石劉婷，賀禹豐，楊羽倩，祁亞勁，魯佳欣，詹語，郭敏，王慧玲，趙建新，張灝，王剛*，陳衛(wèi)

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(蘇州市立醫(yī)院 南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，南京醫(yī)科大學(xué)姑蘇學(xué)院，江蘇 蘇州，215002)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期婦女常見的內(nèi)分泌疾病，發(fā)病率高達(dá)5%～10%[1]。PCOS患者的主要臨床表現(xiàn)為不孕、月經(jīng)不調(diào)、高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變等[2-3]。此外，PCOS患者的代謝功能異常，包括胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝異常等[4]。研究表明，PCOS患者患二型糖尿病、心血管疾病、子宮內(nèi)膜癌等疾病的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)顯著增加[5]。目前，藥物治療依然是緩解PCOS癥狀的首選方案，常用的藥物包括口服避孕藥、促排卵藥物、胰島素增敏劑等。這些藥物主要是通過調(diào)節(jié)月經(jīng)周期、降低胰島素抵抗來調(diào)節(jié)激素水平，促發(fā)排卵。但是使用以上藥物也存在著明顯的副作用，如口服避孕藥可能增加胰島素抵抗的風(fēng)險(xiǎn)，胰島素增敏劑可能增加患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)等[6-7]。因此，尋找一種更加安全且有效的PCOS緩解手段很有必要。

相關(guān)研究表明，PCOS患者往往伴隨著腸道菌群的失調(diào)，其特征表現(xiàn)為菌群α多樣性降低以及特定種屬豐度的顯著變化[8-10]。此外，研究表明，將正常大鼠的腸道菌群移植到PCOS大鼠中，PCOS大鼠的癥狀得到了緩解，而將PCOS小鼠的腸道菌群移植到正常小鼠體內(nèi)，正常小鼠也會(huì)表現(xiàn)出一定的PCOS癥狀[1, 11]。因此，腸道菌群與PCOS二者之間存在十分密切的聯(lián)系，以腸道菌群為靶點(diǎn)的膳食干預(yù)方法具有緩解PCOS癥狀的潛在價(jià)值。益生菌是一類能夠?qū)λ拗鹘】蛋l(fā)揮有益作用的活性微生物，可以調(diào)節(jié)宿主的腸道菌群。研究表明，長期服用益生菌可以調(diào)節(jié)PCOS患者血清中異常的睪酮水平[12]。此外，SHAMASBI等[13]發(fā)現(xiàn)長期攝入益生菌可以顯著降低PCOS 患者體內(nèi)激素和炎癥指標(biāo)的水平。而本研究團(tuán)隊(duì)也已證明特定植物乳桿菌可以緩解PCOS大鼠的相關(guān)病癥[14]。

為了進(jìn)一步探究具有緩解PCOS潛力的菌株在食品中的應(yīng)用價(jià)值，本研究將3株植物乳桿菌(CCFM1019、LP4、LP5)進(jìn)行豆乳發(fā)酵，進(jìn)一步評價(jià)了不同植物乳桿菌發(fā)酵豆乳攝入對PCOS大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與動(dòng)物

植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5均來源于江南大學(xué)生物技術(shù)中心菌種保藏庫，具體信息如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株的具體信息Table 1 The information of strains used in study

實(shí)驗(yàn)選用購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司的36只SPF級7周齡的雌性SD大鼠，飼養(yǎng)于江南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，審批號：JN.No20201030S0421230[283]，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合江南大學(xué)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)的規(guī)定(SYXK 2012—0002)和歐盟指導(dǎo)手冊(編號:2010 /63 /EU)。

1.2 藥品與試劑

大豆、蔗糖購于當(dāng)?shù)爻校粊砬蚱?批號：200903KB，來曲唑單片的有效藥物含量為2.5 mg)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose，CMC)，上海麥克林生化科技有限公司；達(dá)英-35(批號：KT04L5J2，達(dá)英-35單片的有效藥物含量為醋酸環(huán)丙孕酮2 mg和炔雌醇0.035 mg)，拜爾醫(yī)藥保健有限公司；大鼠性激素睪酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol，E2)、促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、孕酮(progesterone，P)、促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)ELISA試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

PB300-N電子天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；BS-480全自動(dòng)生化分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；GRP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Eppendorf 高速冷凍離心機(jī)5804R，德國艾本德股份公司；994型Thermo超低溫冰箱、酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；血糖儀，Roche Diabetes Care GmbH羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司。

