閆興敏，姜嬌，高輝，白穩(wěn)紅，王平來，劉延琳,2*

1(西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌，712100)2(西北農(nóng)林科技大學(xué)，寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗示范站，寧夏 永寧，750104) 3(寧夏御馬葡萄酒莊，寧夏 青銅峽，751600)4(寧夏新慧彬葡萄酒莊，寧夏 永寧，750100)

葡萄酒發(fā)酵過程中，酵母承受乙醇毒性、營養(yǎng)缺乏、高糖、滲透壓等多種環(huán)境脅迫的影響[1]。尤其值得注意的是，近年來氣候變暖引起葡萄的含糖量逐年上升[2]。使葡萄酒發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇含量升高，酵母生長受到抑制甚至死亡。因此篩選具有良好乙醇耐性的釀酒酵母能保證發(fā)酵完全，減少發(fā)酵停滯的風(fēng)險[3]。此外，在復(fù)雜的葡萄酒發(fā)酵過程中，一些酵母合成的蛋白質(zhì)或毒素有助于抑制其他不良微生物的生長[4]。篩選嗜殺酵母來防治腐敗酵母，可以提高葡萄酒香氣的純凈度，避免葡萄酒生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)損失[5]。在與葡萄酒香氣有關(guān)的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中，含硫化合物的檢測閾值非常低，會對葡萄酒的感官特性產(chǎn)生較大的影響。高揮發(fā)性的硫化氫濃度超過其感知閾值則具有強(qiáng)烈的還原味，給葡萄酒帶來腐爛雞蛋、大蒜、洋蔥和白菜的粗劣香氣。釀酒師可以選擇低產(chǎn)硫化氫能力的菌株，來調(diào)節(jié)葡萄酒中硫化氫的產(chǎn)量。

發(fā)酵過程中釀酒酵母會產(chǎn)生多種香氣活性物質(zhì)[6]，這些物質(zhì)對于啤酒、葡萄酒和清酒等發(fā)酵飲料的復(fù)雜風(fēng)味至關(guān)重要。酵母在釀造中和其他酵母的競爭、發(fā)酵、自溶等機(jī)制進(jìn)一步?jīng)Q定葡萄酒的香氣成分[7]。在葡萄酒中發(fā)現(xiàn)了幾種類型的揮發(fā)性化合物，如醇類、脂肪族、苯衍生物、羰基、酯類、有機(jī)酸、含硫化合物、多元醇、甲氧基吡嗪、乙烯基和揮發(fā)性酚類等[8]，源自發(fā)酵的揮發(fā)性化合物占葡萄酒總香氣成分的百分比最大。其中乙基酯類物質(zhì)賦予葡萄酒馥郁的水果香氣[9]，在葡萄酒中乙酯含量與葡萄酒評分呈正相關(guān)[10]。

葡萄酒酵母對葡萄酒質(zhì)量有重要影響，篩選優(yōu)良的釀酒酵母菌株也成為改善葡萄酒質(zhì)量的重要方式之一。利用本土釀酒酵母資源，有助于適應(yīng)產(chǎn)區(qū)環(huán)境、釀造具有香氣獨特性的葡萄酒[11]。在實驗室前期工作基礎(chǔ)上，獲得13株不同來源的本土釀酒酵母菌株。本研究對其生理特性和發(fā)酵特性進(jìn)行探究，進(jìn)而對其產(chǎn)香能力進(jìn)行分析，初步篩選得到具有良好香氣特征的本土釀酒酵母。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

前期研究獲得不同來源的本土釀酒酵母菌株13株，由西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院劉延琳教授實驗室保藏。試驗菌株為釀酒酵母XM1、XM2、XM3、XM4、XM5、XM6、XM7、XM8、XM9、XM10、XM11、XM12、XM13和1株商業(yè)對照菌株SY-CK。敏感菌株Saccharomycescerevisiae1296 由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院饋贈。

47種色譜純標(biāo)準(zhǔn)品(φ=98%)，Sigma-Aldrich，如1-己醇、(E)-3-己烯-1-醇、(Z)-3-己烯-1-醇、橙花醇、苯乙醇、乙酸乙酯、辛酸等用于定量。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10，固體培養(yǎng)基中添加瓊脂20。

