開建榮，王彩艷，石欣，李彩虹，楊春霞，王曉菁

(寧夏農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，寧夏 銀川，750002)

枸杞是我國傳統(tǒng)的藥食同源食品[1]，寧夏枸杞是唯一載入《2020年版中國藥典》的品種，枸杞果實(shí)中富含微量元素、多糖、黃酮、甜菜堿、類胡蘿卜素等多種功能營養(yǎng)成分[2-3]，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老、調(diào)節(jié)血脂、降血壓[4-7]等多重功效，在我國保健行業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)發(fā)揮著重要作用。枸杞作為寧夏地區(qū)特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，已成為我區(qū)生態(tài)治理、勞動力就業(yè)、脫貧富民的支柱產(chǎn)業(yè)，其產(chǎn)量、消費(fèi)量和出口量均居世界首位。目前，枸杞中功能成分的研究主要集中在甜菜堿、多糖等有機(jī)成分，或者不同產(chǎn)區(qū)枸杞中功能營養(yǎng)成分差異性研究[8-9]。近年來，有很多有關(guān)中藥材無機(jī)元素影響其質(zhì)量的研究[10-12]，這些研究表明，無機(jī)元素不僅直接或間接影響中藥材的生長發(fā)育[13]，還影響藥材中次生代謝產(chǎn)物的積累[12]，從而影響藥材的藥效作用，因礦物元素能夠反映農(nóng)產(chǎn)品生長的土壤環(huán)境、元素的種類和含量差異，具有一定地理標(biāo)志特征，因此，礦物元素分析技術(shù)是被公認(rèn)的植源性食品產(chǎn)地判別中最有效、最有前景的方法之一[14-17]，已被廣泛應(yīng)用。但目前溯源指標(biāo)穩(wěn)定性及機(jī)理探討的相關(guān)研究較為缺乏，不穩(wěn)定的溯源指標(biāo)不但增加了溯源的工作量，也可能影響穩(wěn)定溯源模型的建立，因此，本研究以中寧枸杞為研究對象，檢測分析不同成熟期枸杞中55種礦物元素含量，闡明不同成熟期枸杞礦物元素含量的變化特征，研究結(jié)果可為枸杞產(chǎn)地溯源提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(包括As、Ba、B、Bi、Be、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Li、Mg、Mn、Eu、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Tl、V、Zn、Ge、Mo、Nb、Ca、Ce、Dy、Gd、Ho、Nd、Pr、Sm、Tb、Lu、Tm、Y、Yb、Er、La、Sc、Sb、Sn、Ti、Zr、Pd、Ag、Ta、Hf、W、Ir、Pt、Ga、Hg元素，共計55種元素),美國 Perkin Elmer公司;硝酸為優(yōu)級純，德國 Merck 公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10047(生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)——胡蘿卜),中國地質(zhì)科學(xué)院地球物理地球化學(xué)勘查研究所研制。

1.2 儀器與設(shè)備

ELAN DRC-e ICP-MS儀，美國 Perkin Elmer公司；Mars6 Xpress微波消解儀，美國 CEM 公司；AL104電子天平，梅特勒-托利多公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集

枸杞樣品采自寧夏中寧同3個基地(37°19′10″～37°28′19″ N，105°34′25″～105°55′8″ E)二茬果成熟時期的5個成熟階段(7 d幼果期、14 d青果期、21 d黃變前期、28 d黃變后期和35 d紅熟期)果實(shí)。鮮樣曬干，置于50 ℃烘箱中烘干，然后進(jìn)行充分研磨，過100目篩后備用。

1.3.2 樣品前處理

枸杞中元素測定方法參考文獻(xiàn)[18]。采用微波消解法消解樣品，具體操作步驟：稱取0.500 0 g(精確到0.000 1 g) 枸杞樣品置于微波消解管中，加入硝酸10 mL，常溫靜置3 h后，放入微波消解儀中進(jìn)行樣品消解，選擇溫度控制，5 min爬升至120 ℃，保持10 min；5 min爬升至150 ℃，保持20 min；5 min爬升至185 ℃，保持30 min，消解完畢后冷卻，輕輕擰開蓋子，將微波消解管置于趕酸儀上120 ℃趕酸2 h，然后冷卻至室溫，用超純水洗至50 mL刻度試管中，并用超純水定容，搖勻；同時做試劑空白。

