■胡光輝 林 淼* 王闊鵬 吉慧敏 張建剛，2 封麗梅 蔣 慧

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.中華人民共和國(guó)天津海關(guān)，天津 300041）

1928 年弗萊明（Fleming）發(fā)現(xiàn)了青霉素，抗生素的出現(xiàn)對(duì)醫(yī)學(xué)產(chǎn)生了革命性的影響，挽救了無(wú)數(shù)人的生命，抗生素的發(fā)現(xiàn)是人類(lèi)醫(yī)學(xué)歷史的轉(zhuǎn)折點(diǎn)[1]。然而細(xì)菌能夠發(fā)展、獲得和傳播許多耐藥性的問(wèn)題很快就被發(fā)現(xiàn)，每當(dāng)一種新的抗生素進(jìn)入市場(chǎng)，具有抗藥性的細(xì)菌即被發(fā)現(xiàn)[2]，而新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性腸桿菌科的出現(xiàn)，說(shuō)明抗生素的抗菌能力正在逐步減弱[3]。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194號(hào)，自2020年7 月1 日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類(lèi)藥物飼料添加劑（中草藥類(lèi)除外）的商品飼料，我國(guó)具有70多年歷史的抗生素飼料添加的時(shí)代已經(jīng)過(guò)去，尋求高效、安全的抗生素替代品成為了新的研究熱點(diǎn)及任務(wù)[4]。有機(jī)酸可作為飼料添加劑用于提高畜禽生產(chǎn)性能、改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì)[5]。李成良[6]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸具廣譜的抑菌性，在仔豬飼料中添加乳酸，有利于胃腸道的酸化及抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖。李曼玲[7]認(rèn)為有機(jī)酸是中草藥發(fā)揮抗菌消炎作用的重要物質(zhì)。Huang等[8]研究發(fā)現(xiàn)口腔細(xì)菌產(chǎn)生的脂肪酸，對(duì)其本身無(wú)特異性活性，但抑制了其他口腔微生物的生長(zhǎng)。潘寶海等[9]認(rèn)為有機(jī)酸具有降低飼料pH、調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)、抑菌殺菌等作用?？梢?jiàn)有機(jī)酸具有提高畜產(chǎn)品品質(zhì)、調(diào)節(jié)腸道微生物結(jié)構(gòu)、抑菌殺菌等特點(diǎn)。正己酸是六碳原子的脂肪酸，常溫下為無(wú)色油狀液體，分子式C6H12O2，分子量116.16，熔點(diǎn)-3 ℃，沸點(diǎn)202 ℃，微溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。我國(guó)準(zhǔn)許己酸作為食品用合成香料適量添加于食品中使用[10]。正己酸在替代抗生素的抑菌效果方面有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)選取了金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，進(jìn)行了正己酸的體外抗性試驗(yàn)研究，評(píng)估其對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制能力，挖掘正己酸在替代抗生素方面的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藥劑與菌種：青霉素、鏈霉素、慶大霉素均由北京Solarbio 公司提供；正己酸購(gòu)自上海阿拉丁科技股份有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院提供。胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂購(gòu)自廣州輝康生物科技有限公司；NaCl購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基：酵母提取物1 g/100 mL、NaCl 2 g/100 mL、胰蛋白胨2 g/100 mL。配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入3 g/100 mL瓊脂。

1.2 試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)使用的儀器有ULTS1368 冰箱（美國(guó)Thermo fisher 公司）、Multiskan Go 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo fisher公司）、LDZX-50KBS高壓滅菌鍋（上海中安醫(yī)療器械廠）、BSA124S電子天平（德國(guó)Sartorius公司）、IS-RSDA恒溫振蕩器（美國(guó)Benchmark公司）、HDL無(wú)菌操作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）、Centrifuge 5810R臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）、MC1000離子濺射儀（Hitachi 日本株式會(huì)社）、GeminiSEM 300蔡司場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡系統(tǒng)（德國(guó)Carl Zeiss公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液的制備

