唐學(xué)超，魏春，袁圍，孫杰

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)

萜類化合物(terpenoids)廣泛存在于微生物、真菌、高等植物以及昆蟲中，結(jié)構(gòu)多樣，總數(shù)超過50 000種。橙花叔醇(nerolidol)為一種倍半萜，是香料和精油中的重要成分[1]，常見于紫丁香型、薔薇香型等各種類型的花香氣息，常作為香精香料應(yīng)用于生活日化品和高檔香水中。橙花叔醇在醫(yī)學(xué)方面有一定的功效，有抑制細(xì)菌活性和體外的抗真菌作用，還具有良好的抗病毒能力[2-3]，它是維生素K1與維生素E、α-甜橙醇(柑橘清香，如甜橙醬)的重要前體[4]，同時(shí)也是治療消化性潰瘍藥物替普瑞酮的中間體[5]。

釀酒酵母的甲羥戊酸途徑的主要終端產(chǎn)物中，麥角甾醇占比較大，這使得釀酒酵母具備了合成多種萜類化合物的廣闊發(fā)展空間，因而被廣泛地作為合成異源萜類化合物的底盤細(xì)胞[6]。研究者通過將獼猴桃的橙花叔醇合酶基因與法尼烯合酶融合表達(dá)，轉(zhuǎn)入改造后的釀酒酵母中，橙花叔醇發(fā)酵罐產(chǎn)量達(dá)到1.71 g/L[7]。PENG等[8]增強(qiáng)釀酒酵母甲羥戊酸途徑的代謝流，使得橙花叔醇搖瓶產(chǎn)量達(dá)到392 mg/L，并在碳源優(yōu)化后進(jìn)行上罐發(fā)酵得到5.5 g/L的產(chǎn)量。LI等[9]克隆了來自于苦皮藤的橙花叔醇合成酶，橙花叔醇搖瓶產(chǎn)量740.13 mg/L，發(fā)酵罐產(chǎn)量達(dá)到7.01 g/L。

工程酵母菌發(fā)酵過程中因氧化脅迫、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊等壓力致使生產(chǎn)能力降低。生物產(chǎn)品的合成過程中，維持細(xì)胞的功能穩(wěn)定性和動(dòng)態(tài)穩(wěn)態(tài)，對(duì)提高產(chǎn)物合成效率具有重要意義[10]。萜類化合物破壞釀酒酵母體內(nèi)的氧化還原平衡，造成活性氧(reactive oxygen species，ROS)積累，誘發(fā)氧脅迫，同時(shí)如法尼基焦磷酸等萜類代謝的中間產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞均有毒性，使得細(xì)胞的魯棒性降低[11-12]。本研究在甲羥戊酸途徑增強(qiáng)的酵母工程菌中，表達(dá)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2，BCL-2)和谷胱甘肽合成酶(glutathione synthase，GSH1)，觀察它們對(duì)橙花叔醇合成的影響，并進(jìn)一步在代謝水平探討B(tài)CL-2促進(jìn)酵母合成橙花叔醇的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

用于進(jìn)行基因克隆的DH5α大腸桿菌、合成來源于人的BCL-2(Genbank NP_000624.2)并按釀酒酵母密碼子優(yōu)化，杭州擎科生物科技有限公司；釀酒酵母YS036、YS037和pRS316質(zhì)粒，本實(shí)驗(yàn)室保藏；GSH1(Genbank NP_012434.1)擴(kuò)增于本實(shí)驗(yàn)室保藏的酵母CEN.PK2-1D菌株的基因組DNA。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、氯化鈉10、酵母抽提物5，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.5。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母抽提物10。

YND培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、硫酸銨5、YNB 1.7。

YNS培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖20、硫酸銨5、YNB 1.7。

配制上述培養(yǎng)基相應(yīng)的固體培養(yǎng)基時(shí)另加20 g/L的瓊脂粉。

高純度質(zhì)粒小提試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA片段回收純化試劑盒，擎科生物公司；連接試劑盒無縫克隆試劑盒，全式金公司；高保真酶，寶生物公司產(chǎn)品；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

測(cè)定橙花叔醇的氣相色譜為GC 7890A、氣相柱為HP-5(30 m×0.25 μm,0.25 μm)，美國安捷倫；代謝組測(cè)定使用的超高壓液相色譜ExionLC和Triple TOF5600 plus質(zhì)譜儀，英國SCIEX公司；液相色譜柱為ACQUITY UPLC T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),英國Waters。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 過表達(dá)BCL-2和GSH1基因的菌株的構(gòu)建

