張成明，李硯飛，董保成，劉曉玲，白耀博，曹丹，劉潔，李十中

1(徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，徐州市生物制藥與廢棄物綜合利用工程中心，江蘇 徐州，221006)2(青縣新能源技術(shù)推廣中心， 河北 滄州，062650)3(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)總站，北京，100125)4(天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津，300350) 5(中國環(huán)境科學(xué)研究院，北京，100012)6(清華大學(xué) 核能與新能源技術(shù)研究院，中美生物燃料聯(lián)合研究中心，北京，100084)

我國從2015年開始推廣大規(guī)模沼氣工程，以解決農(nóng)業(yè)廢棄物及禽畜糞污帶來的污染問題[1-2]。其中，纖維質(zhì)原料來源廣泛、收集、貯存便利，被很多沼氣工程用作生產(chǎn)原料。纖維質(zhì)原料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等組成，其中纖維素和半纖維素可以被微生物降解并轉(zhuǎn)化為沼氣。但是，纖維質(zhì)原料的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其降解效率較低。為了解決這一問題，研究者開發(fā)出了多種預(yù)處理手段。其中，堿預(yù)處理被認(rèn)為具有很好的應(yīng)用潛力。NaOH是堿預(yù)處理中最常用、性價(jià)比最高的試劑，在多種纖維質(zhì)原料的預(yù)處理中均取得了良好效果[3-4]。玉米秸稈是沼氣工程最常用的原料之一。韓婭新等[5]報(bào)道，玉米秸稈中揮發(fā)性固形物比例較高，達(dá)到92.56%；其C/N比為31.88，基本處于厭氧消化的最佳C/N范圍內(nèi)(20～30∶1)，優(yōu)于水稻秸稈的61.59和小麥秸稈的78.47。這也是沼氣工程可以以玉米秸稈為唯一原料而穩(wěn)定運(yùn)行的原因[1]。

對(duì)于厭氧消化處理，除反應(yīng)條件外，其性能主要取決于兩方面因素，一是物料自身的物理化學(xué)特性，二是沼氣發(fā)酵過程中的微生物菌群。研究表明，對(duì)纖維質(zhì)原料進(jìn)行堿預(yù)處理，可以達(dá)到解開交聯(lián)、增大物料多孔性、增加比表面積、降低纖維素的聚合度和結(jié)晶度、破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)并部分溶解木質(zhì)素等目的，進(jìn)而提升了纖維質(zhì)底物的厭氧消化性能[5-7]。在微生物菌群方面，近年來的研究主要集中在厭氧條件(如底物濃度、溫度等)及底物種類對(duì)微生物菌群的影響[8-14]。例如，蔣滔等[10]研究了玉米秸稈在固態(tài)及液態(tài)厭氧消化條件下微生物菌群的變化。青格爾等[14]研究了低溫條件下，玉米秸稈降解過程中的微生物組成。DE FRANCISCI等[8]則報(bào)道了底物組成對(duì)微生物群落的影響。

目前為止，圍繞預(yù)處理促進(jìn)纖維質(zhì)原料厭氧消化性能，以及研究厭氧消化過程中微生物群落動(dòng)態(tài)變化的報(bào)道較多。但是，對(duì)比研究預(yù)處理組與對(duì)照組在菌群結(jié)構(gòu)方面的差異報(bào)道較少[7]。本文重點(diǎn)分析了堿預(yù)處理對(duì)玉米秸稈固態(tài)厭氧消化過程中菌群變化的影響。

1 材料與方法

1.1 底物與接種物

玉米秸稈，耿忠生物技術(shù)有限公司，粉碎至40目以下；總固形物(total solids，TS)、揮發(fā)性固形物(volatile solids，VS)等組分見表1；厭氧污泥，某污水處理廠。

