盧玲，刁麗梅，李歡，廖現(xiàn)秋

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

癲癇是影響全球超過7000萬人的最常見的慢性腦部疾病之一，它極大地影響了患者的生活質(zhì)量，并且對患者的健康造成了嚴重的威脅[1-2]。目前的抗癲癇藥物能夠減輕患者的癥狀，但不能抑制致癇過程的發(fā)展，且長期使用也會引起各種不良反應(yīng)，亦會使藥物的敏感性降低[3]。故而，研發(fā)療效高、安全性好且副作用小的藥物以及新型治療方法具有重要的臨床意義。

癲癇的發(fā)病機制尚不明確，因此了解癲癇發(fā)病所涉及的生物過程是研發(fā)新治療方法和藥物的基礎(chǔ)。有研究表明，微小核糖核酸(miRNAs)的異常表達與癲癇的發(fā)病機制密切相關(guān)[4]。miRNAs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達，它能夠參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分化、發(fā)育和成熟，且能夠密切調(diào)節(jié)突觸的可塑性，從而調(diào)節(jié)癲癇的發(fā)作[5]。而自噬在多種神經(jīng)退行性疾病中同樣扮演著重要的角色，也跟癲癇的發(fā)生發(fā)展密不可分[6]。

近年來，中藥在治療癲癇方面表現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢，它能夠減少癲癇的并發(fā)癥，降低抗癲癇藥物的副作用，提高患者的依從性。定癇湯是一個歷史悠久治療癲癇的經(jīng)典方劑，具有化痰熄風(fēng)，開竅止痙的功效。目前眾多臨床研究表明，定癇湯能夠較好地提高癲癇治療的療效，改善癲癇的發(fā)作[7-8]。此外，實驗研究表明定癇湯通過調(diào)節(jié)抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護等，發(fā)揮抗癲癇功效，以降低癲癇大鼠的發(fā)作頻率，延長發(fā)作的潛伏期，減少大鼠腦電圖的癇性波形[9-10]。本課題組前期的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)定癇湯的抗癲癇機制可能與其對miRNAs的調(diào)控作用有關(guān)。因此，我們前期的基礎(chǔ)研究對癲癇小鼠miRNAs進行了基因芯片檢測，發(fā)現(xiàn)miRNA-204在癲癇小鼠的海馬組織中表達下調(diào)[11]。因此，本實驗研究定癇湯干預(yù)后，小鼠腦電圖的變化，癲癇小鼠海馬區(qū)miRNA-204表達的變化，及自噬相關(guān)蛋白(ATG7和LC3II)的表達變化，探究定癇湯治療癲癇的可能療效機制。

1 材料

1.1 主要實驗儀器

視頻腦電圖儀NATION7128W(上海諾誠電氣股份有限公司)；光學(xué)顯微鏡BX43(日本Nikon)；Ariamx型實時熒光定量PCR儀(安捷倫科技有限公司)；低溫離心機(德國eppendorf公司)；VeritiTM96-Well Thermal Cycler(美國Applied Biosystems公司)；超微量核酸檢測儀(杭州遂真生物技術(shù)有限公司)。

1.2 主要實驗試劑

BSA(Servicebio 公司 G5001)；DAB 顯色劑(Servicebio公司 G1211)；Anti-LC3II抗體(博奧森公司 bs-2912R)；Anti-ATG7抗體(博奧森公司 bs-2432R)；檸檬酸(PH 6.0)抗原修復(fù)液(Servicebio 公司 G1202)；PBS 緩沖液(Servicebio 公司 G0002)；正常兔血清(Servicebio 公司 G1209)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time) (Takara公司 RR047A)；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(Takara公司 RR820A)。

1.3 實驗動物

健康昆明小鼠，雄性，體質(zhì)量20～22 g，周齡8～10周，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供(許可證號：SYXK桂2009-0001)。分籠飼養(yǎng)，每籠5只，室溫22～23 ℃，12 h交替光照，給予SPF級飼料和飲用水。所有小鼠均需適應(yīng)環(huán)境2周及以上方可進行實驗操作。實驗動物的飼養(yǎng)和操作均在SPF級環(huán)境中進行，且實驗過程嚴格遵照廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的各項規(guī)定。

