞因子的影響（見圖5）

圖5 L.lactis Z-2不同處理對鯉頭腎細胞分泌抗炎細胞因子的影響

如圖5所示，在抗炎細胞因子（IL-10、TGF-β）中。較之對照組[（50.38±2.99）pg/mL]，LCS、CS 和EPS-2對抗炎細胞因子IL-10 有顯著的促進作用（P<0.05），且LCS[（81.82±3.03）pg/mL]具有最佳的促進作用；對于抗炎因子TGF-β而言，每個處理組相對于對照組[（91.90±8.68）pg/mL]均有顯著的促進作用（P<0.05），且同樣是LCS[（139.56±9.69）pg/mL]具有最佳的促進作用。

3 討論

頭腎是魚體重要的免疫器官，作用和功能類似哺乳動物的淋巴，其中含有大量的免疫細胞（淋巴細胞、巨噬細胞等），這構(gòu)成了魚體固有免疫系統(tǒng)的第一道防線，在抵抗病原體和病菌入侵方面發(fā)揮著重要作用。所以此類細胞的增殖能力和吞噬活性是其最重要的兩種功能。本試驗中，L. lactisZ-2 的LCS、LC、UB 和EPS-2對鯉頭腎細胞的增殖能力顯著高于對照組（P<0.05）；LCS、LC、HK、UB和EPS-2處理對鯉頭腎細胞吞噬活性的影響均顯著高于對照組（P<0.05）。LCS對頭腎細胞的吞噬活性具有最積極的影響作用，LC對鯉頭腎細胞具有最佳的細胞增殖促進效果。這與添加L.lactisZ-2投喂鯉，提升鯉免疫能力及添加類紅球細菌WL-APD911（Rhodobacter sphaeroidesWL-APD911）投喂奧尼羅非魚（Oreochromis mossambicus×Oreochromis niloticus）提升奧尼羅非魚免疫能力結(jié)果類似。

巨噬細胞可以釋放免疫因子（NO、IL-1β、TNF-α等），在宿主防御病原體和其他浸潤細胞中發(fā)揮著重要作用。其活性同頭腎細胞吞噬活性呈正相關(guān)，所以提升頭腎細胞的吞噬活性便會提升頭腎細胞的呼吸爆發(fā)活性，進而增強固有免疫機能。NO 可與頭腎吞噬細胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的超氧陰離子發(fā)生反應(yīng)，抑制或殺死病原菌，因此NO 是機體免疫體系中的一個關(guān)鍵細胞防御因子，其能啟動機體的免疫系統(tǒng)，是調(diào)節(jié)機體炎癥的介質(zhì)。在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)使用不同濃度的L. lactisQ-9 胞外多糖可誘導(dǎo)鯉高水平NO 的生成，并能相應(yīng)減少由嗜水氣單胞菌引起的NO 合成量。本試驗中，LCS、LC、HK、UB 和EPS-2 孵育液中NO 的濃度顯著高于對照組（P<0.05），EPS-2 對鯉頭腎細胞孵育液中NO含量的增加具有最佳的效果。這與使用EPS-2灌胃處理提升鯉免疫能力、通過注射柱狀黃桿菌胞外多糖提升草魚免疫活性及使用復(fù)合植物多糖提升兔的免疫機能結(jié)果類似。

白介素、腫瘤壞死因子等作為介導(dǎo)細胞免疫的主要細胞因子，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)等生物學(xué)功能，且根據(jù)在炎癥反應(yīng)中所發(fā)揮的作用效果，細胞因子可以分為促炎性和抗炎性2 類細胞因子，IL-6、IL-1β和TNF-α屬于促炎性細胞因子，IL-10、TGF-β屬于抗炎性細胞因子，二者含量的變化可作為評價免疫機能的重要指標。在本試驗中，對TNF-α釋放最佳的處理組是LCS；對IL-β釋放最佳的處理組是HK；對IL-6釋放最佳的處理組是LCS 和CS。在抗炎因子之中，LCS、CS和EPS-2對抗炎細胞因子IL-10有顯著的促進作用（P<0.05），且LCS具有最佳的促進作用；相對于對照組，L. lactisZ-2的每個處理組對抗炎因子TGF-β均有顯著的促進作用（P<0.05），且LCS具有最佳的促進作用。

這些結(jié)果同先前討論的活菌、熱滅活益生菌、胞外多糖、細胞成分等提升機體免疫能力的試驗結(jié)果類似。本試驗所設(shè)計的6種益生菌處理方式，均可在不同程度、不同方面提升免疫器官（頭腎）的免疫表達，但各處理組對于每個檢測指標的提升能力卻不同，每種處理方式對鯉所產(chǎn)生的益生作用，還需進一步深入研究。

4 結(jié)論與展望

①魚源L. lactisZ-2 的不同處理方式（LCS、CS、LC、HK、UB和EPS-2）均可對鯉頭腎細胞產(chǎn)生不同程度的免疫促進作用，綜合各項指標，效果最顯著的是LCS。

②魚源L. lactisZ-2 的不同處理方式可作為益生菌的多種形式在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用。如將活菌及上清液的混合物（LCS）、活菌（LC）加進輪蟲或鹵蟲培養(yǎng)體系中；將無細菌培養(yǎng)上清液（CS）和超聲破碎（UB）噴灑到飼料上；將熱滅活（HK）的細菌制成菌粉，在飼料制作過程中添加；胞外多糖（EPS-2）可灌胃、注射或制成膠囊等。

③魚源L. lactisZ-2 不同處理對鯉具有顯著的離體免疫調(diào)節(jié)作用，不同處理方式也為合理利用潛在的益生菌提供理論依據(jù)，為益生菌的使用提供新的解決方法。