史玉，黃一承，曾承，楊定寬，王玉超，李曉磊，李丹

(長(zhǎng)春大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工吉林省普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130022)

黑蒜又稱黑大蒜、發(fā)酵黑蒜、黑蒜頭，是將新鮮生蒜置于高溫、高濕的環(huán)境中自然發(fā)酵一定時(shí)間而制得的新型蒜制品[1]。黑蒜沒(méi)有新鮮生蒜的刺激性辛辣味，且酸甜適口、口感軟糯[2]?，F(xiàn)代研究表明，黑蒜中含有多糖類、多酚類、生物堿、黃酮類、游離氨基酸類、含硫化合物等成分，具有抗腫瘤、抗氧化、殺菌消炎、調(diào)節(jié)血糖、提高免疫力等作用[3-6]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外以黑蒜為原料的保健品、功能食品逐漸受到人們的喜愛(ài)。

食醋是通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的傳統(tǒng)酸味液態(tài)調(diào)味品，多由糯米、高粱、大米、玉米、小麥以及糖類和酒類發(fā)酵而成，含有多種有機(jī)酸、川穹嗪等營(yíng)養(yǎng)成分，具有增強(qiáng)食欲、促進(jìn)消化、降血脂等功效[7-8]。黑蒜醋是以黑蒜為原料，經(jīng)熬制榨汁、酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵等工藝制成的口感獨(dú)特、氣味濃厚的液態(tài)調(diào)味品，對(duì)腸胃和心腦血管疾病的預(yù)防具有顯著作用，具有廣闊的發(fā)展前景。目前對(duì)黑蒜醋的研究主要在釀造工藝研發(fā)階段[9-10]，對(duì)黑蒜醋風(fēng)味和有機(jī)酸成分的分析甚少。

本研究應(yīng)用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)和高效液相色譜技術(shù)(high performance liquid chromatography,HPLC)對(duì)3種不同產(chǎn)地黑蒜醋的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和有機(jī)酸組成及含量進(jìn)行分析檢測(cè)，并進(jìn)行相對(duì)氣味活度值分析，以期為黑蒜醋的呈味物質(zhì)檢測(cè)和評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市場(chǎng)購(gòu)買的3種黑蒜醋，產(chǎn)地分別為山東菏澤(產(chǎn)品A)、山東聊城(產(chǎn)品B)、山東煙臺(tái)(產(chǎn)品C)、氯化鈉(化學(xué)純)：上海Aladdin公司；亞鐵氰化鉀(分析純)：沈陽(yáng)試劑三廠；硫酸鋅(分析純)：北京化工廠；乙酸、乳酸、蘋果酸、草酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸和馬來(lái)酸標(biāo)準(zhǔn)品：均為色譜純，美國(guó)Sigma公司。

0.22 μm疏水式針式過(guò)濾器 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；15 mL頂空進(jìn)樣瓶、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭 美國(guó)Supelco公司；DB-5MS UI毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國(guó)Agilent公司；Acclaim OA色譜柱(4.0 mm×250 mm×5 μm) 美國(guó)Thermo Fisher公司；QP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本Shimadzu公司；Centrifuge 5430離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；P680A LPJ-4高效液相色譜儀 德國(guó)Dionex公司。

1.2 方法

1.2.1 SPME-GC-MC分析

取0.50 mL黑蒜醋樣品、1.50 mL蒸餾水和1.00 g氯化鈉于15 mL頂空瓶中，并加入磁力攪拌子，密封置于200 r/min的磁力攪拌器上，每次萃取前60 ℃預(yù)平衡20 min。

SPME條件：用已老化好的萃取頭頂空吸附60 min，然后將萃取頭拔出頂空瓶并迅速插入GC進(jìn)樣口解吸5 min，同時(shí)啟動(dòng)升溫程序。