利用附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20210702.1642.007.html)中的pRS316-F引物和pRS316-R引物，以pRS316質(zhì)粒為模板擴(kuò)增表達(dá)載體的質(zhì)粒骨架；使用上游引物TDH3-F和連接不同外源基因同源臂的下游引物TDH3-BCL2-R、TDH3-HSP104-R，擴(kuò)增源于釀酒酵母CEN.PK2-1D基因組上的組成型啟動(dòng)子TDH3；使用下游引物L(fēng)eu2-R和連接不同外源基因的同源臂的上游引物L(fēng)eu2-BCL2-F、Leu2-HSP104-F，以實(shí)驗(yàn)室保存的YEp181質(zhì)粒為模板擴(kuò)增LEU2基因用作篩選標(biāo)記；利用上游引物BCL2-F和下游引物BCL2-R以公司合成的BCL-2基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增BCL-2；利用上游引物GSH1-F和下游引物GSH1-R以釀酒酵母基因組為模板對(duì)GSH1進(jìn)行擴(kuò)增。菌株YS037為菌株YS036轉(zhuǎn)入橙花叔醇合成酶表達(dá)質(zhì)粒pYES2-A1構(gòu)建而來[13]。通過overlap-PCR融合構(gòu)建表達(dá)BCL-2和GSH1基因的表達(dá)盒[14]。將以pRS316為模板構(gòu)建的表達(dá)載體骨架和外源基因表達(dá)盒同時(shí)轉(zhuǎn)入菌株YS037中，形成完整質(zhì)粒，得到菌株YS039和YS045。

1.3.2 釀酒酵母培養(yǎng)條件

將構(gòu)建的釀酒酵母工程菌接種至YNS液體培養(yǎng)基中，于搖床中30 ℃，200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)得種子液。接入27 mL的YNS液體培養(yǎng)基中，接種量為2%，于30 ℃，200 r/min搖床中振蕩發(fā)酵培養(yǎng)96 h。于發(fā)酵24 h后加入3 mL十二烷用于萃取產(chǎn)物，發(fā)酵96 h后取發(fā)酵液離心后的有機(jī)相進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 橙花叔醇的測(cè)定

將離心發(fā)酵液所得十二烷有機(jī)相進(jìn)行氣相分析，進(jìn)樣量設(shè)定為1 μL，載氣為氮?dú)?，設(shè)置流量為1 mL/min，以1∶10分流比進(jìn)行分流，60 ℃保持5 min后，以10 ℃/min的升溫速率升至280 ℃。

1.3.4 代謝組學(xué)分析

取培養(yǎng)96 h的菌體0.1 g，進(jìn)行離心和使用液氮于坩堝中研磨。在樣品中加入50%甲醇120 μL，將其充分混勻并振蕩，進(jìn)行離心20 min，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min。上清液為所需的代謝物，將上清液置于-80 ℃的超低溫冰箱中備用。

樣品的液相測(cè)定條件為柱溫35 ℃，流速0.4 mL/min，A和B流動(dòng)相分別為水和乙腈，A和B流動(dòng)相中均含有1%的甲酸。液相梯度設(shè)置為0～0.5 min：5% B；0.5～7 min：5%～100% B；7～8 min：100% B；8～8.1 min：100%～5% B；8.1～10 min：5% B。采取高分辨率的Triple TOF5 600 plus質(zhì)譜儀進(jìn)行樣品檢測(cè)，質(zhì)譜儀參數(shù)如表1所示。將一級(jí)圖譜中信號(hào)積累太信號(hào)離子進(jìn)行二級(jí)碎裂掃描。

表1 樣品檢測(cè)質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)定Table 1 Sample detection mass spectrometer parameter setting

將得到的氣質(zhì)MS數(shù)據(jù)用XCMS軟件進(jìn)行選擇、分組和校準(zhǔn)保留時(shí)間。使用KEGG、HMDB這些在線數(shù)據(jù)庫的分子質(zhì)量數(shù)據(jù)與上述采集的分子質(zhì)量數(shù)據(jù)(m/z)進(jìn)行匹配分析，對(duì)代謝物說明注釋。有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)通過使用metaX來實(shí)現(xiàn)，區(qū)分組之間的不同變量，計(jì)算出每個(gè)代謝物的變量重要性投影值(variable important in projection，VIP)，篩選出>2倍差異、P<0.05、VIP>1的代謝物為顯著差異代謝物。