MS300培養(yǎng)基:配方參考BELY等[12]的方法，將其含糖調(diào)整為250 g/L，其中葡萄糖與果糖的質(zhì)量比為1∶1。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)，Thermofisher；恒溫?fù)u床，上海福馬實驗設(shè)備有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ES-1000HA電子天平，長沙湘平科技發(fā)展有限公司；高壓滅菌鍋；ELX800酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；安捷倫GC7890B氣相色譜儀、Agilent 5977B氣質(zhì)聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母種子液的制備

將保存在-80 ℃的本土釀酒酵母菌株劃線培養(yǎng)2～3 d。挑取單菌落分別接種于含有30 mL篩選培養(yǎng)基的錐形瓶，置于150 r/min，28 ℃搖床活化24 h。

1.3.2 本土釀酒酵母的酒精耐受性

在YPD中加入不同體積分?jǐn)?shù)的酒精進(jìn)行酵母培養(yǎng)，測定細(xì)胞懸浮液吸光度(OD600)：以10%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇起始，3%遞增，最大為16%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇。

1.3.3 本土釀酒酵母的嗜殺性

酵母嗜殺性的測定參照DE ULLIVARRI等[13]的方法。

1.3.4 本土釀酒酵母的產(chǎn)硫化氫特性

將22 g BIGGY 瓊脂培養(yǎng)基溶于500 mL無菌水中，煮沸約45～60 s滅菌。將活化后的菌液點樣于BIGGY培養(yǎng)基，將接種后的BIGGY培養(yǎng)皿置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，觀察菌落顏色。

1.3.5 菌株生長曲線測定

將-20 ℃保存的菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下，活化24 h。取活化好的菌液按1×106cells/mL的接種量接種于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣1 mL，使用酶標(biāo)儀在600 nm處測定菌懸液的吸光度OD600，以無菌YPD為對照。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3.6 模擬發(fā)酵

取-20 ℃甘油保藏菌液劃線于YPD固體培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)2 d，挑取單菌落于裝有50 mL模擬汁的錐形瓶中，28 ℃，150 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h。

模擬發(fā)酵：配制模擬葡萄汁，對模擬汁進(jìn)行無菌處理。將酵母種子液以1×106cells/mL的接種量接種于裝有300 mL模擬汁的錐形瓶中，25 ℃靜置培養(yǎng)。發(fā)酵過程中通過檢測還原糖監(jiān)控發(fā)酵過程，連續(xù)3 d糖含量不變視為發(fā)酵結(jié)束。每組重復(fù)3次。發(fā)酵結(jié)束后，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定殘?zhí)?、總酸和揮發(fā)酸，用密度瓶法測定酒精度。

1.3.7 香氣測定

固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)與GC-MS結(jié)合用于鑒定和定量主要揮發(fā)物，參照LAN等[14]的方法。通過自動化的頂空固相微萃取提取葡萄酒樣品中的揮發(fā)性化合物，并使用氣相色譜/質(zhì)譜法進(jìn)行分析。將5 mL葡萄酒樣品和1 g NaCl放入20 mL樣品瓶中。將樣品瓶用PTFE-硅隔墊蓋緊，在加熱平臺上以400 r/min的轉(zhuǎn)速在40 ℃下平衡30 min。將50/30 μm DVB/CAR/PDMS在40 ℃，250 r/min轉(zhuǎn)速下吸附30 min。隨后將萃取頭在GC進(jìn)樣器中解吸8 min，固相微萃取自動進(jìn)樣采用不分流模式。質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式EI，離子能源70 eV，質(zhì)量掃描范圍為29～350 u，GC循環(huán)時間67 min。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，方差分析采用Duncan檢驗法，每組實驗3個重復(fù)。采用Graphpad Prism 7.0軟件進(jìn)行繪圖，Origin 2021進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精耐性

如圖1所示，在14株釀酒酵母中，菌株XM1、XM10、XM5、XM12均在酒精體積分?jǐn)?shù)為10%和13%時具有顯著較高的OD600值，其中體積分?jǐn)?shù)為13%時，XM10具有較高的酒精耐性，XM8具有較弱的酒精耐性(OD600值<0.5)。在體積分?jǐn)?shù)為16%時釀酒酵母的OD600值均<0.25，酵母在培養(yǎng)基中微量生長或不生長[15]，即14株釀酒酵母均無耐受16%體積分?jǐn)?shù)酒度的能力。高濃度的酒精引起酵母細(xì)胞膜流動性的增加[16]，減少酵母葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和抑制酵母生長[17]。在葡萄酒釀造中選擇酒精耐性良好的釀酒酵母，有助于酵母對糖的完全利用和葡萄酒的發(fā)酵徹底。