GC條件：進(jìn)樣口溫度為250 ℃，分流比為1∶5，5 min后吹掃流量為20 mL/min；載氣為He，柱流量為1.0 mL/min；程序升溫條件：初始柱溫40 ℃，保持5 min，以2 ℃/min的速率升至50 ℃，保持1 min；以4 ℃/min的速率升至120 ℃，保持1 min；以2 ℃/min的速率升至140 ℃，保持2 min后再以4 ℃/min的速率升至250 ℃，保持4 min。

MS條件：電子電離源，離子源溫度230 ℃；GC-MS接口溫度280 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍(m/z)35～600，全掃描模式。

1.2.2 ROAV的計(jì)算

為了快速篩選出所檢測(cè)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中氣味活度值最高的若干種物質(zhì)，劉登勇等[11]定義了一個(gè)新參數(shù)：相對(duì)氣味活度值(relative odor activity value，ROAV)。用ROAV對(duì)黑蒜醋中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)貢獻(xiàn)進(jìn)行量化，以確定關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。使對(duì)黑蒜醋氣味貢獻(xiàn)最大的物質(zhì)的ROAV為100，對(duì)其他風(fēng)味物質(zhì)的ROAV按下式計(jì)算：

式中：C%i和C%max分別為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和對(duì)樣品總體揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的相對(duì)含量(%)；Ti和Tmax分別為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和對(duì)樣品總體揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的感覺(jué)閾值(μg/L)。 ROAV越大的物質(zhì)對(duì)樣品總體揮發(fā)性風(fēng)味的貢獻(xiàn)作用越大：100≥ROAV≥1的組分為樣品中的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；1>ROAV≥0.1的組分為總體揮發(fā)性風(fēng)味的修飾物質(zhì)；0.1>ROAV的組分認(rèn)為對(duì)總體揮發(fā)性風(fēng)味無(wú)貢獻(xiàn)。

1.2.3 有機(jī)酸含量的測(cè)定

分別取4.00 mL樣品，加入4.00 mL 10.6%亞鐵氰化鉀和4.00 mL 30%硫酸鋅溶液，用蒸餾水定容到40 mL，置于6000 r/min的離心機(jī)中離心6 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

HPLC條件：流動(dòng)相：100 mmol/L Na2SO4(pH 2.65)；檢測(cè)波長(zhǎng)：UV 210 nm；流速：0.50 mL/min；進(jìn)樣量：5.00 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地黑蒜醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

對(duì)3種黑蒜醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 3種黑蒜醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)色譜圖Fig.1 The chromatograms of volatile flavor compounds in three kinds of black garlic vinegar

表1 3種黑蒜醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)SPME-GC-MS分析結(jié)果Table 1 SPME-GC-MS analysis results of volatile flavor compounds in three kinds of black garlic vinegar

續(xù) 表

采用保留指數(shù)和NIST 11標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索對(duì)比定性分析，保留與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)相似度大于80%的化合物。由表1可知，共鑒定出53種揮發(fā)性物質(zhì)，其中包括酸類8種、酯類17 種、醇類10種、醛類8種、酮類4種、酚類3種、雜環(huán)類2種和醚類1 種。3種黑蒜醋的揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量分別為33種(產(chǎn)品A)、34種(產(chǎn)品B)、26種(產(chǎn)品C)。

酸味從味覺(jué)上和嗅覺(jué)上都是醋類產(chǎn)品最直觀的味道，也是影響醋類產(chǎn)品風(fēng)味和品質(zhì)的重要化合物[12]。由表1可知，3種黑蒜醋樣品中共檢測(cè)出8種酸類風(fēng)味物質(zhì)，其中乙酸、山梨酸、苯甲酸是共有的揮發(fā)性成分。山梨酸在產(chǎn)品B和C所有揮發(fā)性物質(zhì)中相對(duì)含量最高，為35.87%～35.89%，苯甲酸在產(chǎn)品A中含量最高，為23.95%，這兩種酸可能是作為食品防腐劑在生產(chǎn)工藝中添加到產(chǎn)品中的；乙酸相對(duì)含量少于18%，但乙酸的閾值也低，對(duì)于產(chǎn)品風(fēng)味的影響較大[13]。其余脂肪酸可以增加黑蒜醋風(fēng)味的復(fù)雜性。這些酸類風(fēng)味物質(zhì)在黑蒜醋中互相作用影響，從而賦予了3種黑蒜醋獨(dú)特的酸味。