1.3.5 表達(dá)連接不同細(xì)胞器定位信號(hào)肽BCL-2的菌株構(gòu)建

BCL-2蛋白羧基末端氨基酸序列為KTLLSLALVGACITLGAYLGHK，利用引物對(duì)mBCL2-F/mBCL2-R以構(gòu)建好的BCL-2-pRS316質(zhì)粒為模板，連接定位信號(hào)肽將上述羧基末端氨基酸序列替換為ILATVAATGTAI，得到將BCL-2蛋白定位于線粒體膜的表達(dá)載體[15]；利用引物對(duì)nBCL2-F/nBCL2-R以構(gòu)建好的BCL-2-pRS316質(zhì)粒為模板，連接定位信號(hào)肽將上述羧基末端氨基酸序列替換為PKKKRKV，得到將BCL-2蛋白定位于核膜的表達(dá)載體[16]；利用引物對(duì)ER-BCL2-1b/ER-BCL2-2和ER-BCL2-3/ER-BCL2-4b通過over lap-PCR合成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)肽[13]，再用引物對(duì)ER-BCL2-F/ER-BCL2-R以構(gòu)建好的BCL-2-pRS316質(zhì)粒為模板,連接定位信號(hào)肽將上述羧基末端氨基酸序列替換為GSGTLVVILAILMLGVAYYLLNE，并用連接試劑盒與載體骨架進(jìn)行連接，得到將BCL-2蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表達(dá)載體[17]；對(duì)于截短BCL-2蛋白的表達(dá)載體，直接利用引物對(duì)tBCL2-F/tBCL2-R以構(gòu)建好的BCL-2-pRS316質(zhì)粒為模板擴(kuò)增，得到BCL-2蛋白羧基末端氨基酸序列缺失后變?yōu)镾WLSLN的BCL-2蛋白表達(dá)載體[16]。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入出發(fā)菌株YS036中得到對(duì)應(yīng)的表達(dá)菌株。所使用引物見附表2(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20210702.1642.007.html)。本研究涉及所有菌株見表2。

表2 本研究涉及到的菌株Table 2 Saccharomyces cerevisiae strains used in this reserch

2 結(jié)果與分析

2.1 BCL-2和GSH1表達(dá)對(duì)酵母工程菌合成橙花叔醇的影響

BCL-2是一種來自于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的抗凋亡蛋白，釀酒酵母中并不存在BCL-2的同源序列，但其在釀酒酵母中表達(dá)后具有一定生理活性，例如，通過減少ROS的生成抑制細(xì)胞凋亡，使得釀酒酵母超氧化物歧化酶缺失菌株的生存效率提高[18]。GSH1是編碼最常見的非酶系抗氧化物谷胱甘肽的2種同工酶之一，通過控制自由基的生成，在保護(hù)細(xì)胞膜和維持氧化還原穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[19]。在上述研究中，BCL-2和GSH1等基因在酵母體內(nèi)高表達(dá)使得釀酒酵母緩解環(huán)境和異源表達(dá)產(chǎn)生的氧化壓力，因此我們推測(cè)這2種蛋白的表達(dá)可能促進(jìn)工程酵母橙花叔醇的合成。

