劉慧勤，譚玉瑩，黃炯麗，湯星月，吳建文，李秋庭*

(1.廣西大學 輕工與食品工程學院，南寧 530004；2.廣西林業(yè)科學院，南寧 530002)

八角主產(chǎn)于我國西南部，是重要的木本科香料，廣泛應用于食品調味、中藥材等，也是提取茴香腦和莽草酸的主要原料[1-3]。2012年廣西八角年產(chǎn)量約20萬噸，占世界八角年產(chǎn)量的85%左右，八角籽占整果質量的20%左右[4]。八角作為一種藥食同源的香辛料，其獨特的氣味在烹飪過程中起到去腥味、賦予食物多重香氣的作用[5]。八角籽含有豐富的油脂及與八角殼相似的揮發(fā)性成分，在八角采摘、殺青、晾曬及干燥的過程中自行脫落，脫落后的八角籽一般被丟棄或當作肥料，造成了很大的資源浪費[6]。本文利用HS-SPME-GC-MS對冷榨、熱榨及索氏提取八角籽油中的揮發(fā)性成分進行分析，采用面積歸一化法計算每種揮發(fā)性成分的百分含量，然后將3種提取方式的油脂揮發(fā)性成分與八角精油進行對比，得出3種油脂中揮發(fā)性成分與八角精油中揮發(fā)性成分的差異。采用內標法對每種揮發(fā)性成分進行定量分析，結合氣味閾值計算出每種揮發(fā)性成分的氣味活性值(OAV)，以期得出不同八角籽油香氣成分的含量差異、特征香氣成分及對整體香氣起主導作用的物質。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

CP-SAO：將分離好的八角籽經(jīng)粉碎，利用小型液冷榨油機對其進行冷榨，過濾后于4 ℃保存。

HP-SAO：將分離好的八角籽在130 ℃條件下炒籽15 min，利用小型中藥粉碎機對其進行粉碎，液壓榨油機進行壓榨，過濾后于4 ℃保存。

SE-SAO：將八角籽粉碎至30目，置于索氏抽提裝置，石油醚(60～90 ℃)于85 ℃下提取，回流7 h，回收溶劑后于4 ℃保存。

EO：八角果粉碎后，置于水蒸氣蒸餾裝置中，蒸餾2 h，水油分離后將精油部分于4 ℃保存。

1.2 實驗試劑

環(huán)己醇、C7-C40正構烷烴：均購于上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 實驗儀器

萃取頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS、萃取手柄 上海安譜實驗科技股份有限公司；7890B型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市朗博儀器制造有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 HS-SPME-GC-MS分析八角籽油揮發(fā)性成分

以峰面積和總峰數(shù)為依據(jù)進行前期實驗研究，確定最佳萃取條件：(3±0.01) g油樣于20 mL帶有四氟乙烯墊片的頂空進樣瓶中，添加3 μL環(huán)己醇作為內標。老化后的萃取頭(老化溫度260 ℃、時間40 min)插入60 ℃條件下平衡15 min的頂空進樣瓶中，推出萃取纖維頭，萃取30 min，將萃取頭推進進樣口進行解吸，解吸溫度為250 ℃，時間為5 min。

氣質聯(lián)用儀器條件：色譜柱為DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.15 μm)，進樣口溫度250 ℃；流速1.0 mL/min；柱溫升溫程序：初始溫度為40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min升至120 ℃，再以8 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min。

質譜條件：EI離子源，電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍30～550 m/z。

1.4.2 定性及定量方法

定性方法：譜庫檢索和保留指數(shù)(retention index，RI)相結合進行定性。以美國國家標準與技術研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)14 質譜庫檢索進行對比，并要求匹配度達到80%以上。RI是以C7-C40正構烷烴混合標準溶液，并采用和樣品相同的GC-MS條件，根據(jù)保留時間計算樣品中化合物的保留指數(shù)，并與NIST Chemistry WebBook中相同色譜柱的同種物質的保留指數(shù)進行對比確認。保留指數(shù)計算公式如下：

(1)

式中：TX為化合物X的保留時間，Z和Z+1分別為化合物X出峰前后相鄰正構烷烴標準品的碳原子數(shù)，TZ與TZ+1分別為Z和Z+1位碳原子對應正構烷烴的保留時間。