表1 玉米秸稈及厭氧消化污泥組分 單位：%

1.2 儀器與設(shè)備

SX-25-1馬弗爐、101-1ES電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；AMPTS II甲烷測定儀，瑞典碧普有限公司；BSA124S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 NaOH 預(yù)處理

用于玉米秸稈預(yù)處理的NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%(按玉米秸稈TS添加)，預(yù)處理過程含水量為90%，在30 ℃，100 r/min的條件下處理3 d。對(duì)照組不加NaOH，其余條件完全相同。

1.3.2 固態(tài)厭氧消化

處理后的玉米秸稈與污泥按質(zhì)量比2.5∶1(以VS計(jì))的比例進(jìn)行混合接種，厭氧消化體系TS為15%，反應(yīng)溫度(35±1)℃。用500 mL血清瓶作為反應(yīng)器，發(fā)酵開始前通氮?dú)庖员ＷC厭氧環(huán)境。厭氧消化過程在AMPTS Ⅱ甲烷測定儀中進(jìn)行。沼氣用3 mol/L NaOH吸收二氧化碳等氣體，獲得的產(chǎn)氣量即為甲烷產(chǎn)量。以未經(jīng)NaOH預(yù)處理的玉米秸稈作為對(duì)照的原料，兩組分別設(shè)置3個(gè)平行。

1.3.3 DNA提取方法

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選定取樣時(shí)間，樣品先用改進(jìn)后的TENP buffer進(jìn)行預(yù)處理[11]。具體步驟：取0.25 g樣品加入到2 mL滅菌離心管，加1.5 mL TENP buffer，振蕩3 min，室溫下12 000 r/min離心5 min，棄去上清液。再重復(fù)上述步驟洗滌1次。接著用1 mL PBS buffer洗滌，在室溫下12 000 r/min離心5 min，棄去上清液，再重復(fù)洗滌1次。然后加1 mL滅菌后的蒸餾水洗滌1次。最后用Fast DNA Spin Kit for soil(MP Biomedicals，Shanghai，China)試劑盒，按說明書步驟提取菌群總DNA。

1.3.4 宏基因組測序

DNA 樣品由諾賽基因組研究中心將檢測合格的環(huán)境DNA樣品經(jīng)過片段化、片段篩選、建庫并做相應(yīng)的檢測。檢測合格的文庫將采用Illumina Miseq/Hiseq高通量測序平臺(tái)進(jìn)行測序，測序得到的數(shù)據(jù)用于后期生物信息學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)中對(duì)細(xì)菌及古菌均進(jìn)行了測定。

1.3.5 取樣點(diǎn)設(shè)計(jì)

根據(jù)日產(chǎn)氣特性，將厭氧消化階段分為產(chǎn)氣高峰期、產(chǎn)氣穩(wěn)定期和產(chǎn)氣末期3個(gè)階段；對(duì)應(yīng)的取樣時(shí)間分別為第2、10、25天。為了更好地理解堿處理后厭氧消化過程的菌群變化，在產(chǎn)氣高峰期增加了第1和第3天兩個(gè)取樣點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaOH預(yù)處理對(duì)玉米秸稈固態(tài)消化產(chǎn)氣性能的影響

實(shí)驗(yàn)首先分析了預(yù)處理對(duì)玉米秸稈固態(tài)消化產(chǎn)氣性能的影響。預(yù)處理后，玉米秸稈的累積甲烷產(chǎn)率由101.8 mL/g TS提高到149.0 mL/g TS，提高約46.3%(圖1)。該現(xiàn)象與其他研究者得到的結(jié)果類似[5]。從整個(gè)發(fā)酵過程看，NaOH預(yù)處理組和對(duì)照組的日產(chǎn)氣趨勢十分相似，都經(jīng)歷3個(gè)比較明顯的階段：產(chǎn)氣高峰期(第1階段)、產(chǎn)氣穩(wěn)定期(第2階段)和產(chǎn)氣末期(第3階段)。與對(duì)照組相比，預(yù)處理組在階段1產(chǎn)氣高峰的峰值更高[30.2 mL/(g TS·d)]；而且每個(gè)階段持續(xù)的時(shí)間都更短(圖2)。根據(jù)產(chǎn)氣規(guī)律，分別選擇有代表性的時(shí)間點(diǎn)，第1、2、3、10、25天的菌群作為研究目標(biāo)。