1.4 發(fā)酵豆乳的制備

挑選表面光澤無霉?fàn)€變質(zhì)的大豆，按大豆∶純凈水=1∶10(g∶mL)加水過夜浸泡。將浸泡過的大豆用破壁機(jī)磨漿，磨漿過濾之后沸水煮漿，添加7%蔗糖調(diào)漿，在115 ℃下滅菌20 min，冷卻至室溫。按照4%的接種量將3株植物乳桿菌分別接種至已經(jīng)冷卻好的豆乳中，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時(shí)間為8 h，最終發(fā)酵終點(diǎn)發(fā)酵豆乳活菌數(shù)均在1×108CFU/mL，-80 ℃貯存，待用。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案

大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，將36只SD雌性大鼠按體重隨機(jī)分為空白組、模型組、達(dá)英-35組、CCFM1019組、LP4組、LP5組，每組6只。造模期間，模型組、達(dá)英-35組和發(fā)酵豆乳干預(yù)組大鼠分別每天灌胃來曲唑懸濁液(20片來曲唑懸浮于250 mL 1% CMC溶液)，最終灌胃體積達(dá)到0.5 mL/100g BW，連續(xù)灌胃21 d誘導(dǎo)建立PCOS模型[15]，同時(shí)空白組大鼠每天灌胃1%CMC溶液，最終灌胃體積達(dá)到0.5 mL/100g BW。干預(yù)期、空白組、模型組分別灌胃2 mL未發(fā)酵豆乳，達(dá)英-35組每天灌胃達(dá)英-35懸濁液(1片達(dá)英-35懸浮于50 mL 1% CMC溶液)，最終灌胃體積達(dá)到0.45 mL/100g BW，乳酸菌發(fā)酵豆乳組分別灌胃2 mL發(fā)酵豆乳，具體實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。實(shí)驗(yàn)期間，觀察各組大鼠一般情況，記錄體重變化。

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.1 The process of animal experiment

1.6 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)

灌胃3周后，各組大鼠禁食不禁水12 h，利用血糖儀測空腹血糖值，按0.5 mL/100g體重灌胃50%葡萄糖注射液，鼠尾采血測量灌胃后30、60、90、120 min血糖值。

1.7 血清及組織收集

實(shí)驗(yàn)第29天采用異氟烷麻醉法，使大鼠麻醉，心臟采血，室溫靜置2 h后以3 000 r/min離心15 min收集血清并保存于-80 ℃冰箱。摘取雙側(cè)卵巢，用鑷子仔細(xì)分離并去除其表面脂肪組織，用天平稱重。一部分卵巢于4%多聚甲醛溶液中固定，另一部分于液氮中迅速冷凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 大鼠卵巢病理學(xué)檢測

將固定在4%多聚甲醛中的卵巢，各級酒精依次脫水后，二甲苯透明，石蠟包埋，卵巢切片(每張切片厚5 μmol/L)，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色后鏡檢，盲法統(tǒng)計(jì)每張樣本切片的囊性卵泡數(shù)、黃體數(shù)。

1.9 大鼠血清性激素水平測定

采用ELISA試劑盒檢測血清中的FSH、LH、E2、T水平、P、GnRH，具體操作嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.10 大鼠生化分析指標(biāo)測定

生化分析指標(biāo)包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，總膽固醇(total cholesterol，TC)，甘油三酯(triglyceride，TG)，高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein，LDL-C)，均采用全自動(dòng)生化分析儀測定。

1.11 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用 GraphPad Prism 5(GraphPad software，California，USA，5.0 版)將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(Fisher’s LSD檢驗(yàn))，對不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*為與模型組比較，P<0.05；#為與空白組相比，P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對PCOS大鼠體重以及卵巢重量的影響

由表2和圖2可知，與空白組相比，模型組、達(dá)英-35組及發(fā)酵豆乳組的大鼠最終體重增加并且體重增量也顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，達(dá)英-35組和LP5組大鼠體重增量顯著下降(P<0.05)。以上數(shù)據(jù)表明植物乳桿菌LP5發(fā)酵豆乳具有降低PCOS大鼠體重增加的潛在作用。

如表2所示，與空白組相比，模型組、達(dá)英-35組以及發(fā)酵豆乳組大鼠卵巢質(zhì)量均有所增加。這些結(jié)果表明植物乳桿菌發(fā)酵豆乳在減輕PCOS大鼠卵巢質(zhì)量上幾乎沒有效果。

表2 各組大鼠體重以及卵巢質(zhì)量變化Table 2 Changes of body weight and ovarian weight of rats in each group

2.2 植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對PCOS大鼠糖耐量的影響

由圖3-a可知，在給大鼠灌胃60 min后，空白組、模型組、達(dá)英-35組及發(fā)酵豆乳組血糖均迅速升高。圖3-b中，與空白組相比，模型組糖耐量曲線下面積有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。植物乳桿菌發(fā)酵豆乳干預(yù)后，LP4組大鼠的糖耐量曲線下面積有減小趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此，植物乳桿菌發(fā)酵豆乳在調(diào)控PCOS大鼠糖耐量上無明顯效果。

a-PCOS大鼠口服葡萄糖耐量測試；b-OGTT曲線下面積圖3 植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對PCOS大鼠糖耐量的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus plantarum fermented soymilk on glucose tolerance of PCOS rats 注：*與模型組比較，P<0.05；#與空白組比較，P<0.05(下同)