將構(gòu)建好的工程菌接種于YNS培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵96 h，對(duì)發(fā)酵液處理后測(cè)定橙花叔醇的產(chǎn)量，如圖1所示。在發(fā)酵96 h后，相對(duì)于菌株YS037(336.5 mg/L)而言，菌株YS039和YS045的產(chǎn)量分別提高了77.7%和32.7%，達(dá)到594.1、446.9 mg/L。因此，過表達(dá)BCL-2和GSH1的菌株橙花叔醇的合成起到了促進(jìn)作用。在大部分哺乳動(dòng)物的細(xì)胞體內(nèi)，在連續(xù)不斷的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力下，未折疊蛋白應(yīng)激反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)通過促凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯后調(diào)控，引發(fā)細(xì)胞凋亡。來源于人的細(xì)胞凋亡調(diào)控因子BCL-2與細(xì)胞凋亡、UPR、細(xì)胞自噬和Ca2+平衡的信號(hào)途徑均有聯(lián)系，是壓力信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其與癌癥的發(fā)生也有密切關(guān)系[20-21]。BCL-2蛋白家族可以細(xì)分為2大類，一類為促凋亡亞家族，另一類為抗凋亡亞家族。其中，促凋亡蛋白Bax通過直接激活UPR，使得HAC1的mRNA被剪切；同時(shí)GCN4、DER1和KAR2等UPR的靶基因也可以被Bax蛋白誘導(dǎo)表達(dá)[22]。而第二類抗凋亡蛋白BCL-2與BCL-XL能夠與第一類促凋亡蛋白Bax進(jìn)行結(jié)合，來減弱Bax在促凋亡中的活性，同時(shí)改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的壓力，但其調(diào)節(jié)機(jī)理仍未明確[22-23]。在釀酒酵母中，有2種平衡胞內(nèi)氧化還原的系統(tǒng)，分別為含抗氧化酶的系統(tǒng)和非酶的保護(hù)系統(tǒng)。增強(qiáng)編碼谷胱甘肽的同工酶GSH1的表達(dá)強(qiáng)度，使得還原型谷胱甘肽通過氧化作用生成氧化型谷胱甘肽并控制自由基的生成，保護(hù)細(xì)胞膜和維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而在一定程度上減弱ROS的積累，提高菌株活力。因?yàn)锽CL-2對(duì)酵母合成橙花叔醇的促進(jìn)作用比GSH1更強(qiáng)，因此后面的研究以表達(dá)BCL-2的工程酵母菌株作為研究對(duì)象。

圖1 BCL-2和GSH1表達(dá)對(duì)酵母工程菌合成 橙花叔醇的影響Fig.1 Effects of BCL-2 and GSH1 expression on nerolidol production in engineered yeast 注：以YS037菌株產(chǎn)量為對(duì)照進(jìn)行分析，誤差線表示3次平行 測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05，**表示P<0.01(下同)

2.2 表達(dá)BCL-2蛋白和不表達(dá)BCL-2蛋白工程菌的代謝組學(xué)研究

YS037和YS039發(fā)酵96 h的細(xì)胞進(jìn)行代謝物提取和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定后，進(jìn)行主成分分析(principal components analysis，PCA)，各個(gè)樣品依據(jù)重新組合后的變量都可以進(jìn)行正確的分組，2種工程菌株導(dǎo)致的63.5%的樣品數(shù)據(jù)差異見圖2-a。為了對(duì)差異代謝物進(jìn)行確定，使用PLS-DA模型對(duì)樣品進(jìn)一步進(jìn)行分類(圖2-b)，建立其PLS-DA模型。對(duì)于表達(dá)BCL-2蛋白(YS039)和不表達(dá)BCL-2蛋白(YS037)的樣品組的PLS-DA模型，R2=0.999，Q2= 0.991，說明PLS-DA模型構(gòu)建成功。滿足VIP>1且P<0.05的代謝物定義為差異代謝物。基于PLS-DA的結(jié)果，工程菌株YS037和YS039的差異代謝物一共有182種。

差異代謝物途徑富集分析如圖3所示，表明BCL-2蛋白的表達(dá)主要影響了半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、色氨酸等氨基酸的代謝途徑、α-亞麻酸和亞油酸等脂肪酸代謝途徑以及泛酸和輔酶A的生物合成途徑等。與未表達(dá)BCL-2蛋白的菌株相比，富集于氨基酸代謝途徑的差異代謝物主要為下調(diào)的代謝物。下調(diào)氨基酸的代謝是否可以促進(jìn)酵母工程菌中萜類化合物的合成仍未被完全證實(shí)。我們推測(cè)，胞內(nèi)氨基酸含量的下調(diào)可能是由于前體羧酸的轉(zhuǎn)化受到抑制，而調(diào)節(jié)羧酸轉(zhuǎn)化也許是提高萜烯生物合成的一個(gè)策略。富集于谷胱甘肽、α-亞麻酸和亞油酸的代謝途徑以及泛酸和輔酶A的生物合成途徑的差異代謝物多為上調(diào)的代謝物。谷胱甘肽作為一種非酶系抗氧化物，其代謝的上調(diào)可以起到抗氧化的作用對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)。而不飽和長鏈脂肪酸中的亞麻酸和亞油酸則對(duì)釀酒酵母的生長繁殖和抗逆性的提高有顯著促進(jìn)作用。泛酸和輔酶A的合成的上調(diào)則可以提高甲羥戊酸途徑前體乙酰輔酶A的合成，并進(jìn)一步增加釀酒酵母合成萜烯的能力。對(duì)于差異代謝物途徑富集的分析在代謝水平基本解釋了BCL-2蛋白對(duì)釀酒酵母產(chǎn)萜類能力的促進(jìn)作用的機(jī)制，為進(jìn)一步提高萜類在工程酵母菌中的產(chǎn)量提供了理論依據(jù)。