a-對(duì)照；b-堿處理圖1 堿處理對(duì)玉米秸稈固態(tài)厭氧消化中累積 甲烷產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of alkali treatment on the cumulative methane yield in solid-state AD of corn straw

2.2 NaOH預(yù)處理對(duì)玉米秸稈固態(tài)厭氧消化過程中菌群變化的影響

2.2.1 堿處理后厭氧消化過程中門水平菌群結(jié)構(gòu)的變化

初始菌群(即接種污泥)中，變形菌門(Proteobacteria)、廣古菌門(Euryarchaeota)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、螺旋體門(Spirochaetes)、放線菌門(Actinobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)占據(jù)較大優(yōu)勢，且不同門之間的相對(duì)豐度差異較小。在整個(gè)厭氧消化過程中，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和廣古菌門這4個(gè)門微生物的相對(duì)豐度始終占據(jù)主導(dǎo)位置，且豐度明顯高于其他門的微生物(圖3)。

a-對(duì)照；b-堿處理圖2 堿處理對(duì)玉米秸稈固態(tài)厭氧消化中日甲烷產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of alkali treatment on the daily methane yield in solid-state AD of corn straw

L-菌群；S-固態(tài)；A-堿處理；0、1、2、3、10、25-取樣時(shí)間圖3 堿處理玉米秸稈固態(tài)厭氧消化過程中菌群 門水平的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of microbial community during solid-state AD of alkali treated corn straw at phylum level

發(fā)酵開始后，厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度急劇上升至28%和18%；從發(fā)酵第3天起，厚壁菌門和擬桿菌門的豐度有一些下降，然后基本保持穩(wěn)定，維持在17%左右。厚壁菌門和擬桿菌門的微生物在厭氧消化反應(yīng)器中廣泛存在，主要與底物水解和產(chǎn)酸過程相關(guān)。初始菌群中占主導(dǎo)地位的變形菌門和廣古菌門的相對(duì)豐度呈現(xiàn)了相反的規(guī)律，即先下降，后上升并維持穩(wěn)定。發(fā)酵進(jìn)行至第2天，變形菌門和廣古菌門的相對(duì)豐度分別下降至10%和5%；隨后它們的相對(duì)豐度開始上升，基本達(dá)到初始菌群中的水平。

初始菌群中，其他門的微生物數(shù)量較少，并呈現(xiàn)出不同的規(guī)律。Chloroflexi、Aminicenantes、熱袍菌門(Thermotogae)的相對(duì)豐度在整個(gè)消化過程中持續(xù)下降，并最終維持穩(wěn)定，說明這些微生物不適合秸稈為底物的厭氧消化系統(tǒng)；Actinobacteria在消化過程中，數(shù)量波動(dòng)較大；浮霉菌門(Planctomycetes)在消化過程中，數(shù)量基本維持穩(wěn)定；Spirochaetes先是持續(xù)下降，但到發(fā)酵末期有1個(gè)明顯上升。

2.2.2 堿處理與對(duì)照組厭氧消化菌群門水平的結(jié)構(gòu)差異

實(shí)驗(yàn)中比較了堿處理組與對(duì)照組的微生物差異，以觀察堿處理對(duì)菌群變化的影響(圖4)。2個(gè)實(shí)驗(yàn)組微生物菌群的差異主要體現(xiàn)在厚壁菌門和擬桿菌門上。厚壁菌門中有許多高效纖維素降解菌屬[如梭菌屬(Clostridium)]，它在堿處理組LS-A-2和LS-A-10中的豐度(29%和17%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組的LS-2和LS-10(9%和6%)。而Bacteroidetes的情況恰恰相反，它在對(duì)照組中更活躍，在LS-2和LS-10中相對(duì)豐度分別是32%和23%，而在堿處理組LS-A-2和LS-A-10中均為18%。