2.3 植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對PCOS大鼠卵巢病理形態(tài)學(xué)的影響

由圖4-a可知，空白組大鼠卵巢表面色澤紅潤，可見黃體，無囊性卵泡，而模型組大鼠卵巢表面色澤變淺，黃體數(shù)減少，囊性卵泡數(shù)增加(圖4-b)。由表3可知，CCFM1019組黃體數(shù)目有所增加，囊性卵泡數(shù)也有所減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而LP4、LP5組卵巢中的黃體數(shù)并未有所增加，但囊性卵泡數(shù)有所減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。綜上所述，CCFM1019發(fā)酵豆乳一定程度上可以減輕來曲唑引起的大鼠卵巢病變。

a-空白組；b-模型組；c-達(dá)英-35組；d-CCFM1019組； e-LP4組；f-LP5組圖4 發(fā)酵豆乳對PCOS大鼠卵巢病理形態(tài)的影響(×40)Fig.4 Effects of L.plantarum fermented soymilk on histopathology of the ovary in PCOS rats 注：標(biāo)尺為600 μm

2.4 植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對PCOS大鼠血清性激素水平的影響

由圖5-a、圖5-b及圖5-d、圖5-e可知，與空白組相比，模型組大鼠血清中T、LH及FSH的水平顯著升高、P的水平顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，LP4組大鼠血清中LH水平顯著降低(P<0.05)，CCFM1019組大鼠血清中E2水平顯著提高(P<0.05)。此外，達(dá)英-35以及3組植物乳桿菌發(fā)酵豆乳均可以顯著降低PCOS大鼠血清中T的水平(P<0.05)，其中，LP4效果最好，達(dá)英-35以及LP5次之，CCFM1019效果略差。而由圖5-f可知，各組大鼠血清中GnRH水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這些結(jié)果表明CCFM1019發(fā)酵豆乳在調(diào)節(jié)PCOS大鼠血清中E2水平上優(yōu)勢，而LP4發(fā)酵豆乳更傾向于在調(diào)節(jié)T、LH水平上發(fā)揮作用。

表3 各組大鼠的黃體數(shù)及囊性卵泡數(shù) 單位：個(gè)

a-血清T水平；b-血清LH水平；c-血清E2水平；d-血清FSH水平；e-血清P水平；f-血清GnRH水平圖5 植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對PCOS大鼠血清性激素水平的影響Fig.5 Effects of L.plantarum fermented soymilk on serum sex hormone levels in PCOS rats

2.5 植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對PCOS大鼠生化分析指標(biāo)的影響

對PCOS大鼠生化分析指標(biāo)進(jìn)行分析，如表4所示，與空白組相比，PCOS大鼠血清中AST含量顯著上升(P<0.05)。與模型組相比，CCFM1019組大鼠血清中的AST含量顯著降低(P<0.05)。此外，植物乳桿菌LP4、LP5發(fā)酵豆乳干預(yù)后，顯著降低了大鼠血清中ALT及AST含量(P<0.05)。與空白組相比，模型組大鼠血清中LDL-C含量顯著增加(P<0.05)，HDL-C含量顯著下降(P<0.05)。植物乳桿菌發(fā)酵豆乳干預(yù)后在一定程度上降低大鼠血清中TG、TC及LDL-C含量，其中，LP5顯著降低TC及LDL-C含量(P<0.05)。此外，除了CCFM1019組，其余組別大鼠血清中HDL-C含量進(jìn)一步降低。因此，植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對提高PCOS大鼠血清中HDL-C含量無明顯效果。這些結(jié)果表明CCFM1019發(fā)酵豆乳在調(diào)節(jié)PCOS大鼠血清中的AST水平上有優(yōu)勢，而LP4發(fā)酵豆乳在調(diào)節(jié)ALT、AST、TC水平上有優(yōu)勢，此外，LP5發(fā)酵豆乳更傾向于在調(diào)節(jié)ALT、AST、TC、LDL-C水平上發(fā)揮作用。

表4 植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對PCOS大鼠生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of L.plantarum fermented soymilk on biochemical indexes of PCOS rats