1.4 主要實驗藥物

定癇湯組成：天麻12 g，茯神12 g，姜半夏9 g，膽南星9 g，川貝母12 g，茯苓12 g，石菖蒲9 g，僵蠶10 g，全蝎6 g，琥珀6 g，陳皮12 g，遠志10 g，丹參15 g，麥冬15 g，朱砂0.5 g，甘草6 g，所有藥材均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一采購備用，采用自動煎藥機煎煮，濃縮至藥物濃度500 mg/mL；鹽酸匹羅卡品(Pilocarpine Hydrochloride,美國Sigma公司),硫酸阿托品注射液(鄭州鈴銳制藥有限公司)。

2 實驗方法

2.1 造模與分組

將40只健康雄性昆明小鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為4組，分別為：模型組、生理鹽水組、卡馬西平組、定癇湯組。分別對各組動物進行灌胃2周，模型組和生理鹽水組均予20 mL·kg-1·d-1生理鹽水進行灌胃；定癇湯組予7 g·kg-1·d-1定癇湯藥液進行灌胃；卡馬西平組予30 mg·kg-1·d-1卡馬西平混懸液灌胃。灌胃2周后，對模型組、卡馬西平組、定癇湯組實驗動物進行造模。造模時，先使用硫酸阿托品(17 mg/kg)進行腹腔注射；30 min后，再使用Pilocarpine Hydrochloride(180 mg/kg)進行腹腔注射；小鼠給藥完畢后，按照經(jīng)典的Racine(1972)的實驗動物癇性發(fā)作標準對小鼠進行行為學(xué)觀察[12]。若腹腔注射30 min后，小鼠未能出現(xiàn)Ⅳ級以上癇性發(fā)作的，則每隔15 min對小鼠進行追加腹腔注射，追加注射的Pilocarpine Hydrochloride劑量為：首劑量的1/3。若追加Pilocarpine Hydrochloride腹腔注射2次以后，小鼠仍未能出現(xiàn)Ⅳ級以上癇性發(fā)作的，則視其為造模失敗，不再納入下一步行為學(xué)觀察及后續(xù)實驗。若小鼠癇性發(fā)作持續(xù)時間達到1 h，則給予地西泮腹腔注射，以終止癇性發(fā)作。本實驗的對照組生理鹽水組小鼠給予注射等量的生理鹽水。

2.2 腦電圖檢測

將各組小鼠分別進行固定制動，再將腦電圖儀的針電極分別插入小鼠左右顳骨的表面,并與同側(cè)耳電極連接，待固定平穩(wěn)后監(jiān)測并記錄各組小鼠的腦電圖。將紙速設(shè)定為：3 cm/s，將波形敏感度設(shè)定為：80 μV/cm。

2.3 熒光定量PCR檢測miR204表達量

2.3.1 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

各組小鼠海馬組織分別剪成細小的碎片，取50～100 mg放入2 mL離心管置于冰盒上，加入1 mL TriQuick Reagent，用勻漿機勻漿至無沉淀。勻漿靜置(室溫)5 min，加入0.2 mL氯仿，震蕩15 s，靜置(室溫)2 min；4 ℃離心，12 000 r/min離心15 min，取上清0.5 mL加入潔凈的1.5 mL離心管；加入0.5 mL異丙醇，混勻，靜置(室溫)10 min；4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清；先后加入兩次1 mL的75%乙醇，依次進行洗滌沉淀，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，棄上清；再加入1 mL無水乙醇，重復(fù)上述操作；隨后置于65 ℃金屬浴鍋上烘干沉淀，加0.03 mL DEPC水溶解。使用超微量核酸檢測儀進行RNA濃度及純度檢測后進行逆轉(zhuǎn)錄操作，所得cDNA置于-80 ℃保存待用。

2.3.2 qPCR檢測

qPCR反應(yīng)體系為：TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ:10 μL，cDNA：1 μL，Primer Forward(10 μmol/L)：0.4 μL，Primer Reverse(10 μmol/L)：0.4 μL，H2O：8.2 μL；反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s,PCR循環(huán)(40循環(huán))：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s;溶解曲線：標準溶解曲線程序。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

