石 博，關 峰，張景云，萬新建，張會國，黃國東

（1.江西省農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所 南昌 330200； 2.江西省高安市農業(yè)農村局 江西高安 330800）

冬 瓜[Benincasahispida（Thunb.）Cogn.]為 葫 蘆科冬瓜屬一年生蔓生植物，在我國已有2000 多年的種植史[1]。冬瓜是一種高產(chǎn)蔬菜，1 hm2產(chǎn)量可達150 t，除高產(chǎn)優(yōu)勢外，冬瓜還具有易栽培、耐貯運、耐濕熱、適應性強等特點，目前其種植面積已超過30 萬hm2，且冬瓜已成為我國南菜北運的主要蔬菜之一[2-3]。近年來，由于多年連作導致土壤環(huán)境惡化，連作障礙嚴重，冬瓜枯萎病的發(fā)生也日益頻繁[4-5]，現(xiàn)已成為制約冬瓜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一。冬瓜枯萎病是一種土傳真菌性病害，致病菌為尖孢鐮刀菌冬瓜專化型（Fusarium oxysporumSchl. f. sp.benincasae）[6-9]，在冬瓜整個生育期枯萎病均可發(fā)生，特別是我國南方地區(qū)因夏季高溫多雨等氣候條件，發(fā)病尤為頻繁，發(fā)病時一般減產(chǎn)20%～30%，嚴重時在60%以上，制約了冬瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[5]。

因此，了解冬瓜枯萎病病源鑒定方法、發(fā)生規(guī)律、抗性種質鑒定及抗病育種等方面的研究進展，對挖掘抗性種質資源和基因資源具有非常重要的意義，并可為后續(xù)開展冬瓜枯萎病研究提供參考和依據(jù)。

1 冬瓜枯萎病病原菌的鑒定

1985 年，Gertagh 等[10]首次發(fā)現(xiàn)一種導致冬瓜枯萎病發(fā)生的真菌?；汀怄哏牭毒蠈；停‵.oxysporumf.sp.benincasae）。1995 年孫妍芳等[11]對冬瓜枯萎病分離物進行了?；丸b定研究，發(fā)現(xiàn)該致病菌?；洼^強，只嚴重侵染冬瓜，還可導致西瓜和瓠瓜輕度發(fā)病。已有報道表明，葫蘆科瓜類枯萎病尖孢鐮刀菌共存在7 種種下分化[10，12-14]。目前，常見尖孢鐮刀菌的鑒定一般結合形態(tài)學觀察、致病性檢測和分子生物學鑒定3 種方法。冬瓜枯萎病菌形態(tài)學觀察多采用PDA 培養(yǎng)基，于26 ℃真菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，同時觀察菌落和菌絲的生長形態(tài)，并在電子顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)。曾永三等[15]對冬瓜枯萎病菌的生物學特征進行了觀察，發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌冬瓜?；偷木z呈絨毛絮狀，菌落顏色為紫色或白色稍帶粉紫色。菌絲體側生小梗，從單出的瓶狀小梗頂上長出形成分生孢子。分生孢子形狀均為鐮刀形，基部有細小足細胞。厚垣孢子頂生或間生，形狀為圓形，表面光滑[16]。致病性測定可明確病原菌致病力強弱及具體?；停峡菸【b定目前多采用人工苗期接種法對幼苗接種病原菌，置于溫度為28 ℃、光照12 h 的培養(yǎng)箱中，以未接種冬瓜幼苗為對照，接菌10～15 d 后冬瓜幼苗子葉黃化、葉片逐漸枯萎，最終死亡。分子生物學鑒定則是在分子水平檢測致病菌的類別，進一步明確其?；?。一般使用通用引物ITS1 和ITS4 擴增分離物鑒定DNA，將菌株rD‐NA-ITS 序列在GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫中進行比對。序列相似性≥99%，鑒別為同種；序列相似性在95%～99%之間，鑒別為同屬；序列相似性≤95%，鑒別為同科[17]。目前NCBI 數(shù)據(jù)庫中有大量的鐮刀菌ITS序列[5，12，18]。在試驗中依次操作這3 種方法對病原菌進行觀察和鑒定，其結果更為準確。