3 結(jié)論與討論

臨床上，血清T、LH常作為PCOS患者的一項(xiàng)敏感性指標(biāo)。研究表明[16]，乳酸雙歧桿菌V9通過在宿主腸道的有效定植調(diào)節(jié)了PCOS患者的腸道微生物群，并恢復(fù)了他們體內(nèi)的性激素水平。此外，研究表明植物乳桿菌HL2對PCOS大鼠體內(nèi)卵巢病變有保護(hù)作用，并能恢復(fù)T、LH和FSH水平[14]。在本研究中，3株植物乳桿菌發(fā)酵豆乳和達(dá)英-35均顯著降低了PCOS大鼠血清中T的水平，而植物乳桿菌LP4顯著降低了大鼠血清中LH的水平。此外，植物乳桿菌CCFM1019發(fā)酵豆乳干預(yù)后大鼠血清E2水平顯著提高，在臨床實(shí)踐中，PCOS患者由于卵泡發(fā)育更加活躍，可能會(huì)出現(xiàn)E2水平升高[17]。發(fā)酵豆乳干預(yù)后使E2升高，這一現(xiàn)象對于PCOS本身而言是否有利仍不清楚。同時(shí)，該影響是由益生菌本身造成，還是由豆乳中的雌激素類似物大豆異黃酮造成，還有待于進(jìn)一步研究。糖代謝紊亂是PCOS患者代謝異常的顯著表現(xiàn)癥狀之一。研究表明[18]，PCOS胰島素抵抗患者體內(nèi)攝取與利用葡萄糖的能力下降，使得葡萄糖耐量發(fā)生異常。此外，血脂異常也是PCOS患者的臨床癥狀之一，主要以血清中TC、TG、LDL-C升高和HDL-C降低為特征[19]。本研究中，植物乳桿菌發(fā)酵豆乳干預(yù)后，在調(diào)節(jié)PCOS大鼠OGGT、TG等指標(biāo)上無明顯效果，與本研究結(jié)果相反的是，RASHAD等[20]證明，PCOS患者長期服用益生菌可以調(diào)節(jié)體內(nèi)TG含量。原因可能是本研究周期僅為4周，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于RASHAD等12周的研究周期；同時(shí)本研究發(fā)酵豆乳活菌數(shù)為1×108CFU/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于RASHAD等研究中的活菌數(shù)(1×1010CFU/mL)；此外，本研究選用的是單菌株干預(yù)，而RASHAD等選用的是復(fù)配菌株干預(yù)(德氏乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌)，也可能是造成本研究中發(fā)酵豆乳在調(diào)節(jié)PCOS大鼠OGGT、TG等指標(biāo)上無明顯效果的原因。

在本團(tuán)隊(duì)之前的研究中，植物乳桿菌CCFM1019在降低PCOS大鼠血清中E2水平上無顯著效果[14]。而在本研究中，經(jīng)過豆乳發(fā)酵后，植物乳桿菌CCFM1019可以顯著升高PCOS大鼠血清中E2水平。此外，植物乳桿菌LP5在緩解PCOS大鼠的典型病理學(xué)表現(xiàn)上無顯著效果，而在本研究中，經(jīng)過豆乳發(fā)酵后，植物乳桿菌LP5可以顯著降低PCOS大鼠體重增加量和血清中T、AST、ALT、TC以及LDL-C含量。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵豆乳里面含有大豆異黃酮。研究表明[21]，大豆異黃酮可以降低PCOS大鼠體重。此外，本研究采用的是灌胃來曲唑進(jìn)行PCOS大鼠造模，模型激素呈現(xiàn)高雄激素和低雌激素特點(diǎn)，發(fā)酵豆乳干預(yù)后，其中的大豆異黃酮可能發(fā)揮雌激素樣作用，補(bǔ)充PCOS大鼠體內(nèi)的雌激素，使得血清中的T水平下降。因此，植物乳桿菌發(fā)酵豆乳在一定程度上可能比單獨(dú)使用植物乳桿菌(等量CFU)干預(yù)更能有效緩解PCOS大鼠癥狀。

在本研究中，3種植物乳桿菌發(fā)酵豆乳均可以在一定程度上緩解PCOS大鼠的典型病理學(xué)表現(xiàn)。其中，3株植物乳桿菌發(fā)酵豆乳均能顯著下調(diào)PCOS大鼠血清中T、AST 水平。而CCFM1019發(fā)酵豆乳能夠顯著升高PCOS大鼠血清中E2含量，在一定程度上也減輕了PCOS大鼠卵巢病變。相比之下，LP4發(fā)酵豆乳可以降低PCOS大鼠血清中LH、ALT以及TC含量，此外，LP5發(fā)酵豆乳顯著降低PCOS大鼠體重增加量以及血清中T、ALT、TC以及LDL-C含量。

綜上所述，不僅特定植物乳桿菌菌株具有改善PCOS癥狀的能力，其發(fā)酵豆乳同樣具有緩解PCOS的潛力。然而，發(fā)酵豆乳的功能性是否依賴于菌株活性并沒有在本研究中得以驗(yàn)證。滅菌發(fā)酵豆乳是否依然具有緩解PCOS的潛力有待于進(jìn)一步研究。