將大腸桿菌與金黃色葡萄球菌從-80 ℃冰箱中取出，在LB 固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，挑取單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，170 r/min 恒溫?fù)u床活化培養(yǎng)12 h 即制得菌懸液。將菌液濃度稀釋成吸光度0.085（菌液濃度108CFU/mL），最終稀釋菌液濃度106CFU/mL。

1.3.2 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

參考魯萌萌等[11]方法，采用等濃度梯度稀釋法測(cè)定正己酸對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的MIC，使其最終濃度分別為400、700、1 000、1 300、1 600 μg/mL，在96孔板中加入上述5個(gè)濃度梯度的培養(yǎng)液各200 μL，設(shè)置3組平行組，向其中各加入大腸桿菌菌懸液或金黃色葡萄球菌懸液4 μL，以?xún)H加培養(yǎng)基組作為培養(yǎng)基對(duì)照組，僅加菌懸液組作為菌液對(duì)照組。參考許璐等[12]方法采用二倍稀釋法將青霉素、鏈霉素、慶大霉素稀釋為2.5、5、10、20、40 μg/mL，同樣設(shè)置3組對(duì)照組，向其中各加入大腸桿菌菌懸液或金黃色葡萄球菌懸液4 μL，以?xún)H加培養(yǎng)基組作為培養(yǎng)基對(duì)照組，僅加菌懸液組作為菌液對(duì)照組。將96孔板放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD（595 nm）值，試驗(yàn)組吸光度-培養(yǎng)基對(duì)照組吸光度≤0.05 的最小正己酸濃度為大腸桿菌/金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度[13-14]。取肉眼可見(jiàn)無(wú)菌體生長(zhǎng)的孔中的培養(yǎng)液10 μL，涂布于LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，將平板上菌落數(shù)≤5個(gè)的最低正己酸濃度定為MBC[15]。

1.3.3 微生物生長(zhǎng)曲線繪制

將已制備的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液加入1/2MIC 和MIC 的正己酸溶液中，以不加正己酸的LB 液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，在120 r/min、37 ℃的搖床中培養(yǎng)24 h，每小時(shí)取樣200 μL，加入無(wú)菌的96孔板中，在酶標(biāo)儀下測(cè)定其OD值（595 nm）。

1.3.4 牛津杯抑菌試驗(yàn)

參考李靜舒等[16]的方法，當(dāng)抑菌圈的直徑（DIZ）>20 mm 時(shí)為極敏，16～20 mm 為高敏，12～16 mm 為中敏，7.8～12 mm為低敏，直徑<7.8 mm為不敏。吸取大腸桿菌或金黃色葡萄球菌菌懸液50 μL，涂布于LB固體培養(yǎng)基上，將三個(gè)牛津杯放于培養(yǎng)基表面，向其中加入150 μL 不同濃度己酸，作為平行組。將培養(yǎng)基放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)抑菌圈直徑。

1.3.5 掃描電鏡分析

參考謝家儀等[17]的方法，將已制備的待測(cè)菌懸液加入正己酸的MIC 的LB 液體培養(yǎng)基中，以不加正己酸組為對(duì)照組，向培養(yǎng)液中加入多聚賴(lài)氨酸爬片，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，在4 ℃冰箱中用體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛固定6 h，以不同體積分?jǐn)?shù)乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）依次脫水，并置于-80 ℃冰箱中冷凍保存4～8 h 后，冷凍干燥24 h。最后粘在金屬箔上固定并噴金，在掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.0 繪制曲線；采用SPSS 24.0 進(jìn)行單因素方差（one-way ANOVA）分析，使用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIC與MBC的確定（見(jiàn)表1、圖1和圖2）

由表1、圖1 和圖2 所示，正己酸對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均有抑制作用。正己酸對(duì)大腸桿菌的MIC 為700 μg/mL，對(duì)大腸桿菌的MBC為1 000 μg/mL。正己酸對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為1 000 μg/mL和1 300 μg/mL。