定量方法：面積歸一化法、內標法，內標法定量計算公式如下：

(2)

式中：Mi為目標物的質量濃度(mg/kg)，V為內標物質的體積(μL)，P為內標物的密度(0.9624 g/mL)，St為目標化合物的峰面積，Si為內標物的峰面積，Mo為八角油脂質量(g)。

1.4.3 氣味活性值(OAV)計算

OAV為化合物質量濃度與嗅覺閾值的比，一般用OAV表示呈香物質對總體香氣的貢獻大小，OAV大于1，表示該物質對總體香氣的貢獻較大，而當OAV小于1時則表示該物質對總體香氣無實質性貢獻[7]。某物質的OAV越大則該物質對總體香氣的貢獻越大。本文結合八角油中各成分的濃度及某種物質在水中的閾值(mg/kg)，計算出每種呈香物質的OAV，進而得出不同提取方式的八角籽油中的特征香氣成分。計算公式如下：

(3)

式中：Ct為樣品中香氣成分的質量濃度，Co為該香氣成分在水中的閾值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對所有實驗結果采用SPSS 24軟件進行單因素方差分析，結果均以平均值±標準差表示，采用Origin 2019作圖，SAMIC 14進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 八角油脂與八角精油揮發(fā)性成分對比分析

經(jīng)過GC-MS得出八角籽油和八角精油的色譜圖，見圖1。3種不同提取方式所得八角籽油和八角精油的揮發(fā)性成分百分含量見表1。分析鑒定出3種不同提取方式所得八角籽油中揮發(fā)性成分共91種，其中CP-SAO中鑒定出揮發(fā)性成分58種，HP-SAO鑒定出揮發(fā)性成分71種，SE-SAO中鑒定出揮發(fā)性成分59種，共有成分38種，分別為α-蒎烯、莰烯、正己醛、反式茴香腦和草蒿腦等，主要為芳香族和萜烯類物質。CP-SAO中芳香族物質19種，占總化合物的82.231%；單萜類物質22種，占總化合物的12.65%。CP-SAO中含量最高的物質為反式茴香腦，其次為草蒿腦、大茴香醛等；單萜類物質中含量最高的為檸檬烯，其次是芳樟醇、檜烯、4-萜烯醇等。HP-SAO中芳香族物質21種，占總化合物的74.98%；單萜類物質22種，占總化合物的20.7%；此外，還含有吡嗪、吡咯、呋喃類化合物，占總化合物的1.67%。HP-SAO中芳香族化合物含量最高的物質為反式茴香腦，其次為草蒿腦、大茴香醛等；單萜類物質中含量最高的為檸檬烯，其次為芳樟醇、檜烯等。雜環(huán)類中含量最高的為吡喃酮，其次為3-乙基-2，5-二甲基吡嗪、2-乙?；量E-SAO中主要含有的物質為芳香族、單萜類及烷烴類。其中芳香族物質24種，占總化合物含量的83.64%；單萜類物質12種，占總化合物含量的10.95%；烷烴類物質9種，占總化合物含量的2.68%。SE-SAO中芳香族化合物含量最多的為反式茴香腦，其次為草蒿腦、大茴香醛；單萜類物質含量最多的芳樟醇，其次為檸檬烯、檜烯；烷烴類物質中含量最高的2-甲基-十一烷、5-甲基-十一烷、4-甲基-十一烷。EO中芳香族化合物有20種，占總化合物含量的49.84%；單萜類物質有27種，占總化合物含量的44.22%。芳香族化合物中含量最高的物質為反式茴香腦，其次為草蒿腦和大茴香醛。單萜類物質中含量最高的為檸檬烯，其次為芳樟醇和α-蒎烯。

圖1 3種八角籽油與八角精油色譜圖Fig.1 The chromatograms of three kinds of star anise seeds oil and star anise essential oil

3種油樣中共有33種，主要成分都為反式茴香腦、草蒿腦、芳樟醇、檸檬烯。EO中主要成分為反式茴香腦、檸檬烯、草蒿腦和芳樟醇。所以油脂中主要成分和精油的主要成分一樣，但精油中單萜類物質含量多于油脂。