2 發(fā)病規(guī)律及尖孢鐮刀菌侵染過程

尖孢鐮刀菌是土壤習居真菌，一旦成功在土壤中定殖幾乎無法消除[19]，因此連作多年的老菜地更易發(fā)病，尤其在開花期、坐果期和果實膨大期等關鍵時期，枯萎病發(fā)病率高達60%或以上[5]，甚至絕收，這對冬瓜的產(chǎn)量和品質造成很大影響?？菸囟冗m應性很強，在20～32 ℃均可發(fā)病，且溫度越高發(fā)病越重，在溫度為28～32 ℃時，病害發(fā)生最為嚴重[16]。另外，濕度也是影響枯萎病發(fā)病的一個重要因素，夏季雨后晴天會促進病害的快速發(fā)生。此外，地塊積水、土壤酸性、多年連作、地下害蟲增多等均可促進枯萎病發(fā)生。關峰等[20]研究發(fā)現(xiàn)病原菌是在土壤的植株病殘體內以菌絲體、厚垣孢子或菌核越冬，且該致病菌可在土壤中存活5 年甚至更長的時間。

枯萎病發(fā)生時，植株下部葉片從邊緣向內開始黃化、萎蔫，后期植株上部葉片從頂葉開始逐漸萎蔫干枯，最后整株干枯死亡。嚴重時病株下部會出現(xiàn)縱向淺褐裂紋，潮濕天氣下病部會分泌膠狀物。從病株顯癥到全株枯死，一般需要7～10 d[21]。病原菌主要通過根部的傷口或根毛頂端細胞進入寄主植物體內[22-23]，并在寄主植物的導管中產(chǎn)生大量菌絲和菌核，堵塞維管束導管，阻斷有機質、礦物質和水分的運輸[24-25]，且分泌毒素和分解酶，從而導致寄主植物組織分解和壞死，最終致使植株萎蔫、死亡[26-28]。謝大森等[29]研究發(fā)現(xiàn)，病原菌由根系向植株頂端擴散，病株的萎蔫也先從下部葉片開始，逐漸向上黃化萎蔫。Zhang 等[30]認為西瓜枯萎病菌侵染后，西瓜根部木質部導管通過快速形成膜狀物、填充體及細胞壁增厚阻塞菌絲入侵，這與Mace 等[31]的觀點相吻合。枚貴[32]采用免疫熒光標記技術研究鐮刀菌脅迫下冬瓜根部細胞壁果膠多糖的組織細胞定位，發(fā)現(xiàn)冬瓜與枯萎病菌的互作過程存在果膠酶的參與現(xiàn)象。

3 冬瓜枯萎病防治方法

為進一步提高冬瓜品質與產(chǎn)量，需加大預防與防控措施，以農業(yè)防治、生物防治為主，以化學藥劑防治為輔，及時有效地開展綠色防控工作。

3.1 農業(yè)防治

農業(yè)防治包括與非寄主作物輪作、加強水肥管理、高溫曬土等[33]。連作對冬瓜土壤理化性質、土壤微生物群落等有很大的影響，使土壤微生物群落由“細菌型”向“真菌型”轉化，且致病性真菌增加，最終導致冬瓜產(chǎn)量和品質下降。前人研究表明，與大蒜、韭菜、茼蒿等輪作能夠明顯降低土壤中的鐮刀菌豐度，枯萎病的發(fā)病率可降低40%[34-35]。合理的水肥管理是減少病害必不可少的措施，精耕細作、增施有機肥和磷鉀肥、添加土壤改良劑改善土壤結構等均是簡單有效的防治手段[36]。另外，閑田時用地膜覆蓋土壤并連續(xù)高溫暴曬等方法也可以明顯降低土層中枯萎病菌含量，可減輕枯萎病的發(fā)生。

3.2 生物防治

生防菌在可持續(xù)綠色農業(yè)中具有越來越重要的作用，目前用于植物病害防治的生防菌主要有木霉菌（Trichodermaspp.）、芽孢桿菌（Bacillus）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和盾殼霉（Coniothyri‐um minitans）等。芽孢桿菌具有抑制多種病原菌的廣譜能力，在生產(chǎn)上使用較為普遍[37]。目前，常見的生防菌芽孢桿菌主要有解淀粉芽孢桿菌（B.amylo‐liquefaciens）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和多粘芽孢桿菌（B.polymyxa）等[38-39]。已有研究表明，芽孢桿菌發(fā)酵液復配蚯蚓堆肥浸提液具有良好的促根壯秧的作用，可有效減少枯萎病的發(fā)生。根際促生菌B.velezensisF21 能增強西瓜對枯萎病的抗性，在大棚和露地的防治效率分別為80.35%和65.81%[40]。