酯類物質(zhì)對(duì)醋的揮發(fā)性風(fēng)味有重要影響，多數(shù)產(chǎn)生于醋的發(fā)酵階段，具有花果的清香或蜂蜜的甜香，是評(píng)價(jià)醋類產(chǎn)品的重要指標(biāo)[14]。由表1可知，3種黑蒜醋中共檢測(cè)出17 種酯類揮發(fā)性物質(zhì)，產(chǎn)品A中酯類揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量最高，為33.03%；產(chǎn)品B中酯類揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量最多，為13種。乙酸乙酯在產(chǎn)品A和C酯類揮發(fā)性物質(zhì)中相對(duì)含量最高，為14.75%～21.44%，在較低濃度下也可以增加醋的香氣[15]。不同酯類揮發(fā)性物質(zhì)為黑蒜醋貢獻(xiàn)不同的香氣成分。

醛酮類揮發(fā)性物質(zhì)中糠醛、5-羥甲基糠醛、苯甲醛、苯乙醛和橙化基丙酮是共有的揮發(fā)性成分。酮類物質(zhì)是經(jīng)過(guò)微生物氧化、氨基酸降解以及不飽和脂肪酸的熱氧化分解而產(chǎn)生的。通過(guò)微生物發(fā)酵或氨基酸降解產(chǎn)生的具有花香和水果香味的醛類物質(zhì)可以提高醋的品質(zhì)[16]。美拉德反應(yīng)使戊糖降解形成糠醛[17]，5-甲基糠醛是類黑精形成的中間產(chǎn)物，也是黑蒜醋在發(fā)酵過(guò)程中經(jīng)歷美拉德反應(yīng)所產(chǎn)生的[18]，為食醋增香調(diào)色，但過(guò)量的糠醛和5-甲基糠醛對(duì)于身體健康會(huì)有不良作用[19]。苯甲醛廣泛存在于植物中。

黑蒜醋中還含有醇酚類、雜環(huán)類、醚類等揮發(fā)性物質(zhì)。醇酚類揮發(fā)性物質(zhì)中苯乙醇是共有的，也是相對(duì)含量最高的揮發(fā)性成分，是由酵母菌代謝產(chǎn)生的或在蛋白質(zhì)水解過(guò)程中由氨基酸脫羧形成的[20]；檢測(cè)出的3種揮發(fā)性酚類物質(zhì)相對(duì)含量均較低，可能來(lái)自黑蒜本身或醋酸發(fā)酵過(guò)程由酚酸降解產(chǎn)生[21]。川穹嗪和2,3,5-三甲基吡嗪雜環(huán)類揮發(fā)性物質(zhì)是從產(chǎn)品B中檢測(cè)出的，是伴隨著美拉德反應(yīng)生成的，對(duì)醋的風(fēng)味有著重要影響[22]。醚類揮發(fā)性物質(zhì)是從產(chǎn)品A中檢測(cè)出的，是黑蒜醋的重要特征性風(fēng)味。這些化合物相互作用賦予了3種黑蒜醋獨(dú)特的風(fēng)味。

2.2 ROAV分析

表2 3種黑蒜醋R(shí)OAV及氣味描述Table 2 The relative odor activity values and odor description of three kinds of black garlic vinegar

續(xù) 表

續(xù) 表

在對(duì)3種黑蒜醋各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定性分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合表1中各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)離子峰面積比，以ROAV為參數(shù)，確定3種黑蒜醋中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。由表2可知，根據(jù)現(xiàn)已查到的閾值計(jì)算得出產(chǎn)品A，B，C中100≥ROAV≥1的組分各有11，7，8種；1>ROAV≥0.1的組分各有3，10，1種；0.1>ROAV的組分均為1種。