1.3.3 礦物元素含量測定

采用ICP-MS測定枸杞中元素含量。具體的工作條件：發(fā)生器功率為1 300 W；霧化器流量為0.95 L/min；等離子炬冷卻氣流量為17.0 L/min；輔助器流量為1.20 L/min；檢測器模擬階電壓為-2 350 V；離子透鏡電壓為6.00 V。儀器測定枸杞樣品及胡蘿卜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中55種元素，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定值在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)，儀器元素的檢出限和定量限見表1。

表1 ICP-MS儀器測定礦物元素標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限Table 1 ICP-MS instrument determination of mineral elements standard curve, detection limits and limits of quantification

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 25.0 Duncan進(jìn)行顯著性方差分析(P<0.05，差異顯著)；采用Origin 8.5進(jìn)行繪圖分析；采用SIMCA-P 進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞成熟過程中礦物元素變化規(guī)律

2.1.1 枸杞成熟過程中礦物元素含量分析

為了方便討論，將55種元素按照其在枸杞生長過程中的作用分為微量元素、稀土元素、有害金屬元素和其他元素，枸杞在5個生長階段礦物元素含量值見表2。

枸杞果實(shí)中微量元素的含量與枸杞的藥用價值密切相關(guān)，很多微量元素有害或無害是相對的，有益必需的微量元素，若改變其存在狀態(tài)或濃度，就會產(chǎn)生毒害作用[19]。例如，V是植物生長非必需的微量元素，低濃度V會促進(jìn)植物生長發(fā)育，但高濃度V對植物產(chǎn)生毒性作用[20]。對枸杞5個成熟階段樣品中的11種微量元素進(jìn)行檢測分析，并計算Fe/Mn值。由表2可知，各成熟期的干果中Cu、Co、B、Mg、Mn、Mo、Fe、Zn、Ca、Se、V元素含量范圍分別為12.5～16.6、0.11～0.23、9.5～14.2、1 483～3 422、16.1～30.0、0.32～0.64、49.4～86.5、22.5～57.0、1 020～3 273、0.012～0.031、0.050～0.10 mg/kg。除Se元素外，其余10種微量元素在枸杞不同成熟階段均具有顯著性差異(P<0.05)。枸杞作為一種藥食同源食品，是一種常用的中藥材，中藥的功效不是由單一成分的多少決定，而是由多種成分按照合理的比例共同作用的結(jié)果，中藥中微量元素的生理作用也不能從單一元素的絕對含量來分析，而應(yīng)該結(jié)合不同元素的比例來看[21]，牛艷等[22]研究認(rèn)為，適當(dāng)?shù)腇e/Mn值可能是寧夏中寧枸杞品質(zhì)較好的重要原因之一，有研究表明，中藥藥性從溫?zé)岬胶疀雠cFe/Mn值呈正相關(guān)，熱藥的Fe/Mn值在0.7左右，溫藥為3.0左右[23]。根據(jù)本文中中寧枸杞果實(shí)中Fe/Mn值為2.35～3.70，紅熟期的Fe/Mn值最高，可以確定中寧枸杞屬于溫藥。

稀土元素是元素周期表中 15 種鑭系元素、Sc和Y的總稱，在植物體內(nèi)相對比較穩(wěn)定。稀土元素以不同形態(tài)廣泛分布于土壤中，通常主要以難溶殘渣態(tài)形式存在，但也存在可被植物吸收利用的水溶態(tài)、可交換態(tài)和有機(jī)態(tài)[24]。植源性農(nóng)產(chǎn)品中稀土元素來源與地域環(huán)境具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，近年來，稀土元素已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源研究中。本文對不同成熟期中寧干果枸杞中的16種稀土元素含量進(jìn)行了分析(表2)，可見各成熟階段的枸杞中16種稀土元素含量均較低，其中La、Ce、Nd輕稀土元素及Sc、Y元素含量在枸杞中的分布較其他稀土元素較為豐富。La元素含量最高，為0.063～0.18 mg/kg，其次是Ce、Nd、Sc、Y元素，含量分別為0.035～0.095、0.014～0.035、0.015～0.033、0.013～0.020 mg/kg，之后是Pr、Eu、Yb、Dy、Er、Gd、Sm元素，含量為10-9數(shù)量級，Tb、Ho、Tm、Lu含量較低，為10-10數(shù)量級，枸杞中稀土元素顯示出輕稀土元素富集、重稀土元素虧欠的特征，這與齊國亮等[25]的研究結(jié)果相同。利用ANOVA單因素方差分析比較了不同成熟階段枸杞中稀土元素含量差異性，結(jié)果表明，除了Lu元素外，其余15種稀土元素在5個成熟階段均存在顯著性差異(P<0.05)。