3.3 化學防治

化學防治是枯萎病防治中最常用的方法，主要是通過藥劑殺死病原菌從而達到減輕病害的目的，見效快、操作簡單。目前，瓜類枯萎病多采用噻菌銅、多菌靈、噁霉靈、甲基硫菌靈等內吸性殺菌劑進行種子消毒，有研究表明，噁霉靈與澳菌睛混合復配劑對香蕉枯萎病有較好的防治效果[41]。噁霉靈與多菌靈混合使用對土壤進行消毒處理，也可起到防治作用[42]。張曼等[43]發(fā)現(xiàn)，20%硅唑·咪鮮胺EW、70%甲基硫菌靈WP 和25%多菌靈WP 能很好地抑制鐮刀菌菌絲的生長，抑菌率在80%以上。目前生產(chǎn)上大面積推廣的抗病品種較少，化學防治仍是目前防治枯萎病最常用的方法，但此種方法在農藥使用不當時會對環(huán)境造成污染，破壞土壤，污染水質。

4 冬瓜枯萎病抗性種質資源鑒定與抗病育種

選用抗病品種是防治病害最有效的措施，而抗病冬瓜種質資源鑒定是抗病育種的重要基礎和必要手段。目前，苗期人工接種鑒定被廣泛用于瓜類枯萎病的抗性鑒定中，常用的接種方法有灌根法[44]、浸根法[45]、傷根法[46]等，其中前2 種方法接種菌量較容易控制，在實際操作中比較常見。謝大森等[47]從不同來源的冬瓜材料中篩選出2 個高抗枯萎病的材料，并發(fā)現(xiàn)抗病材料與防御酶之間有正相關?？档沦t等[5]在自然發(fā)病條件下，對來自國內外的36 份冬瓜材料進行抗性鑒定，找到7 份高抗種質，抗性強弱順序依次為黑皮＞粉皮＞青皮。趙芹等[48]以黑皮冬瓜為試材，根據(jù)NBS 類抗病基因保守結構域設計簡并引物，得到19 個抗病同源序列。冬瓜種質資源的遺傳背景狹窄，因而通過傳統(tǒng)的圖位克隆獲得抗病基因難度較大。謝大森等[49]利用RAMP 技術，獲得了與冬瓜枯萎病抗性連鎖的分子標記，此標記可篩選攜帶有抗枯萎病基因的冬瓜種質。劉文睿等[50]從冬瓜抗病材料基因組中分離獲得32 個特異抗病基因同源序列。目前市場上抗病品種主要有廣東省農業(yè)科學院的鐵柱冬瓜[51]、墨寶[52]等，湖南興蔬種業(yè)有限公司的墨地龍[53]、鐵桿粉斯[54]等，其中鐵柱冬瓜在我國有較大的種植面積。

5 展 望

冬瓜在瓜類蔬菜生產(chǎn)中占有重要地位，而冬瓜枯萎病嚴重威脅冬瓜的安全生產(chǎn)。今后應重點關注抗病資源篩選、抗性基因定位、抗病機制解析和抗性品種選育等研究方向。一是加強抗病種質資源的篩選?？共¤b定是評價冬瓜品種枯萎病抗性的基本手段，關鍵是提高抗性鑒定穩(wěn)定性。目前，尚未見關于冬瓜枯萎病抗性評價的技術規(guī)范。由于枯萎病接種與發(fā)病受多因素影響，如菌株、溫度、濕度等，明確菌株致病力，統(tǒng)一鑒定條件與標準的對照品種是當務之急。隨著《第三次全國農作物種質資源收集與普查行動》的實施，我國收集到千余份各地冬瓜地方老品種，其中江西省收集并保存101 份古老冬瓜種質資源[55]，目前尚未對這些地方冬瓜種質資源開展枯萎病抗性精準鑒定。表型鑒定在抗病育種中花費大量時間，提高枯萎病抗性表型鑒定效率也將是今后的重要研究方向。二是深入挖掘抗性基因。冬瓜枯萎病是多基因控制的性狀，不同抗性資源種的抗性位點聚合可提高冬瓜枯萎病抗性。2019 年冬瓜全基因組測序已完成，以此為基礎挖掘冬瓜種質資源中所攜帶的優(yōu)異基因，結合表型組學、基因組學、蛋白組學等技術手段將優(yōu)異種質資源轉化為優(yōu)異基因資源是加快冬瓜抗枯萎病育種進程、防治枯萎病的有效途徑。三是選育多樣化冬瓜品種。隨著人民生活水平的提高和冬瓜種植面積的擴大，目前市場上對優(yōu)質冬瓜新品種的需求日益增加，篩選抗病、耐高溫、耐強光、耐濕的冬瓜新品種十分必要，具有廣闊的應用前景。