a-所有樣品的PCA;b-所有樣品的PLS-DA圖2 菌株YS037和YS039的代謝物組成差異分析Fig.2 Differential analysis of metabolite composition of strains YS037 and YS039

2.3 連接不同定位信號(hào)肽的BCL-2蛋白對(duì)內(nèi)源性橙花叔醇合成的影響

哺乳動(dòng)物BCL-2一般分布于細(xì)胞的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜中，在細(xì)胞質(zhì)中含量較低[16]。釀酒酵母自身可以合成少量的法尼醇和橙花叔醇[24]。為進(jìn)一步探究BCL-2蛋白定位于不同細(xì)胞器表達(dá)時(shí)，對(duì)橙花叔醇產(chǎn)量的影響，將線粒體內(nèi)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜的定位信號(hào)肽連接BCL-2蛋白，觀察其對(duì)內(nèi)源性萜類化合物產(chǎn)量的影響。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)搖瓶培養(yǎng)不控制pH時(shí)，酵母可以合成的內(nèi)源性萜類以橙花叔醇為主。以未連接定位信號(hào)肽的BCL-2蛋白的菌株(TXC25)相比，BCL-2連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)肽(TXC21)、線粒體內(nèi)膜定位信號(hào)肽(TXC22)、核定位信號(hào)肽(TXC23)和羧基端截短的BCL-2蛋白(TXC24)，內(nèi)源性的橙花叔醇產(chǎn)量分別提高了30%、2.8%、2%和5.2%(圖4)。

圖3 YS039與YS037差異代謝物代謝途徑富集Fig.3 Pathway enrichment of differential metabolites by YS037 versus YS039

圖4 BCL-2蛋白連接不同細(xì)胞器定位信號(hào)肽對(duì) 酵母內(nèi)源性橙花叔醇合成的影響Fig.4 Effects of different organelle localization signal peptides linked to Bcl-2 protein on endogenous nerolidol synthesis in yeast 注：以TXC25菌株產(chǎn)量為對(duì)照進(jìn)行分析

之后在菌株TXC21中轉(zhuǎn)入帶有橙花叔醇合成酶基因的質(zhì)粒pYES2-A1，對(duì)比菌株YS039橙花叔醇產(chǎn)量提高了29.2%，達(dá)到767.6 mg/L。這可能與BCL-2 蛋白抑制細(xì)胞自噬的作用機(jī)制有關(guān)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BCL-2蛋白降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+穩(wěn)態(tài)水平，進(jìn)而誘導(dǎo)一系列調(diào)控機(jī)制來抑制細(xì)胞自噬，提高細(xì)胞活力[25]。然而本研究中定位信號(hào)肽是否將BCL-2蛋白定位至目標(biāo)細(xì)胞器，還有待進(jìn)一步確認(rèn)。本研究為提高釀酒酵母工程菌產(chǎn)萜類化合物提供了新的策略。

3 結(jié)論

本研究觀察到BCL-2和GSH1基因的表達(dá)對(duì)工程釀酒酵母產(chǎn)橙花叔醇有促進(jìn)效果，并進(jìn)一步通過代謝組分析對(duì)BCL-2蛋白的作用機(jī)制進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)BCL-2蛋白的表達(dá)影響菌株氨基酸和脂肪酸的代謝，并與泛酸和輔酶A的生物合成途徑有關(guān)。另外，對(duì)連接不同定位信號(hào)肽的BCL-2蛋白對(duì)工程菌橙花叔醇合成的影響進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)BCL-2蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位肽連接時(shí)對(duì)橙花叔醇產(chǎn)量的促進(jìn)作用最大，為解釋其作用機(jī)制提供了有力支持。本研究對(duì)提高釀酒酵母工程菌異源生產(chǎn)萜類化合物提供了一個(gè)新的策略。