3種不同方式提取的八角油中揮發(fā)性物質具有一定的差異，HP-SAO、CP-SAO中共有成分最多，為50種，且與精油的共有成分一樣(40種)。CP-SAO與HP-SAO中共有成分百分含量差異較小。HP-SAO還含有多種雜環(huán)等物質，這些物質應該是在高溫炒籽過程中，八角籽中的蛋白質和糖類物質發(fā)生美拉德反應而產(chǎn)生的。SE-SAO中與EO中共有成分較少，且具有多種烷烴類物質，因此猜測烷烴類物質較多可能是因為烷烴類和石油醚相似相溶原理，單萜類物質明顯較CP-SAO和HP-SAO中含量少，可能是因為SE-SAO中引入了過多的烷烴類物質，且這些烷烴類物質的出峰時間和單萜類物質的出峰時間比較接近，因此對GC-MS進行分離鑒定時掩蓋了單萜類物質，或者是在溶劑回收過程中，真空高溫(70 ℃)的條件使易揮發(fā)的單萜類物質隨溶劑一起揮發(fā)的原因。

表1 八角籽油揮發(fā)性成分百分比含量表

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

2.2 揮發(fā)性成分主成分分析

主成分分析是利用降維的方法將多個指標轉化為少數(shù)綜合性指標，這些綜合性指標盡可能多地表達原有指標的信息，且保留了原指標的大部分信息，比單一評價更準確方便，避免性狀間的相關性對評價結果的影響[8]。已經(jīng)廣泛應用于蔬果、藥材等品質指標的篩選和綜合評價研究[9]。雙標圖將載荷圖和得分圖結合到一個圖形中，能夠很直觀地反映變量與變量、樣本與樣本、變量與樣本之間的關系[10]。成分與樣品的空間距離的大小表示物質成分影響的大小，樣品間的空間距離遠近反映樣品間的差異。SAO中揮發(fā)性成分和EO的揮發(fā)性成分主成分分析雙標圖見圖2，SAO與EO能夠分離開，且在雙標圖上的距離較遠，由此可以說明EO和SAO的揮發(fā)性成分差異較大。EO與CP-SAO的距離最短，其次為HP-SAO、SE-SAO，說明CP-SAO和EO的揮發(fā)性成分最接近，其次是HP-SAO、SE-SAO。CP-SAO、HP-SAO和SE-SAO也能夠分離開，CP-SAO和HP-SAO間的距離最近，HP-SAO和SE-SAO的距離最遠，表示CP-SAO和HP-SAO的揮發(fā)性成分最為接近，HP-SAO和SE-SAO的揮發(fā)性成分相差最大。圖2中每種物質的序號與表1相對應，由此可以看出對CP-SAO影響最大的成分為β-松油烯和肉桂醇，對HP-SAO影響最大的成分為4-羥基丁酸乙酯、苯乙醛、E-4.8-二甲基-1,3,7-三烯、2-乙基-5-甲基吡嗪、D-蓽澄茄烯等，對SE-SAO影響最大的物質主要為2,6-二甲基癸烷、2-甲基十一烷、2-甲基癸烷等烷烴類物質，對EO影響最大的物質為β-蒎烯、左旋樟腦、反式-p薄荷-2-烯-1-醇、β-法尼烯等物質。

圖2 八角籽油揮發(fā)性成分主成分析雙標圖Fig.2 Principal component analysis dual plot of volatile components in star anise seeds oil

八角籽油和八角精油的揮發(fā)性成分的主成分分析的特征值和貢獻率見表2，本實驗根據(jù)累積貢獻率不低于85%及特征值>1的原則[11]，明確了前3個主成分，其累積貢獻率達94.6%，包含了原始數(shù)據(jù)的大部分信息，可代表八角籽油及八角精油揮發(fā)性成分。第一主成分的方差貢獻率為48.7%，其中貢獻最大的是葑烯，其次為(+)3-蒈烯、α-水芹烯等單萜烯類物質。第二主成分的方差貢獻率為33.9%，貢獻最大的是2-甲基-環(huán)戊醇，其次為順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、甲基庚烯酮類、β-羅勒烯等芳香族類及倍半萜類物質。第三主成分的方差貢獻率為12.0%，貢獻最大的為2-乙?；量?，其次為2-乙基-5-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪等雜環(huán)類物質。