2.4 免疫組化檢測自噬相關(guān)蛋白ATG7、LC3 II表達情況

使用甲醛對小鼠腦組織進行固定，通過石蠟進行包埋。然后將小鼠腦組織以3～5 μm為厚度進行冠狀切片。組織切片經(jīng)烘烤(60 ℃恒溫箱)30 min后，再置于二甲苯中進行浸泡，浸泡時間為15 min；更換二甲苯后再次浸泡15 min；再將切片依次置于二甲苯∶乙醇=1∶1混合液、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸餾水中分別浸泡10 min；隨后用蒸餾水室溫封閉10 min；然后進行抗原修復(fù)，修復(fù)過程為：將組織切片置于盛滿使用檸檬酸(pH 6.0)抗原修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)，先中火加熱8 min至煮沸，然后?；痨o置8 min，保溫再轉(zhuǎn)中低火維持7 min；修復(fù)完成后對內(nèi)源性過氧化物酶進行阻斷；隨后進行血清封閉；加入一抗孵育過夜；回收一抗，TBS 洗2遍，每次5 min；加入二抗，室溫孵育50 min；TBS 洗4遍，每次5 min；加入DAB進行顯色；用蘇木精復(fù)染細胞核；再依次將切片置于蒸餾水、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯∶乙醇=1∶1混合液、二甲苯中浸泡5 min，隨后更換二甲苯再次浸泡5 min，進行脫水封片；晾干、觀察結(jié)果。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠行為學(xué)表現(xiàn)

對各組小鼠分別進行行為學(xué)觀察，觀察結(jié)果顯示,生理鹽水組在觀察過程中未出現(xiàn)任何癇性發(fā)作癥狀；模型組小鼠造模成功后，主要表現(xiàn)為弓背、二便失禁、后腿直立、前腳陣攣、尾巴豎起等，且模型組小鼠癲癇發(fā)作頻率及持續(xù)時間均最長；卡馬西平組和定癇湯組癇性發(fā)作的頻率較模型組減少，且發(fā)作持續(xù)時間較模型組明顯縮短。結(jié)果表明,定癇湯和卡馬西平對小鼠癲癇發(fā)作具有抑制作用。

3.2 各組小鼠腦電圖分析

腦電圖結(jié)果顯示，生理鹽水組小鼠腦電圖表現(xiàn)為正常波形；而在模型組中可見較多的棘波、尖波和棘慢波頻繁發(fā)放；在卡馬西平治療組中，仍可見少量尖波、棘波；在定癇湯治療組中，也可見少量尖波、棘波發(fā)放，見圖1。結(jié)果表明，定癇湯、卡馬西平治療后，癲癇小鼠的腦電圖棘波、尖波、棘慢復(fù)合波可顯著減少。定癇湯可抑制癲癇小鼠的癇性放電。

圖1 各組小鼠腦電圖情況

3.3 定癇湯對癲癇小鼠海馬區(qū)miRNA-204的表達水平的影響

模型組的miRNA-204表達水平較生理鹽水組下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，定癇湯組和卡馬西平組miRNA-204表達上調(diào)(P<0.01)；定癇湯組與卡馬西平組相比較，小鼠海馬區(qū)miRNA-204的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。實時熒光定量PCR的結(jié)果表明,定癇湯干預(yù)后癲癇小鼠海馬組織miRNA-204的表達較模型組上調(diào)。

注：與生理鹽水組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。圖2 各組小鼠海馬中miRNA-204的表達水平

3.4 各組自噬相關(guān)蛋白ATG7、LC3II在小鼠海馬組織中表達情況比較

本實驗免疫組化結(jié)果表明：ATG7和LC3 II這兩個自噬相關(guān)蛋白在模型組小鼠海馬組織中高表達，兩者陽性細胞比例均高于生理鹽水組(P<0.01)；定癇湯組、卡馬西平組的小鼠海馬組織中ATG7、LC3II蛋白表達下調(diào)，兩組陽性細胞比例較模型組明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 自噬相關(guān)蛋白在各組小鼠海馬組織中的陽性細胞數(shù)比例