圖1 不同酒精度對酵母生長的影響Fig.1 The influence of alcohol on yeast growth 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 嗜殺性

如圖2所示，在添加次甲基藍(lán)的培養(yǎng)基中觀察本土酵母對敏感菌株1296的嗜殺能力，藍(lán)色抑菌圈直徑越大則菌株的嗜殺能力越強(qiáng)。在14株釀酒酵母中，7株菌株具有嗜殺性。其中菌株XM12、XM11、XM10、XM1、XM8、XM3和XM5對于敏感菌株1296的嗜殺性較強(qiáng)，菌株XM8和XM3的嗜殺性較弱。一些具有嗜殺能力的酵母能分泌細(xì)胞外蛋白或糖蛋白，抑制其他敏感酵母和真菌的活性[18]。在釀酒工業(yè)中使用嗜殺酵母，可以減少腐敗微生物對葡萄酒的負(fù)面影響[19]，保證葡萄酒發(fā)酵風(fēng)味的純凈。

圖2 不同釀酒酵母對敏感菌株1296的嗜殺能力Fig.2 The killer activity of S.cerevisiae strains against a sensitive strain 1296

2.3 產(chǎn)H2S能力

BD BIGGY瓊脂培養(yǎng)基可以測試酵母產(chǎn)H2S的能力，菌落顏色越深則H2S產(chǎn)量越高，菌落顏色為白色則不產(chǎn)H2S。如圖3所示，SY-CK、XM12、XM2、XM13、XM5(淺棕色)是低產(chǎn)硫化氫菌株，XM4、XM8、XM7、XM6、XM9、XM3、XM11是高產(chǎn)硫化氫菌株(深棕色)，XM10、XM1是不產(chǎn)硫化氫菌株(白色)。葡萄酒釀造過程中，釀酒酵母主要通過硫酸鹽還原途徑產(chǎn)生H2S，葡萄汁中元素硫的高水平殘留、二氧化硫和有機(jī)硫化合物的存在都會影響H2S的產(chǎn)量[20]。葡萄酒中H2S含量的增加帶來還原味和腐爛臭雞蛋的味道，降低葡萄酒的感官質(zhì)量[21]。

2.4 生長曲線

測定酵母生長曲線可以掌握酵母生長繁殖的規(guī)律，為酵母的培養(yǎng)時間和發(fā)酵所需的接種數(shù)量提供依據(jù)。如圖4所示，14株釀酒酵母在6 h進(jìn)入指數(shù)生長期，在14 h進(jìn)入生長穩(wěn)定期。其中XM12在穩(wěn)定期的OD600值高于其他菌株，SY-CK在穩(wěn)定期的OD600值低于其他菌株。

圖4 釀酒酵母生長曲線Fig.4 Growth curve of S.cerevisiae strains

2.5 發(fā)酵速率

對模擬發(fā)酵過程中的酵母生長量進(jìn)行測定，如圖5所示，菌株在第1天～第5天為指數(shù)生長期，在第7天進(jìn)入生長穩(wěn)定期。其中XM3在發(fā)酵前3 d OD600值增長較慢，在3 d后OD600值逐漸上升到3.4左右。14株菌株進(jìn)入生長穩(wěn)定期后，XM11的OD600相對較高為3.5左右；XM5、SY-CK、XM12的OD600值進(jìn)入穩(wěn)定期后相對較低在3.0以下。14株酵母發(fā)酵液的含糖量均在前7 d的發(fā)酵中快速下降。前7 d的發(fā)酵中，XM11發(fā)酵液的含糖量相對降低較快，XM3發(fā)酵液的含糖量相對降低較慢。XM3與XM11菌株消耗的糖含量與發(fā)酵過程中的菌株生物量變化相關(guān)聯(lián)，最終在發(fā)酵完全所需的時間相同。其中，XM4菌株對含糖量發(fā)酵完全所需的時間最長，表現(xiàn)為發(fā)酵緩慢。

發(fā)酵液的基本理化指標(biāo)見表1，XM12發(fā)酵產(chǎn)生的酒度最高為12.59%(體積分?jǐn)?shù))，其他菌株發(fā)酵產(chǎn)生的酒度在11%～12.4%(體積分?jǐn)?shù))。14株菌株中，XM3產(chǎn)生的總酸含量顯著較高，XM2、XM6和XM9產(chǎn)生的總酸含量較低。葡萄酒的揮發(fā)酸含量反應(yīng)葡萄酒的健康程度，14株酵母產(chǎn)生的揮發(fā)酸含量都在0.60 g/L以下，符合葡萄酒生產(chǎn)的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

a-OD值；b-含糖量圖5 酵母發(fā)酵過程的OD值、含糖量變化Fig.5 Changes of OD value and sugar content during fermentation