L-菌群；O-原始菌群；S-固態(tài)；A-堿處理；0、2、10、25-取樣時(shí)間圖4 堿處理與對(duì)照組玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵過程中菌群 在門水平的比較Fig.4 Comparison of microbial community structure during solid-state AD of corn straw in alkali treatment and control group at phylum level

堿處理可以改變相同底物時(shí)厭氧消化系統(tǒng)中微生物在門水平的分布。厚壁菌門和擬桿菌門分別是堿處理組和對(duì)照組中最具優(yōu)勢的微生物。對(duì)照組的微生物呈現(xiàn)出了更好的多樣性。兩組實(shí)驗(yàn)中，數(shù)量最多的微生物門類依次為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和廣古菌門。這與其他以纖維質(zhì)原料為底物(或主要底物)時(shí)的菌群結(jié)構(gòu)相似[13-16]。王旭輝等[13]報(bào)道，玉米秸稈與牛糞聯(lián)合厭氧消化時(shí)，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門是細(xì)菌中最具優(yōu)勢的門類。青格爾等[14]以玉米秸稈為底物，利用不同氮源對(duì)低溫高效降解復(fù)合菌系GF-20進(jìn)行了馴化。經(jīng)過連續(xù)培養(yǎng)10代發(fā)現(xiàn)，變形菌門和擬桿菌門的微生物最具優(yōu)勢。FENG等[15]報(bào)道，玉米秸稈與雞糞聯(lián)合厭氧消化時(shí)，廣古菌門、擬桿菌門、厚壁菌門是優(yōu)勢菌群。這些研究充分說明了厭氧消化底物種類對(duì)微生物菌群結(jié)構(gòu)具有顯著影響。

2.2.3 堿處理后厭氧消化過程中菌群結(jié)構(gòu)屬水平的變化

微生物在門水平上的代謝特性差異較大，因此，在屬水平上對(duì)微生物群落變化進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)中主要鑒定出16個(gè)屬的微生物，結(jié)果如圖5所示。擬桿菌屬(Bacteroides)、Clostridium、甲烷鬃菌屬(Methanosaeta)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Lachnoclostridium是實(shí)驗(yàn)條件下的主要微生物。除Methanosaeta外，其他屬的微生物在消化過程中的豐度變化均十分顯著(圖5)。其中，Bacteroides和Clostridium在消化過程中顯著增加了。

圖5 堿處理玉米秸稈固態(tài)厭氧消化過程中菌群屬水平的 動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of microbial community during solid-state AD of alkali treated corn straw at genus level

第1階段，大部分屬的生物量均顯著增加。在第2天，Bacteroides和Clostridium的相對(duì)豐度分別從5%急劇上升到了17%和11%。Lachnoclostridium和Pseudomonas的豐度分別由0.65%和0.3%上升至2.8%和7%。Methanosaeta變化趨勢較為特殊，發(fā)酵前2 d時(shí)，其相對(duì)豐度從13.5%降到8.7%，然后提升至26%。第2階段時(shí)，厭氧消化菌群在屬水平的組成結(jié)構(gòu)非常接近，其中具備纖維素降解能力的微生物優(yōu)勢明顯。例如，Bacteroides(7%～11%)、Clostridium(約4%)、Methanosaeta(22%～25%)、分支桿菌屬(Mycobacterium)(約5%)和瘤胃梭菌屬(Ruminiclostridium)(約3%)。Mycobacteria豐度變化與Methanosaeta的變化趨勢高度一致。Methanosaeta在所有產(chǎn)甲烷菌中占絕對(duì)優(yōu)勢(約80%)，因此乙酸途徑可能是此厭氧發(fā)酵過程中主要的產(chǎn)烷途徑。第3階段，微生物的總體數(shù)量下降更明顯，豐度仍能保持甚至提高的菌屬主要有Methanosaeta(約18%)，Clostridium(約5%)，Ruminiclostridium(約3%)和Lachnoclostridium(約2%)。除了Methanosaeta其他菌種基本都是具備纖維素降解能力的微生物。研究者對(duì)這些微生物降解纖維素的機(jī)制、關(guān)鍵基因識(shí)別和表達(dá)等方面，均進(jìn)行了深入的研究[16-19]。