圖1 添加不同濃度抗生素和正己酸對(duì)細(xì)菌抑菌效果的影響

圖2 不同濃度的正己酸的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌平板涂布

2.2 正己酸對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的影響（見(jiàn)圖3）

如圖3 所示，經(jīng)正己酸處理后，大腸桿菌生長(zhǎng)延滯期延遲（圖3A），其中1/2MIC組其生長(zhǎng)期在8 h時(shí)結(jié)束，其在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率和空白組相比也較低，24 h 時(shí)，其濃度較空白組相比明顯降低。當(dāng)正己酸濃度為1 000 μg/mL 時(shí)，大腸桿菌生長(zhǎng)被完全抑制。金黃色葡萄球菌（圖3B）經(jīng)正己酸處理后，生長(zhǎng)延滯期延遲，其中1/2MIC組其生長(zhǎng)期在10 h時(shí)結(jié)束，其在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率和空白組相比也相對(duì)降低，24 h時(shí)，其濃度較空白組相比明顯降低。

圖3 正己酸處理后大腸桿菌及金黃色葡萄球菌24 h的生長(zhǎng)曲線

2.3 正己酸對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑影響（見(jiàn)表2和圖4）

由表2和圖4可知，當(dāng)正己酸的濃度為1 600 μg/mL時(shí)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對(duì)正己酸均為中度敏感；當(dāng)正己酸的濃度為1 300 μg/mL時(shí)，大腸桿菌對(duì)正己酸為中度敏感，金黃色葡萄球菌對(duì)正己酸為低度敏感；當(dāng)正己酸濃度為1 000 μg/mL，時(shí)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對(duì)正己酸均為低度敏感；當(dāng)正己酸濃度為700 μg/mL 時(shí)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對(duì)正己酸均為低度敏感。

圖4 不同濃度正己酸下牛津杯抑菌圈直徑

表2 不同濃度正己酸下牛津杯抑菌圈直徑（cm）

2.4 正己酸對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌微觀結(jié)構(gòu)的影響（見(jiàn)圖5）

掃描電鏡結(jié)果顯示（見(jiàn)圖5），經(jīng)正己酸處理后，金黃色葡萄球菌的形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，但大腸桿菌表面并未出現(xiàn)明顯的破損?？瞻捉M圖5A、圖5B（金黃色葡萄球菌）和圖5E、圖5F（大腸桿菌）細(xì)胞形態(tài)完整、飽滿。經(jīng)過(guò)正己酸處理之后，金黃色葡萄球菌表面破損，出現(xiàn)空洞，細(xì)胞內(nèi)容物流出，單位面積下細(xì)菌數(shù)量減少（圖5C、圖5D）；大腸桿菌細(xì)胞表面并未發(fā)生明顯改變（圖5G、圖5H）?？梢?jiàn)，正己酸對(duì)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁具有一定的破壞作用，而對(duì)大腸桿菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沒(méi)有明顯的破壞作用。

圖5 空白組大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和正己酸處理后大腸桿菌、金黃色葡萄球菌Mag=25.00k×和Mag=100.00k×電鏡照片

3 討論

中鏈脂肪酸的抑菌特性被廣泛應(yīng)用于食品及畜牧業(yè)生產(chǎn)之中。Decuypere[18]等研究發(fā)現(xiàn)，在模擬豬胃內(nèi)環(huán)境的體外試驗(yàn)中，當(dāng)100 g 飼料中含有的混合中鏈脂肪酸為0.35 g 或0.025 moL 時(shí)，能夠顯著抑制胃內(nèi)細(xì)菌群的生長(zhǎng)。中鏈脂肪酸還被用于抗雞的彎曲桿菌而添加于雞的飲水中[19]。Mugabe 等[20]研究表明在青貯象草中添加正己酸或者是正己酸和植物乳桿菌的混合物可以減緩乳酸、乙酸的積累，降低pH和水溶性碳水化合物的分解，同時(shí)也降低了青貯飼料中氨氮和乙醇濃度的積累，此正己酸或者是正己酸與乳桿菌的混合物還具有抗真菌作用，提高青貯飼料品質(zhì)，在青貯過(guò)程中持續(xù)存在。Api等[21]對(duì)正己酸的遺傳毒性、生殖毒性、光毒性/光過(guò)敏性、環(huán)境安全進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明正己酸不具有生殖毒性；在目前申報(bào)使用水平下對(duì)皮膚不存在過(guò)敏性等安全問(wèn)題；基于紫外光譜評(píng)估的光毒性/光過(guò)敏性結(jié)果表明正己酸不具有光毒性/光過(guò)敏性；根據(jù)其目前在北美的使用量，對(duì)環(huán)境影響進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，表明其風(fēng)險(xiǎn)商數(shù)<1。