表1 基本理化指標(biāo)分析Table 1 Basic physiochemical parameters in wine samples

2.6 香氣測定

對揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行SPME-GC-MS分析，檢測出47種揮發(fā)性化合物。包括乙酸酯4種，乙酯類8種，其他酯類4種，脂肪酸5種，高級醇8種，C6醇4種，苯乙基2種等，這些揮發(fā)性化合物對葡萄酒香氣具有主要貢獻(xiàn)。主要是香氣成分分析如圖6所示。

a-乙酸酯；b-乙基酯；c-其他酯；d-C6醇；e-高級醇；f-脂肪酸圖6 主要香氣成分分析Fig.6 Analysis of main volatile compounds

乙酸酯由乙酸和醇基(乙醇或氨基酸代謝衍生的復(fù)合醇)組成，在發(fā)酵過程中由微生物產(chǎn)生的酯酶和脂肪酶催化而成[22]，包括乙酸乙酯(菠蘿)、乙酸異丁酯(溶劑)、乙酸異戊酯(香蕉)、乙酸己酯(柑橘)等。乙酸乙酯是葡萄酒中含量最豐富的酯，是影響葡萄酒香氣的重要因素[23]。14株酵母產(chǎn)生的乙酸乙酯含量均低于80 mg/L，給模擬酒帶來水果香氣。XM1、XM12產(chǎn)生的乙酸酯含量最高，主要由于其產(chǎn)生的乙酸乙酯含量最高。在這些乙酸酯化合物中，14株酵母產(chǎn)生的乙酸異丁酯含量均小于感官閾值，不會帶來負(fù)面的溶劑味道。乙酸異戊酯能明顯提升白葡萄酒的香氣質(zhì)量[24]，14株菌株乙酸異戊酯含量均超過閾值，給模擬酒帶來香蕉香氣。乙酸己酯是酵母發(fā)酵的產(chǎn)物，與紅色漿果香氣有關(guān)[25]，酵母產(chǎn)生的乙酸己酯含量都沒有超過感官閾值。SY-CK、XM13產(chǎn)生的乙酸酯含量相對較高，而XM8、XM4和XM6產(chǎn)生的乙酸酯含量最少。

乙基酯由醇基(乙醇)和酸基組成，包括己酸乙酯(水果)、辛酸乙酯(橙子)、癸酸乙酯(水果)和丁酸乙酯(水果)等。在葡萄酒中乙基酯與果香和花香有關(guān)[26]，在評價體系中具有高酯的葡萄酒均獲得高分[10]。盡管酯的含量很少，相對于高級醇而言，揮發(fā)性酯對葡萄酒香氣的影響更大。XM1和XM4產(chǎn)生的乙基酯含量最高，XM1產(chǎn)生顯著較高的丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯和癸酸乙酯，XM4則主要由月桂酸乙酯、乳酸乙酯和癸酸乙酯引起較高的乙基酯含量。XM8、XM10產(chǎn)生的乙基酯含量最低，其他菌株產(chǎn)生的乙基酯含量相近。大多數(shù)酵母產(chǎn)生的己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯超過其香氣閾值，貢獻(xiàn)樹木果實的香氣[27]。

XM3產(chǎn)生的丁二酸二乙酯(具有花香、果香和薰衣草香氣)含量高于其他菌株含量的5倍以上，使其他酯的含量顯著升高；XM2和XM11產(chǎn)生的其他酯含量最低。C6醇具有植物、草本類的香氣，包括正己醇(花香)、Z-3-己烯-1-醇(青草)、E-3-己烯-1-醇(青草)、E-2-已烯-1-醇(花香)等。XM4的C6醇含量最高，主要由于產(chǎn)生較高的E-2-已烯-1-醇含量，XM1、XM3、SY-CK、XM13的C6醇含量最低。14株菌株產(chǎn)生的E-2-已烯-1-醇均高于其感官閾值，給模擬酒帶來花香香氣。