對中寧枸杞中Pb、Cd、As、Hg、Cr、Ni、Ba、Tl、Sb、Sn 10種有害重金屬元素含量分析結(jié)果表明，各成熟階段的干果中Cr、Ni、Ba元素含量較高，為mg/kg級；Pb含量次之，含量為0.083～0.28 mg/kg，含量最低的元素為Hg、Tl含量較低，為μg/kg級，比Cd、As、Sb、Sn元素含量低10倍左右。不同成熟階段枸杞中有害金屬元素含量單因素方差分析結(jié)果表明，除了Hg、Tl元素，其他8種元素含量在不同成熟階段枸杞中差異顯著(P<0.05)。目前，中藥材重金屬超標(biāo)現(xiàn)象依然嚴(yán)重，《中國藥典》中規(guī)定了重金屬殘留限量：鉛、鎘、砷、汞、銅分別為5.0、1.0、2.0、0.2、20 mg/kg，中寧枸杞在整個成熟階段鉛、鎘、砷、汞均未超過限量標(biāo)準(zhǔn)，Cu最高含量為16.6 mg/kg，也低于限量值，中寧枸杞質(zhì)量屬安全級。我國現(xiàn)行的有關(guān)枸杞重金屬元素限量的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，僅對As、Cd、Pb、Hg、Cu的限量值進(jìn)行了規(guī)定，并未對其他元素含量做明確要求，但Ni、Cr、Tl等重金屬的攝入對人體危害嚴(yán)重，如鎳元素攝入過量會損害人的肝臟和心肺功能[26]。因枸杞為藥食同源食品，日攝入量較大，需加強(qiáng)枸杞中重金屬的監(jiān)測。

中寧枸杞中Bi、Be、Sr、Li、Rb、Cs、Ti、Zr、Nb、Pd、Ag、Hf、Ta、W、Ir、Pt、Ga、Ge 18種元素含量分析結(jié)果顯示，Sr、Rb元素含量較高，分別為7.2～20.6 mg/kg和11.1～15.2 mg/kg，Ti、Li含量分別為2.54～7.69 mg/kg和1.57～1.94 mg/kg，Ga、Cs、Zr、Ag元素含量較上述元素低100倍，Nb、Pt、Ir、W、Ta、Bi、Be、Pd、Ge、Hf含量較低，為μg/kg級。18種元素在5個時期含量的方差分析結(jié)果顯示，5個階段枸杞中Be、Nb、Pd、Ta、Hf、Pt、Ge元素含量不存在顯著差異(P>0.05)，其他11種元素均存在顯著差異(P<0.05)。

根據(jù)以上分析結(jié)果，中寧地區(qū)5個成熟階段枸杞中Cu、Co、B、Mg、Mn、Mo、Fe、Zn、Ca、V、La、Ce、Nd、Sc、Y、Pr、Eu、Yb、Dy、Er、Gd、Sm、Tb、Ho、Tm、Pb、Cd、As、Cr、Ni、Ba、Sb、Sn、Bi、Sr、Li、Rb、Cs、Ti、Zr、Ag、W、Ir、Ga 44種礦物元素在枸杞成熟階段存在“時間差異”。