2.2.4 堿處理與對(duì)照組厭氧消化菌群屬水平的結(jié)構(gòu)差異

從屬水平看(圖6)，發(fā)酵第2天堿處理組中Clostridium、Lachnoclostridium和Cellulosilyticum等纖維素降解菌的豐度(分別為11%、3%和2%)遠(yuǎn)高于對(duì)照組LS-2(分別為2%、0.4%和0.6%)。產(chǎn)生這種差異的原因可能是堿處理后玉米秸稈中的纖維素更容易被纖維素降解菌降解，進(jìn)而促進(jìn)了纖維素降解菌的生長。第10天時(shí)，對(duì)照組與堿處理組的菌群結(jié)構(gòu)差異縮小。堿處理組中，具備纖維素降解能力的微生物更具備豐度上的優(yōu)勢。另外，Methanosaeta的豐度在2個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的差異被放大了，分別為21.7%(堿處理組)和9.4%(對(duì)照組)，這應(yīng)該是由可利用底物的多寡不同引起的。第25天時(shí)，菌群結(jié)構(gòu)差異進(jìn)一步縮小。在這一階段，能夠利用的底物幾乎被降解完全，堿處理對(duì)底物可降解性的促進(jìn)作用減小。

圖6 堿處理組與對(duì)照組玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵菌群屬水平比較Fig.6 Comparison of microbial community structure during solid-state AD of corn straw in alkali treatment and control group at genus level

初始菌群中共鑒定出16個(gè)屬的微生物。它們的豐度由初始的29%上升至51%～60%，在發(fā)酵末期下降至42%，但仍比初始相對(duì)豐度提高了43%。在厭氧消化過程中，Methanosaeta、Bacteroides、Clostridium均占據(jù)顯著優(yōu)勢。兩組實(shí)驗(yàn)中，能夠利用纖維素的微生物均更具優(yōu)勢，堿預(yù)處理進(jìn)一步強(qiáng)化了這些微生物的優(yōu)勢，這些微生物主要包括Bacteroides、Clostridium、Mycobacterium和Ruminiclostridium。

3 結(jié)論

底物種類可以顯著改變菌群結(jié)構(gòu)。采用玉米秸稈為底物時(shí)，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和廣古菌門均是主要的微生物門類。堿預(yù)處理可以在門水平改變微生物的菌群結(jié)構(gòu)。堿處理組及對(duì)照組中最具優(yōu)勢的微生物門類分別是厚壁菌門和擬桿菌門。從屬水平上看，對(duì)照組鑒定出的各屬的豐度相對(duì)較為平均，呈現(xiàn)出了多樣性；從屬水平看，堿處理后，厭氧消化過程中水解產(chǎn)酸菌和產(chǎn)甲烷菌的相對(duì)豐度都更高，包括Clostridium、Lachnoclostridium、Cellulosilyticum和Methanosaeta。甲烷菌中，Methanosaeta占據(jù)優(yōu)勢，這表明在本研究條件下，乙酸途徑是產(chǎn)甲烷的主要途徑。本文研究表明，在纖維質(zhì)原料預(yù)處理方式選擇上，不應(yīng)只考慮物料本身的理化性質(zhì)，更要從微生物菌群角度進(jìn)行考慮。