4 討論

癲癇作為神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病之一，反復(fù)發(fā)作導(dǎo)致患者日常工作和生活受到影響，長期的癲癇發(fā)作亦會使患者出現(xiàn)認知功能障礙、抑郁和焦慮等，給患者和社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔(dān)[13]。定癇湯由天麻、姜半夏、石菖蒲、全蝎、遠志等16味藥物組成，它與抗癲癇藥物聯(lián)合使用能夠明顯減少腦電圖的癇性波、減少藥物的不良反應(yīng)、改善患者的癥狀、減少癲癇發(fā)作的頻率，同時能夠極大提高患者的依從性，常用于癲癇的臨床治療。既往的臨床研究也進一步證實了定癇湯在癲癇治療中的療效[7]。此外，近年來的基礎(chǔ)研究也表明，定癇丸可能通過抑制海馬神經(jīng)元細胞的凋亡，達到抗癲癇作用[14]。該中藥復(fù)方中的天麻可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元細胞的電生理穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的平衡發(fā)揮抗癲癇作用[15]。半夏的抗癲癇機制可能與其增加大鼠海馬γ-氨基丁酸的含量，提高γ-氨基丁酸的功能密切相關(guān)[16]。石菖蒲揮發(fā)油能夠抑制神經(jīng)細胞的凋亡，是一種長效的、抗癲癇譜廣的抗癲癇藥物[17]。全蝎的提取物具有良好的抗驚厥、抗癲癇和鎮(zhèn)靜作用，能夠有效地減少小鼠癲癇發(fā)作的頻率，延長驚厥的潛伏期[18]。而遠志總皂苷能夠改善癲癇繼發(fā)的認知功能障礙，其可能的機制是遠志總皂苷能夠提高癲癇大鼠海馬區(qū)煙堿型乙酰膽堿受體ɑ7亞基的表達[19]。為明確定癇湯的療效，本實驗使用定癇湯干預(yù)癲癇小鼠，并且對小鼠進行行為學(xué)和腦電圖觀察。結(jié)果表明，定癇湯能夠明顯縮短小鼠癲癇發(fā)作的持續(xù)時間、減少小鼠腦電圖的棘波、尖波等癇性波的發(fā)放。

miRNAs是一種內(nèi)源性短非編碼核糖核酸。其在血液、組織和尿液中都具有穩(wěn)定性，是疾病診斷的潛在生物標志物。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可以調(diào)節(jié)膽堿能平衡、海馬神經(jīng)元的增殖和丟失以及神經(jīng)炎癥，在癲癇的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用[13,20]。miRNA-204在癲癇患者海馬區(qū)中表達下調(diào)，它能夠抑制海馬神經(jīng)元中的癲癇樣放電，是癲癇治療的潛在靶點[21]。本課題組前期的基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)，miRNA-204在癲癇小鼠海馬組織中表達下調(diào)。加味柴胡疏肝湯可能通過上調(diào)miRNA-204，保護海馬神經(jīng)元，抑制小鼠海馬神經(jīng)元的過度自噬，從而發(fā)揮抗癲癇作用[22]。本實驗通過實時熒光定量PCR技術(shù)進一步證實了miRNA-204在癲癇小鼠中表達下調(diào)(P<0.01)，采用定癇湯干預(yù)后癲癇小鼠海馬組織miRNA-204表達上調(diào)(P<0.01)。因此，定癇湯可能通過上調(diào)miRNA-204發(fā)揮抗癲癇作用。

自噬是一種在細胞中發(fā)揮作用的分解代謝過程，異常的自噬會對細胞分解代謝產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致細胞損傷。自噬存在于各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，在神經(jīng)元損傷中起著關(guān)鍵作用，與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[23]。LC3 II是一種自噬相關(guān)蛋白，已經(jīng)證實其在癲癇小鼠中表達上調(diào)并導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷[24]。ATG7是自噬體形成所必須的蛋白酶，它也是自噬的重要標志蛋白之一[25]。本課題組既往研究表明，上調(diào)miRNA-204可以抑制ATG7和LC3 II的過度表達，從而抑制自噬的發(fā)生，起到干預(yù)癲癇的發(fā)生發(fā)展的作用[22]。本實驗通過免疫組化技術(shù)，進一步發(fā)掘了定癇湯對自噬的干預(yù)作用。在癲癇小鼠海馬中，自噬相關(guān)蛋白ATG7和LC3 II的表達上調(diào)(P<0.01)；而定癇湯能夠下調(diào)ATG7和LC3 II的表達(P<0.01)，從而達到治療癲癇的目的。

總而言之，miRNA-204調(diào)控自噬相關(guān)蛋白ATG7和LC3 II的表達，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元損傷，誘發(fā)自噬是癲癇發(fā)生發(fā)展的可能機制之一。定癇湯能夠減短癲癇發(fā)作的持續(xù)時間、改善癲癇小鼠腦電圖的癲癇樣波形，其可能是通過上調(diào)miRNA-204的表達，抑制ATG7和LC3II的過度表達，抑制小鼠海馬神經(jīng)元自噬，發(fā)揮治療癲癇的療效。