表2 主成分的特征值、貢獻率和累計貢獻率

2.3 八角籽油中香氣成分含量分析

閾值對于食品香氣分析研究十分重要，閾值越低表明該物質越容易被嗅聞到，相反，閾值越高則表明該物質越不容易被人鼻捕捉[12]。根據(jù)Guadagni氣味活度值理論，物質濃度高的不一定對整體香氣貢獻大，而有些物質雖然物質濃度低，但對整體香氣的貢獻卻較大，一般認為OAV大于1的揮發(fā)性物質對香氣具有貢獻，被稱為特征香氣成分，OAV越大則對香氣的貢獻越大[13]。參考文獻[14]確定了55種香氣物質的OAV值。CP-SAO中有39種呈香物質的OAV>1，因此這39種物質被稱為特征香氣成分，其中110000的物質有4種，為呈茴香、甘草辛香味的反式茴香腦，具有花香、木香的芳樟醇，類似茴香味的草蒿腦和具有清涼、樟腦味的桉葉油醇。這4種物質對CP-SAO的整體香氣起主導作用，而其他呈香物質對CP-SAO整體香氣起修飾作用[15]。HP-SAO中，有47種呈香物質，其中特征香氣成分有43種，110000的物質有6種，分別是具有甘草、茴香辛香味的反式茴香腦，具有花香和木香的芳樟醇，具有類似大茴香味的草蒿腦，具有風信子味的苯乙醛，具有花生及堅果烤香味的3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪，具有清涼味的桉葉油醇。SE-SAO中呈香物質有30種。特征香氣成分有28種，110000對總體香氣起主導作用的物質分別是有甘草、茴香辛香味的反式茴香腦，類似茴香味的草蒿腦，有花香木香的芳樟醇，有清涼樟腦味的桉葉油醇和具有花香刺激茴香味的大茴香醛等5種物質。

3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪、苯乙醛雖然在HP-SAO中含量較少，但因其OAV值較高，使HP-SAO具有獨特烤香氣。不同提取方式所得其八角籽油的特征香氣成分與主導香氣成分存在一定的差異，HP-SAO中特征香氣成分最多，香味最為豐富，不僅具有八角味，而且具有獨特的烤花生堅果香味，SE-SAO中特征成分最少，與CP-SAO與HP-SAO相比，單萜類物質分別少了286.439 mg/kg和221.57 mg/kg，而芳香族類化合物多了819.304 mg/kg和1619.234 mg/kg，SE-SAO中對整體香氣起到修飾作用的物質較少，整體香氣以芳香族的反式茴香腦(茴香味)、草蒿腦(類似茴香味)和大茴香醛(花香、茴香)的香氣貢獻為主，香氣比較單一。CP-SAO中單萜類物質最多，因此整體香氣與八角精油比較接近。

八角籽油香氣成分、氣味描述、氣味閾值及香氣活性值見表3。

表 3 八角籽油香氣成分、氣味描述、氣味閾值及香氣活性值

續(xù) 表

3 結論

3種不同方式提取的八角油中揮發(fā)性物質具有一定的差異，HP-SAO、CP-SAO與EO相同成分較多，且CP-SAO與HP-SAO中的共有成分百分含量差異性較小。HP-SAO除那些共有成分外，還含有多種具有烤香味的吡嗪、吡喃、吡咯等物質，這些物質應該是在炒制的高溫過程中，八角籽中的蛋白質和糖類物質發(fā)生美拉德反應而產(chǎn)生的。SE-SAO中與EO中共有成分較少，且具有多種烷烴類物質，因此猜測烷烴類物質較多可能是因為烷烴類和石油醚相似相溶原理。SE-SAO中單萜類物質少于HP-SAO和CP-SAO，可能是因為SE-SAO中引入了過多的烷烴類物質，因此對GC-MS進行分離鑒定時掩蓋了含量較少的非揮發(fā)性氣味成分。苯乙醛和3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪為HP-SAO的焙烤堅果味的主要來源。HP-SAO的整體香氣最為豐富，不僅含有較多和八角精油相似的呈香物質，而且含有苯乙醛、3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪等多種美拉德反應后產(chǎn)生的具有堅果烤香味的物質。CP-SAO與EO的香氣比較接近。