高級醇包括脂肪醇和芳香醇，主要包括異丁醇、苯乙醇和異戊醇等。在白葡萄酒中高級醇的總質(zhì)量濃度在0.2～1.2 g/L，在紅葡萄酒中總質(zhì)量濃度為0.4～1.4 g/L[28]，低于0.3 g/L會增加葡萄酒的果香和花香，而高于0.4 g/L的高級醇則會給葡萄酒帶來不良風(fēng)味[29]。在14株酵母都能產(chǎn)生少于0.3 g/L的高級醇，給葡萄酒香氣帶來正面影響。XM3產(chǎn)生的高級醇含量最多，主要由比其他菌株高2倍以上的異丁醇含量和顯著較高的丙醇含量產(chǎn)生，XM5、XM12、SY-CK、XM10產(chǎn)生的高級醇含量最少。少量的脂肪酸對香氣有積極作用，過多的脂肪酸含量產(chǎn)生令人不愉快的脂肪、奶酪香氣[30]。XM5產(chǎn)生的總脂肪酸含量最高，主要由于其異丁酸產(chǎn)量較高，XM8、XM9、XM10、XM11、XM13產(chǎn)生的脂肪酸含量最少。

揮發(fā)性化合物的香氣活力值(odor activity value，OAV)是每種化合物的含量與其檢測閾值濃度的比率，對47種物質(zhì)中OAV值>1的揮發(fā)性化合物計算平均值并進(jìn)行主成分分析。主成分分析解釋了前2個主成分(principal components，PC)的總方差為69.3%，PC1的比例為52.6%，PC2的比例為16.7%。由圖7可知，XM2位于第一象限，成分包括異戊醇、乙酸乙酯、E-2-已烯-1-醇、β-紫羅蘭酮、苯乙醇、辛酸乙酯等，對葡萄酒香氣質(zhì)量有積極作用。XM3、XM6、XM7、XM13和SY-CK位于第二象限，與異丁醇有關(guān)。XM1、XM4、XM5和XM12位于第四象限，與己酸乙酯、異丁酸、己酸、辛酸有關(guān)。XM9和XM10在則在PC1負(fù)半軸得分較高。

a-菌株；b-香氣成分圖7 香氣成分主成分分析Fig.7 Principal component analysis of main volatile compounds

3 結(jié)論與討論

使用本土來源的釀酒酵母有助于獲得良好的釀造學(xué)結(jié)果，以13株本土釀酒酵母為研究對象，進(jìn)行酵母的生理特性和發(fā)酵特性探究。獲得XM10在乙醇的體積分?jǐn)?shù)為13%時具有顯著性酒精耐受性，以及具有嗜殺性和不產(chǎn)H2S特性?？梢院Y選用于高酒度葡萄酒的釀造，促進(jìn)葡萄酒生產(chǎn)中酵母對糖的完全利用，以應(yīng)對全球氣候變暖使葡萄含糖量升高帶來的挑戰(zhàn)。XM12具有良好的酒精耐受性、嗜殺性和低產(chǎn)H2S特性，有助于葡萄酒發(fā)酵完全和減少低劣風(fēng)味。發(fā)酵過程中XM4發(fā)酵完全所需的時間最長，不利于葡萄酒生產(chǎn)。XM11在發(fā)酵前期含糖量降低最快，在發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期后OD值最高。XM3在發(fā)酵前期含糖量降低最慢，OD值相對較低，發(fā)酵后期含糖量降低變快并最終能在13 d發(fā)酵完全，可以根據(jù)其不同發(fā)酵階段的釀造學(xué)表現(xiàn)選擇合適的釀造工藝。

發(fā)酵液共檢測出47種香氣成分，其中XM1和XM4的乙基酯產(chǎn)量最高。XM4的乙基酯和C6醇含量相對較高，C6醇賦予葡萄酒草本香氣。主成分分析表明XM1位于第四象限，與己酸乙酯、異丁酸、己酸、辛酸等化合物有關(guān)。乙酯類會增加葡萄酒的水果香氣，脂肪酸的產(chǎn)量和酯類含量的互作有待進(jìn)一步探究。XM3位于第二象限，與異丁醇有關(guān)。初步篩選XM1為酯類物質(zhì)產(chǎn)量較高的產(chǎn)酯酵母，XM3產(chǎn)生的其他酯和高級醇含量較高，其分子機(jī)理有待進(jìn)一步探究。XM12具有良好的生理特性和產(chǎn)酯能力，有助于促進(jìn)葡萄酒的風(fēng)味純凈和提高葡萄酒品質(zhì)。