在本試驗(yàn)中，己酸對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，己酸對(duì)大腸桿菌的MIC 為700 μg/mL，MBC 為1 000 μg/mL，正己酸對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC 為1 000 μg/mL，MBC 為1 300 μg/mL；大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的24 h 生長(zhǎng)曲線表明己酸能夠延遲大腸桿菌/金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)延滯期、降低生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速率、降低其在24 h 時(shí)的菌液濃度；抑菌圈結(jié)果顯示1 600 μg/mL 的正己酸對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有中等抑制作用，隨著濃度降低，抑菌圈直徑也逐漸減小。在電鏡下金黃色葡萄球菌明顯受到正己酸的抑制作用，并且細(xì)胞外表面被嚴(yán)重破壞，大腸桿菌細(xì)胞膜卻未見(jiàn)破壞，但卻被明顯抑制。

Projan 等[22]和Peterson 等[23]認(rèn)為G+細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖含量較高，交聯(lián)度較高，含有親水基團(tuán)的有機(jī)酸較易透過(guò)細(xì)胞壁作用于細(xì)胞膜而發(fā)揮作用，達(dá)到抑菌效果。曾哲靈等[24]認(rèn)為，革蘭氏陰性菌表面有一層脂多糖，可以阻止有機(jī)酸對(duì)革蘭氏陰性菌的作用。有研究表明當(dāng)大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的脂多糖外膜被破壞之后，有機(jī)酸對(duì)大腸桿菌的抑制作用更加顯著。Kim 等[25]通過(guò)構(gòu)建產(chǎn)正己酸大腸桿菌，通過(guò)微調(diào)乙酰輔酶A 乙?；D(zhuǎn)移酶（AtoB）基因的表達(dá)水平，優(yōu)化乙酰輔酶A 的代謝流向，而提高大腸桿菌的正己酸產(chǎn)量。因此，可能是由于大腸桿菌表面的脂多糖能夠降低大腸桿菌對(duì)正己酸的敏感性，所以導(dǎo)致在較高濃度下大腸桿菌仍然能夠保持細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性。

有機(jī)酸發(fā)揮抑菌作用的機(jī)理主要包括：①作為一種很好的陰離子表面活性劑，其能夠進(jìn)入到細(xì)胞的磷酸雙分子層中，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)而使細(xì)胞死亡；②通過(guò)細(xì)胞膜滲透入細(xì)胞中，解離出H+，使細(xì)菌消耗大量能量，泵出H+，以維持細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡，造成細(xì)胞代謝阻塞和衰竭，引起細(xì)菌細(xì)胞死亡，或者當(dāng)泵出的H+不足以抵消進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的H+時(shí)，造成對(duì)pH 敏感的細(xì)菌死亡；③抑制細(xì)菌內(nèi)部脂肪酶活性，減少細(xì)菌在動(dòng)物腸道絨毛上的附著[26]；④中鏈脂肪酸在細(xì)菌內(nèi)還可以引起解偶聯(lián)作用；⑤抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的活性，誘導(dǎo)其產(chǎn)生一種自溶酶，使細(xì)菌分解死亡[27]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)證明了正己酸對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌有明顯的抑制作用，為其在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供了參考，但其作用機(jī)理尚未闡明，還有待進(jìn)一步研究。