表2 不同成熟期枸杞中礦物元素含量 單位：mg/kg

2.1.2 枸杞成熟過程中礦物元素變化規(guī)律

對部分元素含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理(Pr、Eu、Yb、Dy、Er、Gd、Sm、Pb元素含量乘以10，Co、Mo、V、Cd、As、Sb、Tb、Ho、Tm、Lu、Sn、Cs、Zr、Ga元素含量乘以100，Se、Hg、Tl、Bi、Be、Nb、Pd、Ag、Ta、Hf、W、Ir、Pt和Ge元素含量乘以1 000；Sr、Rb元素含量除以10，Ca、Mg元素含量除以100)后，做圖，見圖1。

微量元素中，Cu、Co、B、Mg、Mn、Mo、Ca元素在5個成熟期基本呈降低的趨勢，在幼果期/青果期達(dá)到最大值，在紅熟期達(dá)到最低；Fe、Zn、V元素含量呈先降低后升高的趨勢，F(xiàn)e、V在幼果期達(dá)到最高，隨后逐漸降低，在黃變前期/后期達(dá)到最低值，在紅熟期又有所升高，達(dá)到次高值，Zn在幼果期達(dá)到次高值，隨后降低在黃變后期達(dá)到最低值，Zn在紅熟期急劇升高，達(dá)到最高值；Se元素在5個成熟階段含量變化趨勢不明顯。

稀土元素中，Sc元素呈先升高后降低的趨勢，在黃變前期達(dá)到最高值；枸杞對其他15種稀土元素在整個成熟階段具有相同的吸收累積規(guī)律，即先降低后升高的趨勢，在黃變前期/黃變后期達(dá)到最低值，在幼果期/青果期達(dá)到最大值。稀土元素總量也呈先降低后升高的趨勢，在幼果期含量達(dá)到最高，在黃變前/后期達(dá)到最低值。有研究表明，稀土元素具有生物活性，可提高作物的產(chǎn)量影響植物生理和生物化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)程對植物的生命活動是有益的[27]，而GB 2762—2005《食品中污染物限量》中規(guī)定了稻谷、玉米、小麥、綠茶等植源性食品中稀土元素總含量限量值為0.5～2.0 mg/kg，但在GB 2762—2017《食品中污染物限量》中又取消了食品中稀土元素的含量限值，中寧枸杞在整個成熟階段稀土元素總含量在幼果期達(dá)到最高，為0.361 mg/kg，根據(jù)GB 2762—2005中的規(guī)定，中寧枸杞中稀土元素總量未超過限量值。

有害金屬元素中，Pb、As、Hg、Sb、Tl、Sn元素在5個成熟期呈先降低后升高的趨勢；Cd、Cr、Ni、Ba元素逐漸降低，并在后期趨于穩(wěn)定，說明Cd、Cr、Ni、Ba、Sn元素的富集系數(shù)較低，或是從根莖部向枸杞果實(shí)的轉(zhuǎn)運(yùn)能力較弱。

其他元素中，枸杞對Bi、Be、Cs、Zr、Nb、Ag、Ta、Ge元素的吸收具有一致規(guī)律，即先降低后升高，枸杞中這些元素在黃變前期/黃變后期元素含量達(dá)到最低值；Sr、Rb、Ti、W、Ga元素具有一致的吸收規(guī)律，即枸杞在幼果期、青果期對這些元素具有較強(qiáng)的吸收作用，隨著枸杞成熟，枸杞對這些元素的需求量減少，其含量逐漸降低；Li、Pd、Hf、Zr、Pt元素含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，基本在黃變前期/黃變后期達(dá)到最大值。

A-微量元素；B-稀土元素；C-有害金屬元素；D-其他元素圖1 不同成熟階段枸杞中微量元素、稀土元素、有害金屬元素、其他元素含量的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of contents of trace elements, rare earth elements, harmful metal elements and other elements in Lycium barbarum at different maturation stages

2.2 偏最小二乘法分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)枸杞中55種礦物元素

2.2.1 主成分及主因子提取過程分析

主成分分析是通過降維以達(dá)到簡化分析過程的目的，原始指標(biāo)的因子載荷和主成分得分圖分別表明其對主成分的貢獻(xiàn)程度和不同樣本之間的聯(lián)系與差異[28]。