由表2可知，主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為酸類、酯類和醛類。乙酸是產(chǎn)品A和C中總體揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的物質(zhì)；美拉德反應(yīng)使戊糖降解形成的糠醛是產(chǎn)品B中總體揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的物質(zhì)。對(duì)產(chǎn)品A，B，C總體揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的酯類主要為γ-壬內(nèi)酯。除此之外，產(chǎn)品A的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)還有乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、異戊醇、苯甲醇、苯乙醇、苯乙醛、3-羥基-2-丁酮；產(chǎn)品B的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)還有己酸乙酯、苯乙醇、3-羥基-2-丁酮、川芎嗪；產(chǎn)品C的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)還有乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇、正壬醇、苯乙醛。辛酸乙酯和癸酸乙酯是產(chǎn)品A和B的揮發(fā)性風(fēng)味的重要修飾物質(zhì)；具有苦杏仁味的苯甲醛是產(chǎn)品A，B，C的揮發(fā)性風(fēng)味的重要修飾物質(zhì)。

2.3 不同產(chǎn)地黑蒜醋有機(jī)酸含量分析

對(duì)3種不同產(chǎn)地黑蒜醋有機(jī)酸含量進(jìn)行分析，與標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸混合溶液對(duì)照，產(chǎn)品A和B有9種有機(jī)酸，產(chǎn)品C有5種有機(jī)酸，見(jiàn)表3。

表3 3種黑蒜醋有機(jī)酸HPLC分析結(jié)果Table 3 The analysis of organic acids in three kinds of black garlic vinegar by HPLC g/L

由表3可知，產(chǎn)品A，B，C除乙酸外，還含有乳酸、草酸、檸檬酸等不揮發(fā)性酸。醋中大部分不揮發(fā)酸的沸點(diǎn)較高、黏性較大，可以降低醋中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的揮發(fā)速度，緩沖乙酸的刺激性氣味[26]。產(chǎn)品A和B中乙酸、乳酸、蘋果酸的含量相對(duì)較高，是主要呈味有機(jī)酸。產(chǎn)品C與產(chǎn)品A和B存在明顯差異，乙酸含量為43.82 g/L，較產(chǎn)品A和B高10.31～19.79 g/L，其余有機(jī)酸含量均低于產(chǎn)品A和B。產(chǎn)品A中蘋果酸含量較乳酸含量高3.77 g/L，可能與發(fā)酵過(guò)程中總酸含量有關(guān)[27]。產(chǎn)品B中檸檬酸含量較產(chǎn)品A和C高1.85～1.99 g/L，可能是發(fā)酵過(guò)程易于積累檸檬酸。3種黑蒜醋中不揮發(fā)性酸的種類和含量不同，與生產(chǎn)過(guò)程中不同的原料和發(fā)酵工藝有關(guān)[28]，這些有機(jī)酸共同決定了黑蒜醋的酸味質(zhì)量。

3 結(jié)論

3種黑蒜醋共鑒定出53種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酸類8種、酯類17種、醇類10種、醛類8種、酮類4種、酚類3種、雜環(huán)類2種和醚類1 種；其中共有的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有乙酸、糠醛、γ-壬內(nèi)酯和苯乙醇，共有的有機(jī)酸有乙酸、乳酸。二烯丙基二硫醚是產(chǎn)品A的重要特征風(fēng)味物質(zhì)；烘烤味的吡嗪類物質(zhì)是產(chǎn)品B的重要特征風(fēng)味物質(zhì)；乙酸在產(chǎn)品C中含量最高，為43.82 g/L。

3種黑蒜醋各自獨(dú)特的發(fā)酵工藝使得呈味物質(zhì)組成有所差異。從總體比較來(lái)看，產(chǎn)品A和B不論是從揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)還是有機(jī)酸的組成及含量上來(lái)看均高于產(chǎn)品C。產(chǎn)品A中測(cè)得的二烯丙基二硫醚有明顯的蒜香味，且蘋果酸濃度較大；產(chǎn)品B中測(cè)得有烘烤味的吡嗪類物質(zhì)，且乳酸濃度較大；產(chǎn)品C中測(cè)得的正壬醇有橙香味，且乙酸濃度最高。