對中寧枸杞5個成熟階段中55種元素含量進(jìn)行PLS-DA分析，結(jié)果列于表3，根據(jù)特征值大于1的原則，可提取出2個主成分，2個主成分的特征值分別為9.76、2.38，方差貢獻(xiàn)率分別為65.1%和15.8%，累計方差貢獻(xiàn)率為80.9 %。因此可以將PLS-DA的前2個主因子作為評價枸杞樣品質(zhì)量的綜合變量，達(dá)到了對評價枸杞礦物元素含量指標(biāo)的降維目的。

表3 PLS-DA的累計貢獻(xiàn)率Table 3 Cumulative contribution rate of PLS-DA

2.2.2 基于PLS-DA的不同成熟階段枸杞的分類

中寧枸杞5個成熟階段中55種元素含量進(jìn)行PLS-DA分析，構(gòu)建不同成熟階段枸杞的區(qū)分模型。該模型中R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2(cum)分別為0.936、0.977和0.912，說明建立的PLS-DA模型中2個主成分能有效解釋5個成熟階段之間的差異，且該模型具有一定的預(yù)測能力。圖2為PLS-DA模型第一、二主成分得分圖?？梢钥闯觯鞒墒祀A段樣品群體有明顯的聚集趨勢，幼果期(YG)枸杞樣品聚在第一象限，紅熟期(HS)枸杞樣品聚在第二象限，黃變前期(HBQ)和黃變后期(HBH)枸杞樣品聚在第三象限，青果期(QG)枸杞樣品聚在第四象限。

根據(jù)VIP值(圖3)，可篩選出Sc(VIP:1.576 3)、Li(1.501 58)、Zn(1.450 72)、Ta(1.421 99)、Be(1.373 54)、La(1.325 38)、Se(1.305 46)、Sb(1.276 32)、Lu(1.251 62)、Pt(1.241 67)、Ni(1.199 67)、Ir(1.146 07)、Sr(1.135 21)、Hg(1.108 52)、Mo(1.100 46)、Bi(1.095 28)、Pb(1.046 19)、W(1.035 4)、Hf(1.034 67)、Yb(1.019 33)、Pd(1.008 18)、Sn(1.005 84)22種礦物元素作為中寧枸杞不同成熟階段的有效區(qū)分指標(biāo)。

圖2 PLS-DA模型第一、二主成分得分圖Fig.2 Score plot of first versus second components in PLS-DA

圖3 PLS-DA模型VIP值Fig.3 The VIP plot of PLS-DA

3 結(jié)論

追蹤中寧枸杞中55種礦物元素在整個成熟過程中的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)枸杞在不同成熟階段元素含量差異較大，44種礦物元素含量在不同成熟階段具有顯著差異(P<0.05)，且稀土元素顯示出輕稀土元素富集、重稀土元素虧欠的特征。除Se元素外，其余54種礦物元素在整個成熟期有其各自的變化趨勢，Cu、Co、B、Mg、Mn、Mo、Ca、Cd、Cr、Ni、Ba、Sr、Rb、Ti、W、Ga呈降低趨勢，F(xiàn)e、Zn、V、Pb、As、Hg、Sb、Tl、Sn、La、Ce、Nd、Y、Pr、Eu、Yb、Dy、Er、Gd、Sm、Tb、Ho、Tm、Lu、Bi、Be、Cs、Zr、Nb、Ag、Ta、Ge呈先降低后升高的趨勢，Sc、Li、Pd、Hf、Zr、Pt呈先升高后降低的趨勢。對中寧枸杞5個成熟階段中55種元素含量進(jìn)行PLS-DA分析，可提取出2個主成分，累計方差貢獻(xiàn)率為80.9%，同時構(gòu)建不同成熟階段枸杞的區(qū)分模型，第一主成分、第二主成分得分圖可以將5個成熟階段的樣品很好地區(qū)分開，同時可篩選出Sc、Li、Zn、Ta、Be、La、Se、Sb、Lu、Pt、Ni、Ir、Sr、Hg、Mo、Bi、Pb、W、Hf、Yb、Pd、Sn 22種礦物元素為中寧枸杞不同成熟階段的有效區(qū)分指標(biāo)。